Name: Purificación de los progenitores del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a aislar progenitores miogénicos y adipogénicos de músculo esquelético murino mediante digestión enzimática y citometría de flujo. Este método permite analizar la viabilidad celular y la regeneración tisular in vivo.

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1. Tejido Colección: <ol><li> Utilizar ratones de entre 7 y 12 semanas de edad. Por lo general, al menos dos animales se utilizan: uno es la creación de la FACS de un solo color controles necesarios para la compensación y la fluorescencia-menos-uno muestras de control de isotipo. La otra es la muestra real para la clasificación. </li><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de CO 2 o de acuerdo con un protocolo de ética de la elección. Ratones lugar en una toalla de papel, mirando hacia arriba, y rociar con etanol al 70% a fondo para evitar la contaminación con la piel del ratón. </li><li> Levante la piel en la región abdominal con una pinza, a continuación, hacer un pequeño corte longitudinal con tijeras afiladas. </li><li> Pelar los dos colgajos de piel en direcciones opuestas (arriba y abajo) para exponer completamente los músculos de las extremidades posteriores por debajo. </li><li> Extirpar el tejido muscular mediante la inserción y la ampliación de las tijeras a ambos lados de la tibia. </li><li> Repita el mismo proceso para el fémur para extraer el tejido muscular. </li><li> Coloque todos los tejidos del músculo extirpado en placas petri de 60 mm, utilizando un plato para el tejido de cada ratón. </li><li> Repita los pasos anteriores para todos los ratones. </li></ol> 2. Disociarse del tejido en células individuales por digestión enzimática: A lo largo de esta sección del protocolo, utilice los reactivos estériles y las herramientas y el trabajo en condiciones estériles. <ol start="9"><li> Añadir 2 ml de colagenasa II (Sigma, cat # 6885, 500u / mL) y 20 l de 250 mm de CaCl2 acciones a cada plato de Petri. </li><li> Romper el tejido muscular en trozos pequeños (alrededor de 1 mm 3) con dos pinzas (una sierra, una con 2 dientes, de las herramientas de Ciencias Artes, cat # 11051-10, 11154-10), prestando atención a retirar y desechar lo más contaminadas no tejido muscular como sea posible. </li><li> Cubra la placas Petri y se incuba a 37 grados centígrados en 30 minutos. </li><li> Recuperar el placas Petri y el uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml a fondo el puré de trozos de tejido. Use un émbolo para cada muestra para evitar contaminaciones. </li><li> Agregue un poco de (~ 5 ml) PBS estéril fría a cada plato de Petri y la transferencia de los lodos de tejido en un tubo de 50 ml Falcon (enjuagar el plato de Petri, si es necesario para recuperar todo el tejido) </li><li> Agite el tubo Falcon con fuerza, llenar el tubo con PBS, @ 800rpm x 5 minutos (Eppendorf modelo de banco: 5810R), y aspirar el sobrenadante (repetir 3 veces) </li><li> Agregue la mezcla de 1 ml de colagenasa D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / ml) / Dispasa II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) y 10μL de CaCl 2 (250 mm) a cada tubo, se incuba a 37 grados C con rotación durante una hora. </li><li> Añadir 5-10 ml de frío, PBS estéril, vortex y pipetear bien para homogeneizar el tejido. </li><li> Llenar los tubos con PBS y mezclar bien. </li><li> Trasvasar el líquido a un filtro de 40μm celular colocado en la parte superior de un tubo Falcon de 50 ml para filtrar el resto de piezas grandes de tejido. Divide cada muestra de manera uniforme en tres tubos de 50 ml Falcon. Llene cada uno de los tubos con PBS y centrifugar @ 1.600 rpm durante 5 minutos a 8 grados centígrados. </li><li> Eliminar el sobrenadante y recoger las células de la tinción. </li></ol> 3. La tinción de anticuerpos y clasificación: A lo largo de esta sección del protocolo, el uso FACS estéril y tampones de recogida y trabajar en condiciones estériles. Anticuerpos comerciales generalmente se consideran estériles si se maneja adecuadamente. <ol start="20"><li> De un solo color y las muestras de control de isotipo, volver a suspender la muestra en tampón FACS 1 mL y se dividen las células en suspensión en 1,5 ml nueve pre-etiquetados tubos Eppendorf (100 l cada tubo). <ol><li> Establecer manchas de color se mezcla única de acuerdo con la siguiente tabla: ATENCIÓN: La concentración final de anticuerpos isotipo de control de la mancha debe coincidir con el anticuerpo primario son el control de. Por ejemplo, si el anti-CEC-1 se utiliza para una μg/10 6 celdas, su isotipo correspondiente debe ser utilizado en la misma concentración. <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nombre del tubo </td><td> Empresa </td><td> Cat # </td><td> clon </td><td> isotipo </td><td> dilución </td></tr><tr><td> 1 </td><td> No mancha </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> IgG2a de la rata </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Casa hecha </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rata IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sca1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> IgG2a de la rata </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Casa hecha </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rata IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Establecer un control de isotipo tinción mezcla con la siguiente tabla: <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nombre del tubo </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Esca- PE-Cy7 </td><td> A-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Esca- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Pipeta de un solo color y la mezcla de isótopos tinción de control (por lo general, ajustar la concentración de anticuerpos, por lo que entre el 5 y 10 l de la tinción de la mezcla se añadió a cada muestra) en la correspondiente tubo Eppendorf a partir del paso 20. Mezclar bien e incubar en hielo durante 1 hora. </li></ol></li><li> Tinción de las células de ratón muestra con 800μL del cóctel de anticuerpos (abajo) para la clasificación de células FACS. Mezclar bien e incubar en hielo