Purificación de los progenitores del músculo esquelético

El objetivo general del siguiente experimento es aislar células progenitoras miogénicas y adipogénicas viables del músculo esquelético espejo. Esto se logra recolectando primero tejido muscular de ratones sacrificados. Como segundo paso, la muestra se digiere enzimáticamente, lo que disocia el tejido en células individuales.

A continuación, se utiliza la clasificación de células activadas por fluorescencia o facts para aislar las células progenitoras. Se obtienen resultados que muestran la viabilidad y diferenciación de las células aisladas cuando se trasplantan a ratones receptores en base a la tinción histoquímica para el marcador genético, que en este ejemplo es la fosfatasa alcalina humana. La principal ventaja de esta técnica sobre técnicas preexistentes como la prepl es que las células se pueden aislar directamente del animal en diferentes puntos temporales.

Por ejemplo, después de inducir daño tisular, lo que significa que no hay selección sobre la población celular y la población celular se puede analizar a nivel molecular para observar las diferentes etapas que atraviesan las células durante el proceso de regeneración in vivo. Por lo tanto, esta técnica puede ayudar a responder una pregunta crítica en el campo de la regeneración de tejidos y, en particular, ¿qué papel desempeña cada tipo de célula durante la regeneración in vivo y cómo interactúan estos tipos de células entre sí para reconstruir un tejido sano? La implicación de esta técnica se extiende hacia el tratamiento de enfermedades como la distrofia muscular.

A medida que el estudio de estos progenitores puede llegar a permitir estrategias regenerativas para este tipo de enfermedades. Además, las implicaciones de esta técnica se extienden a una serie de otros tejidos que van desde el corazón hasta el adiposo, porque al menos los progenitores fibroadipogénicos se han encontrado en todos los tejidos que hemos probado hasta ahora. Por lo general, los recién llegados a esta técnica tendrán dificultades porque las técnicas de disociación duras reducirán la viabilidad celular y crearán demasiados desechos, lo que luego interferirá con la separación limpia de las células más adelante.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando decidimos aplicar la citometría de flujo, que se suele utilizar para las células APOE, al estudio de las células madre en tejidos sólidos. La demostración visual de esta técnica es importante ya que los pasos de disociación de tejidos son difíciles de aprender porque es muy difícil describirlos correctamente. Demostrando esta técnica hoy estará Linky, un asistente de investigación en mi laboratorio que primero desarrolló y optimizó la técnica Para este procedimiento, se requieren al menos dos ratones.

Un ratón se utiliza para que las células proporcionen los controles necesarios de un solo color y de isotipo de anticuerpo para los hechos, y el otro proporcionará la muestra que se va a clasificar. Para empezar, consigue ratones de entre siete y 12 semanas de edad que hayan sido previamente sacrificados en una capucha de laboratorio estéril. Coloque el ratón sacrificado sobre una toalla de papel estéril, boca arriba y rocíe el pelaje a fondo con etanol al 70% para evitar la contaminación con pinzas en una mano y tijeras afiladas en la otra.

Levante la piel en la región abdominal y haga una pequeña incisión longitudinal. Agarre la piel a cada lado de la incisión y retire la piel para exponer completamente los músculos de las extremidades traseras. A continuación, extirpe el tejido muscular insertando las tijeras cerradas debajo del músculo y por encima de la tibia y luego abriendo las tijeras.

El borde posterior de las cuchillas forzará suavemente la separación del músculo de la tibia. Repita para ambos lados de la tibia y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 milímetros. Ahora extirpe el tejido muscular del fémur de la misma manera y agregue el tejido a la placa de Petri.

Repita para cada ratón usando una placa de Petri por ratón. A continuación, disocie el tejido en células individuales. Añadir dos mililitros o 1000 unidades de colagenasa, dos y 20 microlitros de solución madre de cloruro de calcio de 250 milimolares a cada placa de Petri de tejido muscular.

A continuación, trabajar con rapidez y cuidado. Use dos pinzas grises, una dentada y otra con dos dientes para cortar el tejido en pedazos de un milímetro cúbico. Retire y deseche la mayor cantidad posible de tejido no muscular.

Cubra las placas de Petri e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, recupere las placas y devuélvalas a la campana de laboratorio estéril. Retire el émbolo de una jeringa de tres mililitros y utilícelo para triturar el pañuelo.

Utilice un émbolo por placa para evitar la contaminación cruzada. Agregue aproximadamente cinco mililitros de PBS estéril frío a cada placa de Petri y transfiera el contenido de la placa a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague con cinco mililitros adicionales de PBS para recuperar todo el tejido y agréguelo al tubo cónico.

Lavar y centrifugar las muestras tres veces según el protocolo. A continuación, agregue un mililitro de una solución compuesta por colagenasa D dys espacio dos y cloruro de calcio a cada tubo e incube a 37 grados centígrados con rotación durante una hora. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de PBS estéril frío a los tubos, haga vórtice los tubos brevemente y tritrate varias veces para disociar los grumos.

Llene los tubos con PBS, mezcle bien y colóquelos en hielo Para eliminar los trozos grandes de tejido restantes, coloque un colador de células de 40 micras sobre un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo y filtre la suspensión de células. Divida el flujo uniformemente en tres tubos cónicos de 50 mililitros llenos de PBS frío y estéril y centrifugue a 1600 RPM durante cinco minutos a ocho grados centígrados. Después de la centrifugación, retire con cuidado la S y coloque las células en hielo para teñir y clasificar las células progenitoras miogénicas y adipogénicas.

Primero, configure los seis controles mixtos de tinción de un solo color de acuerdo con el protocolo escrito adjunto. Estos controles incluyen tinción Hulk stain, yoduro de propidio, anticuerpos marcados con FSE CD 31 y CD 45, anticuerpos marcados con SC one P tamaño siete y anticuerpos marcados con alfa siete A PC. A continuación, configure las tres mezclas de tinción de control de isotipo de anticuerpos de acuerdo con el protocolo escrito.

