Un método de alternante a la modelo tradicional de la NASA Miembro Posterior descarga en ratones
10 de marzo de 2011
Hemos desarrollado una extremidad posterior alternante descarga modelo en ratones. La principal ventaja de nuestro miembro posterior descarga de cola de anillo sobre el método convencional de Morey-Holton cola de tracción técnica es un procedimiento simple y directo que reduce el estrés en el animal.
El objetivo general de este procedimiento es realizar la descarga de las extremidades posteriores, o hu, en ratones mediante un método más sencillo y directo que minimice el estrés para el animal. Este método de cola induce con éxito la atrofia de las extremidades posteriores sin comprometer la salud general ni el peso corporal. El primer paso consiste en implantar un anillo en la cola de un ratón adulto.
Es importante que el peso corporal y las observaciones de salud se registren durante todo el estudio. Luego, se ensambla el aparato de suspensión de las extremidades posteriores y se coloca dentro de una jaula donde tendrá lugar la suspensión. Una vez que el animal se ha recuperado, se coloca en el aparato para el procedimiento de suspensión.
Finalmente, se pueden obtener resultados mediante mediciones tanto de la masa corporal como de la masa muscular que mostraron atrofia muscular en las extremidades traseras de los ratones descargados. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la técnica de enmascarado de Maori Holton, es que la piel de la cola siempre es visible. Los ratones no pueden salir del aparato de suspensión ni jugar con el anillo, y se recuperan más rápido y mantienen un peso corporal estable.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la fisiología musculoesquelética, así como en la biología gravitacional y espacial, como por ejemplo cómo prevenir la atrofia muscular esquelética y la pérdida ósea tras períodos prolongados de inactividad física, reposo en cama, inmovilización de extremidades, microgravedad, enfermedades neuromusculares y con el envejecimiento progresivo. Tuvimos esta idea por primera vez cuando experimentamos complicaciones con la técnica de sujeción de la cola de Maury Holden. Perdimos consistentemente animales y datos experimentales debido a que los ratones escapaban del dispositivo de las extremidades traseras durante la demostración de esta técnica.
Hoy están Andre Ferrara, investigador asociado sénior de mi laboratorio, y en asistencia Andrés Jacqueline Chrissy, una estudiante doctoral en el laboratorio, y Andrew Dunn, un estudiante universitario también en el laboratorio. Comience por esterilizar el área quirúrgica, anestesiar al ratón adulto con isoflurano y luego registre el peso del ratón y colóquelo sobre una almohadilla calefactora. Prepare la cola para la cirugía frotando con solución de clorhexidina.
Comience a contar desde el extremo del vello corporal en la base de la cola para localizar el espacio intervertebral quinto, sexto o séptimo entre dos protuberancias óseas de la cola. Utilice un hemostato y una aguja 20 5G para hacer un orificio piloto entre dos vértebras, accediendo al espacio intervertebral. Retire la aguja e inserte una sutura de acero.
Corte hasta una longitud de 10 centímetros a través del orificio. Deben sobresalir cinco centímetros de sutura a cada lado de la cola. Coloque la punta del pulgar sobre la cola y use su otra mano para enrollar la sutura de acero alrededor del pulgar.
Gire los extremos para formar un bucle grande. La parte enrollada o circular debe tener aproximadamente tres milímetros de longitud. Sujete un filamento de la sutura con una pinza hemostática y dóblelo para formar un bucle más pequeño, cuyo extremo se fija lo más cerca posible del giro en el bucle grande original.
Corte el exceso de alambre y doble hacia atrás el alambre torcido. Detenga cualquier sangrado excesivo con bastoncillos de nitrato de plata. Permita que el animal se recupere durante cinco a siete días antes de la descarga de las extremidades posteriores o hu después de la cirugía.
Coloque cada casa de manera individual para evitar que los anillos de la cola se enreden. Coloque una barra de acero ranurado enchapada de un espesor de tres octavos de pulgada y un grosor de un pulgada sobre la parte superior de la jaula y sujétela con cinta adhesiva. Añada otra arandela y una tuerca mariposa, pero no las apriete completamente para permitir ajustes posteriores.
Inserte el tornillo máquina a través del orificio central del bobin para evitar que este se caiga. Enrosque una tuerca de seguridad de nailon en el extremo del tornillo máquina. El bobin debe girar libremente.
Inserte el gancho de cierre de un mosquetón de pesca a través de la parte inferior del carrete. Utilice alicates para formar un gancho en forma de S a partir de un clip. Inserte un extremo del gancho en forma de S a través del orificio del mosquetón de pesca y ciérrelo presionándolo con los alicates.