durante 1 hora. Cóctel de anticuerpos: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC ATENCIÓN: La relación óptima de anticuerpos contra las células deben ser determinados por titulación individual de cada anticuerpo, como Pueden existir diferencias significativas entre los lotes. La cantidad óptima de anticuerpos que se utilicen deben ser expresados ​​en μgs de anticuerpos por 10 6 células diana y se mantiene constante cuando se utiliza el mismo lote de anticuerpos. Claramente, si el número de células diana no cambia significativamente entre los experimentos, o si el volumen de tinción se escala con el número de células, una dilución fija de cada anticuerpo también puede ser utilizado. </li><li> Lavado: Añadir aproximadamente 1 ml de solución tampón FACS para cada uno de los nueve tubos de control, agregar aproximadamente 20 ml de solución tampón FACS para el tubo de muestra. </li><li> Centrifugar el tubos Eppendorf @ 3000rpm durante 5 minutos (centrífuga Eppendorf banco de la top model,: 5417C). Centrifugar el tubo de la muestra @ 1.600 rpm durante 5 minutos (banco de centrifugadora de Eppendorf, Modelo: 5810R). </li><li> Aspirar y desechar el sobrenadante de todos los tubos. </li><li> Resuspender las células en el tampón FACS (1 ml por cada uno de los controles, 4 ml para la muestra de la clasificación), las células con una pipeta en "tubos FACS" a través del filtro celular tapa (gato BD Falcon # 352235, 40μm de tamaño de poro) para eliminar los grupos restantes que pueden afectar el citómetro. </li><li> Establecer el Clasificador de FACS con los controles de un solo color y los controles de isotipo. </li><li> Muestras de células ordenados de acuerdo a la siguiente tabla en un buffer de recolección de 3,5 ml (95% DMEM, 5% de SFB) por separado. Normalmente, cuando se cosecha dos patas traseras, un solo ratón de tipo salvaje podría producir alrededor de 150.000 células progenitoras miogénica o 100.000 células progenitoras adipogénico, con la viabilidad por encima del 95%, a juzgar por volver a analizar las células ordenados por FACS en el final del procedimiento (Figura 1 ) Definición de los progenitores y miogénica adipogénico sobre la base de tinción de la superficie <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo / mancha </td><td> Progenitoras miogénica (MP) </td><td> Progenitoras adipogénico (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Trasplante: <ol start="28"><li> Centrifugar las células ordenados a 1500 rpm durante 5 minutos, eliminar las células sobrenadante y traslado al autoclave los tubos Eppendorf (1,5 ml), lavar las células con 500 l de PBS estéril (suero gratis!), Centrifugar @ 3000rpm durante 5 minutos. Mantener todos los reactivos en condiciones estériles y trabajar en una campana de cultivo de tejidos, resuspender progenitores miogénica en PBS, o progenitoras adipogénico en Matrigel (BD # 354234 gato) en aproximadamente 10 6 células / ml. </li><li> Trasplante de progenitores o progenitoras miogénica adipogénico a los ratones receptores. <ol><li> Anestesiar a los ratones con isoflouran de acuerdo con su política de la institución. </li><li> Afeitar el vello de la región de inyección y luego esterilizar la piel por el roce con el 70% de etanol </li><li> Inyectar 20μL de los progenitores o progenitoras miogénica adipogénico (= 20k células) con una jeringa CC 03.10 insulina (gato BD # 309300). </li></ol></li><li> Después de un tiempo apropiado (tres semanas funciona bien, pero miofibras expresar derivadas del donante marcadores transgénicos son evidentes dentro de una semana después del trasplante), anestesiar a los ratones receptores del paso 29 por inyección intraperitoneal de 400 l Avertin (Sigma Cat. # T04840-2, 25 mg / ml), luego perfundir transcardialmente con 50 ml de PBS (contiene 10 mM de EDTA), seguido por 15 ml de PFA al 4%. Recoger tejido diana, después de arreglar con un 4% PFA durante la noche si es necesario, a continuación, transferir el 20% de sacarosa durante la noche. Insertar en octubre, congelar y cryosection. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Cuando se trasplantan MP en el músculo esquelético del ratón, que fácilmente se fusionan con pre-existentes miofibras. Por lo tanto, cualquier etiqueta genética presente en las células del donante será fácilmente detectable en las fibras que los recibió. La figura 2 muestra un ejemplo donde las células trasplantadas expresado phostphatase alcalinas humanos, reveló histológicamente. Cuando AP se trasplantan el resultado depende en gran medida el medio ambiente del sitio de trasplante: cuando se trasplantaron estas células por vía subcutánea dan origen a los adipocitos y miofibroblastos (ver figura 2). En muchos otros sitios, incluyendo los músculos, no sobrevivirá a menos que la degeneración grasa ha sido inducido 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Clasificación de la estrategia para el aislamiento de las poblaciones progenitoras de músculo esquelético (A) La estrategia de clasificación:. Las células viables fueron identificados sobre la base de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Tinción Hoechst se utilizó para excluir los residuos anucleadas y tinción con yoduro de propidio (PI) para excluir a las células muertas. Hematopoyéticas (CD45) y células endoteliales (CD31), las células fueron excluidos de las puertas de la clasificación. El α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - subconjunto contiene todos los progenitores miogénica (MP). El Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - población contiene progenitores adipogénico (AP). (B) de fluorescencia-menos-uno (FMO) controles de isotipo confirmar la especificidad de la mancha. (C) Pureza cheques de subconjuntos MP y AP después de la clasificación. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados representativos siguientes MP y el trasplante de AP AP. Fueron trasplantados por vía subcutánea (arriba) y MP por vía intramuscular (panel inferior). En ambos casos, las células del donante se originó a partir de un ratón transgénico que expresa la fosfatasa alcalina humana, identificados por la coloración marrón.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