Una vez preparadas las mezclas de tinción, etiquete nueve tubos de einor de 1,5 mililitros para las muestras de control de un solo color e isotipo. Resus suspende y combina las celdas de los tres tubos cónicos en un volumen total de un mililitro de tampón de fax. A continuación, dispense 100 microlitros de las células a cada tubo de control einor marcado y pipetee entre cinco y 10 microlitros de las mezclas de tinción en función de la concentración de los anticuerpos a los tubos de control correspondientes.

Vuelva a suspender las células del ratón de muestra en 200 microlitros de tampón de fax y combínelas en uno de los tubos cónicos de 50 mililitros. A continuación, añade 800 microlitros del cóctel de anticuerpos. Mezcle cada uno de los tubos de control y los tubos de muestra.

Pues incubarlos en hielo durante una hora. Después de la incubación, lave las células añadiendo un mililitro de tampón de fax a cada uno de los nueve tubos de control y aproximadamente 20 mililitros de tampón de fax al tubo de muestra. Centrifugar los tubos de control einor a 3000 RPM durante cinco minutos.

Centrifugar el tubo cónico de muestra a 1600 RPM durante cinco minutos. A continuación, aspire y deseche el snat después de la centrifugación. Vuelva a suspender las células de control en cada tubo de extremo con un mililitro de tampón de fax y vuelva a suspender las células de muestra en cuatro mililitros de tampón de fax.

Añada yoduro de propidio a las células de muestra y a los controles de isotipo, así como al pi. Tubo de control de un solo color. Pipetee las células en tubos de fax a través de la tapa del filtro de células para eliminar los grumos restantes que puedan afectar al citómetro.

Configure el instrumento de fax con un solo color y controles de isotipo. Clasifique las células de muestra de acuerdo con el protocolo escrito adjunto y recoja cada población por separado. Y un tubo de recolección de 3,5 mililitros Los progenitores miogénicos viables son la población que es descomunal y alfa siete un PC positivo y PI CD 31 FE CD 45 FE y ska.

Un tamaño de PE, siete progenitores adipogénicos viables negativos son descomunales y ska un PE tamaño siete positivo y pi CD 31, FE CD 45 FE y alfa siete un PC negativo. Un solo ratón de tipo salvaje puede producir aproximadamente una vez 10 al quinto progenitor adipogénico, y de 1,5 a dos veces 10 al quinto. Progenitores miogénicos con más del 95% de viabilidad.

Para preparar las células para el trasplante en ratones huéspedes, las células se lavan. Primero centrifugar celdas distorsionadas a 1500 RPM durante cinco minutos. Retirar el sobrenadante, resuspender las células en 500 microlitros de PBS y transferirlas a tubos de einor.

Centrifugar los tubos a 3000 RPM durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. A continuación, resus suspende los progenitores miogénicos en PBS o los progenitores adipogénicos en matri matrigel a aproximadamente 10 a las seis células por mililitro. Después de preparar los ratones huéspedes anestesiados para cada tipo de célula donante, de acuerdo con el protocolo escrito, use una jeringa de insulina de tres décimas de centímetro cúbico para inyectar 20 microlitros aproximadamente 20,000 células de progenitores miogénicos o adipogénicos.

Permita la cantidad de tiempo adecuada para que las células trasplantadas se diferencien, por lo general, alrededor de tres semanas. A continuación, aislar el tejido objetivo y prepararlo para la criosección como se describe en el protocolo de esta figura, se demuestra la estrategia de clasificación para aislar los progenitores adipogénicos y miogénicos, se identificaron las células viables en función de la dispersión directa y la dispersión lateral, se utilizó la tinción de halcón para excluir un residuo nuclear y la tinción de yoduro de propidio o PI para excluir las células muertas, A continuación, se excluyeron de las puertas de clasificación las células hematopoyéticas y endoteliales, o células CD 45 y CD 31 respectivamente. Por último, el subconjunto que es alfa siete positivo.

SKA uno negativo contiene todos los progenitores miogénicos y la población que es alfa siete negativos. SKA un positivo contiene todos los progenitores adipogénicos, fluorescencia menos uno, controles de isotipo confirman la especificidad de la tinción. Además, se realizaron controles de pureza de los subconjuntos adipogénicos y miogénicos.

Después de clasificar en este ejemplo representativo, las células donantes progenitoras adipogénicas que expresan fosfatasa alcalina humana transgénica inyectada por vía subcutánea se pueden identificar en el tejido del huésped mediante histoquímica, según lo indicado por la tinción marrón. Células donantes progenitoras miogénicas que expresan células transgénicas. La fosfatasa alcalina humana inyectada por vía intramuscular se identificó en esta sección de tejido, como se muestra en marrón.

Utilizando la histoquímica una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Si se procesan más muestras, el tiempo aumentará. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápida y suavemente.

Por lo tanto, evite procesar demasiadas muestras a la vez. Prolongar el tiempo de procesamiento reducirá en gran medida la variabilidad celular siguiendo este procedimiento. Otros métodos como el análisis de la expresión de colono SC OG por R-T-P-C-R cuantitativo también pueden realizar para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo responden estas células profesionales al daño in vivo después de su desarrollo?

Esta técnica allanó el camino para que otros investigadores en el campo de la regeneración de tejidos exploraran la diafonía entre las células pro en el tejido dañado. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo disociar estos tejidos sin dañarlos. Las células progenitoras identifican a las células progenitoras en función de sus marcadores de servicio y analizan su potencial de desarrollo in vivo.

Gracias por mirar. Buena suerte con tu experimento.