Coloque un alambre en forma de U paralelo al tornillo máquina en el interior de la jaula y doble los extremos sobre el lateral. Para soportar una botella completa de agua, inserte una botella de agua en el alambre en forma de U con la boquilla orientada hacia abajo, pero sin tocar el fondo. Sujete la botella de agua a la jaula con cinta adhesiva resistente.
Abra una pinza de carpeta de dos pulgadas, dejando suficiente tensión para sostener algunas piezas de alimento sin aplastar los gránulos antes del procedimiento de descarga de las extremidades posteriores. Registre el peso del ratón para utilizarlo en comparaciones. Posteriormente, inserte el extremo abierto del gancho en forma de S a través del anillo más pequeño que sobresale de la cola.
Ajuste la altura del ratón apretando o aflojando la tuerca alada inferior en el tornillo de la máquina. Las extremidades inferiores no deben soportar peso. Una vez alcanzada la altura óptima, apriete la tuerca alada superior y coloque nuevamente la botella de agua con un alambre de forma nueva para que el ratón no pueda trepar hasta la boquilla con sus miembros posteriores.
Para medir el consumo de alimento durante el estudio, pese los pellets antes de colocarlos en la pinza sujetadora. Proporcione aproximadamente de ocho a 10 gramos para permitir el consumo de unos cinco a seis gramos de alimento por día. Por cada posición de ratón, coloque la pinza sujetadora con alimento en la parte inferior de la jaula de modo que el ratón no pueda trepar sobre ella, y sujétela con cinta adhesiva resistente.
Usando dos pulgadas por dos pulgadas de pelos de cola de animal (Gores) de forma suelta. Envuelva la cola alrededor del mosquetón giratorio. Envuelva un pequeño trozo de cola alrededor de los pelos de cola (Gores), asegurando los pelos de cola (Gores) a la cola.
Este paso es importante para evitar que la cola cuelgue hacia abajo, lo que provocaría la acumulación de sangre en la punta y la necrosis de la cola. Repita el mismo procedimiento con un animal adicional en el otro lado de la jaula. Al alojar dos animales por jaula, colóquelos de manera que casi puedan tocarse entre sí.
En el centro de la jaula. Añado una pequeña cantidad de cama de cob a la jaula, asegurándome de que no haya suficiente para que el ratón pueda usarla y formar un montículo. Después del procedimiento de suspensión de las extremidades posteriores, retire al animal del aparato y retire el anillo de la cola.
Utilizando un cortador de alambre, registre el peso corporal y devuelva el animal a su jaula de alojamiento para la recuperación. Después de un período de recuperación, los animales esperan nuevamente y se miden el músculo sóleo y las masas adrenales. Los pesos corporales antes de la cirugía de cola no fueron significativamente diferentes a los de cinco días después de la cirugía y antes de hu.
Aunque la supresión de las extremidades posteriores durante 14 y 28 días provocó una pequeña pérdida de masa corporal, esta no fue significativa, y los ratones recuperaron completamente sus pesos corporales previos a la supresión. Tras tres días de recuperación. El consumo de alimento en ratones controles ambulatorios y ratones suprimidos se muestra aquí.
La ingesta diaria promedio de alimento no fue diferente en los ratones HU durante 28 días en comparación con los controles. Se observa una atrofia significativa del músculo sóleo tras 14 y 28 días de HU, lo que indica un procedimiento efectivo tras tres días de recuperación. La masa del sóleo fue significativamente mayor que la de ambos grupos HU, pero aún significativamente menor que la de los animales controles ambulatorios.
Se extirparon y pesaron ambas glándulas suprarrenales, izquierda y derecha, para proporcionar un indicador del estrés del animal. Como se observa aquí, los pesos promedio fueron comparables entre los ratones control y los ratones HU. Una vez dominada, la cirugía de adaptación puede completarse en cinco a diez minutos por ratón, y la preparación de la jaula puede finalizarse en 15 minutos tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como los ratones, Hein, la recarga de las extremidades y la recuperación de la atrofia por desuso, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, tales como cómo los sistemas muscular y óseo pueden recuperarse y responder a estos períodos prolongados de inactividad.
Ahora que ha visto este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la suspensión de las extremidades posteriores en ratones. Esta técnica permite el estudio de múltiples tejidos y sistemas, como los cardiovascular, músculo-esquelético y digestivo, bajo condiciones de descarga y recarga, y utilizando una variedad de modelos de ratones, como knockouts o knockins.