El objetivo de este protocolo es establecer un equilibrio razonable entre alto rendimiento y alta viabilidad de las células purificadas. El paso más crítico para asegurar que las células sanas se recuperan es, como era previsible, la disociación enzimática del tejido de partida. El manejo de los tejidos deben ser especialmente cuidadoso, lo cual es difícil de demostrar o aprecia incluso en un formato audiovisual. Otro factor clave es la duración del procedimiento. Cuanto más tiempo se tarda en ir desde el donante hasta el receptor de los animales, menor será la viabilidad y por lo tanto, la eficiencia de injerto. Si hubiera alguna duda sobre la viabilidad de que no es inmediatamente contestada por mirar a la frecuencia de eventos PI positivos en las muestras de células purificadas después de la clasificación, se sugiere que un ensayo de dilución límite para medir clonogenicidad se lleva a cabo 3. Clase típica de los músculos en buen estado habitualmente producen alrededor de un 15-20 en células capaces de iniciar colonias miogénica o fibro / adipogénico in vitro. Mientras que prácticamente el 100% de las colonias de los diputados iniciaron contienen miotubos diferenciados, sólo una tercera parte de las colonias obtenidas a partir de FAP contiene adipocitos, además de suave miofibroblastos actina de músculo positivo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Colagenasa II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 U / ml </td></tr><tr><td> Colagenasa D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 U / ml </td></tr><tr><td> Plegar II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 u / ml </td></tr><tr><td> células colador </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 m </td></tr><tr><td> Tubo con filtro celular </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 m </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2.5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clon 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Hecho en casa </td><td></td><td> Clon I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clon D7 </td></tr><tr><td> α-integrina 7 APC </td><td> Hecho en casa </td><td> Consulte con Rossi laboratorio </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