Descripción general
Este estudio presenta un modelo novedoso de descarga de las extremidades posteriores en ratones que simplifica el procedimiento al tiempo que minimiza el estrés en los animales. El método induce eficazmente atrofia de las extremidades posteriores sin comprometer la salud general ni el peso corporal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología musculoesquelética
- Biología gravitacional y espacial
Antecedentes
- Los métodos existentes, como la técnica de tracción de cola Morey-Holton, pueden provocar complicaciones.
- Las técnicas anteriores provocaron pérdida de animales y comprometieron los datos.
- Existe la necesidad de métodos efectivos para estudiar la atrofia muscular.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método más sencillo para la suspensión de las extremidades posteriores en ratones.
- Minimizar el estrés y mejorar el tiempo de recuperación de los animales.
- Facilitar la investigación sobre la prevención de la atrofia muscular y la pérdida ósea.
Métodos Utilizados
- Implantación de un anillo caudal en ratones adultos.
- Monitoreo del peso corporal y estado de salud durante todo el estudio.
- Ensamblaje de un aparato para la suspensión de las extremidades posteriores.
- Medición de la masa corporal y muscular para evaluar la atrofia.
Resultados principales
- El nuevo método induce con éxito la atrofia de las extremidades posteriores.
- Los animales mantienen un peso corporal estable durante el procedimiento.
- La visibilidad de la piel del rabo permite un mejor monitoreo.
Conclusiones
- Esta técnica ofrece una alternativa confiable frente a los métodos existentes.
- Puede ayudar a comprender los efectos de la inactividad sobre la salud muscular.
- El método es beneficioso para la investigación en diversos campos fisiológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos preclínicos confiables de atrofia muscular inducida por desuso son esenciales para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos musculoesqueléticos y metabólicos. Este método alternativo de suspensión de miembros posteriores (HU) en ratones ofrece una mejora en el bienestar animal, la reproducibilidad y la eficiencia operativa en comparación con los modelos tradicionales de la NASA. Sus resultados cuantitativos robustos y sus complicaciones procedimentales reducidas respaldan una mayor confianza predictiva en las etapas tempranas del descubrimiento y en los puntos de inflexión traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una investigación rigurosa de las vías de atrofia musculoesquelética bajo condiciones controladas de desuso.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de las respuestas musculares y suprarrenales a la descarga.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al minimizar el estrés animal y los artefactos procedimentales que podrían interferir.
- Proporciona puntos finales reproducibles para la clasificación de carteras y decisiones tempranas de avance/no avance.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona sistemas biológicos validados y estandarizados para la selección de compuestos posteriores.
- Asegura la reproducibilidad y la medición cuantitativa de la atrofia muscular y la recuperación.
- Reduce la variabilidad provocada por la huida de los animales o lesiones en la cola, mejorando la fiabilidad del ensayo.
- Permite flujos de trabajo escalables y listos para plataformas destinados a la evaluación de fármacos musculoesqueléticos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad de inactividad, inmovilización y microgravedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica de intervenciones contra la atrofia.
- Proporciona puntos finales relevantes para estudios traslacionales de biomarcadores y eficacia.
- Reduce los riesgos del avance al reflejar escenarios clínicos de desuso y recuperación.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este modelo de HU integra desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de fármacos líderes y la validación preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis y la evaluación cuantitativa de dianas musculoesqueléticas.
- Biología del Descubrimiento: Permite la prueba de hipótesis nulas sobre mecanismos de atrofia y efectos de intervenciones.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de la masa muscular y marcadores de estrés.
- Análisis: Facilita la comparación estadística entre grupos de intervención y controles mediante mediciones de masa corporal y muscular.
- Investigación Traducional: Modela escenarios clínicamente relevantes de desuso para la alineación de biomarcadores y evaluación de eficacia.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y de baja complejidad, adaptable a diversos genotipos de ratón y tipos de intervención.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de atrofia.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el bienestar animal.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al reducir la pérdida de datos y los fallos procedimentales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas musculoesqueléticos y metabólicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia quirúrgica para la implantación del anillo caudal y el monitoreo de los animales.
- Necesita instrumentación de laboratorio estándar para cirugía animal y análisis cuantitativo de tejidos.
- Exige estandarización entre equipos en los pasos del procedimiento y en la recopilación de datos.
- Adaptable a diversos modelos de ratón, incluyendo cepas con genes knockout y cepas relacionadas con enfermedades.
- Las limitaciones incluyen la necesidad de un período de recuperación postquirúrgica y un alojamiento cuidadoso de los animales para prevenir enredos.