purificación de los progenitores del músculo esquelético

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

El músculo esquelético contiene múltiples poblaciones progenitoras de distintos orígenes embrionarios y potencial de desarrollo. Progenitores miogénica, por lo general residen en una &quot;posición de las células satélite&quot; entre la membrana plasmática miofibrilar y la membrana basal laminina-ricos que se ensheaths, se auto-renovación de células que son los únicos comprometidos con el 1,2 linaje miogénico. Recientemente hemos descrito una segunda clase de progenitores buques asociados que pueden generar miofibroblastos y los adipocitos blancos, que responde a los daños causados ​​por la proliferación de entrar de manera eficiente y proporciona soporte trófico de las células miogénica en la regeneración de tejidos 3,4. Una de las pruebas más fiables para determinar el potencial de desarrollo y regeneración de una población determinada célula depende de su aislamiento y el trasplante de 5-7. Con este fin, hemos optimizado los protocolos para su purificación mediante citometría de flujo del músculo disociadas enzimáticamente, que vamos a esbozar en este artículo. Las poblaciones obtenidas con este método se contienen células colonia miogénica o fibro / adipogénico formación: no otros tipos de células son capaces de expandir in vitro o in vivo sobrevivir en la entrega. Sin embargo, cuando estas poblaciones se utilizan inmediatamente después de la clasificación para el análisis molecular (por ejemplo, QRT-PCR) se debe tener en cuenta que los subconjuntos recién ordenados pueden contener otras células contaminantes que carecen de la capacidad de formar colonias o injerto destinatarios.

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

El músculo esquelético contiene múltiples poblaciones de progenitores de distintos orígenes embrionarios y potencial de desarrollo. Los progenitores miogénicos, que habitualmente residen...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar células progenitoras viables de origen mio génico y adipogénico a partir de músculo esquelético simétrico. Esto se logra primero mediante la extracción de tejido muscular de ratones sacrificados. Como segundo paso, la muestra se digiere enzimáticamente, lo que disocia el tejido en células individuales.A continuación, se utiliza la clasificación de células activada por fluorescencia o FACS para aislizar las células progenitoras. Se obtienen resultados que muestran viabilidad y diferenciación de las células aisladas cuando se trasplantan en ratones receptores, basados en la tinción histoquímica para la etiqueta genética, que en este ejemplo es la fosfatasa alcalina humana. La ventaja principal de esta técnica frente a técnicas preexistentes como prepl es que las células pueden aislarse directamente del animal en diferentes puntos temporales.Por ejemplo, tras inducir daño tisular, lo que significa que no hay selección sobre la población celular, la población celular puede analizarse a nivel molecular para observar las diferentes etapas que las células atraviesan durante el proceso de regeneración in vivo. Por lo tanto, esta técnica puede ayudar a responder una pregunta fundamental en el campo de la regeneración tisular, y en particular, qué papel desempeña cada tipo celular durante la regeneración in vivo y cómo interactúan estos tipos celulares entre sí para reconstruir un tejido sano. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades como la distrofia muscular.Como el estudio de estos precursores podría eventualmente permitir estrategias regenerativas para este tipo de enfermedades. Además, las implicaciones de esta técnica se extienden a varios otros tejidos, desde el corazón hasta el tejido adiposo, ya que al menos los precursores fibroadipogénicos se han encontrado en cada uno de los tejidos que hemos probado hasta ahora. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque técnicas de disociación agresivas reducirán la viabilidad celular y generarán demasiados residuos, lo que posteriormente interferirá con la separación limpia de las células.La primera idea para este método surgió cuando decidimos aplicar la citometría de flujo, que normalmente se utiliza para células APOE, al estudio de células madre en tejidos sólidos. La demostración visual de esta técnica es importante porque los pasos de disociación del tejido son difíciles de aprender, ya que es muy complicado describirlos adecuadamente. Quien demostrará esta técnica hoy será Linky, una asistente de investigación en mi laboratorio que primero desarrolló y optimizó la técnica. Para este procedimiento, se requieren al menos dos ratones.Se utiliza un ratón para obtener las células necesarias para los controles de color único y de isotipo de anticuerpo, y el otro proporcionará la muestra que se va a clasificar. Para comenzar, obtenga ratones entre siete y 12 semanas de edad que hayan sido previamente sacrificados en una campana estéril de laboratorio. Coloque el ratón sacrificado sobre una toalla de papel estéril, boca arriba, y rocíe abundantemente el pelaje con etanol al 70 % para prevenir la contaminación, utilizando pinzas en una mano y tijeras afiladas en la otra.Levante la piel en la región abdominal y realice una pequeña incisión longitudinal. Sujete la piel en cada lado de la incisión y retire la piel hacia atrás para exponer completamente los músculos de la extremidad trasera. A continuación, extirpe el tejido muscular insertando las tijeras cerradas debajo del músculo y por encima de la tibia, y luego abra las tijeras.El borde posterior de las cuchillas forzará suavemente la separación del músculo de la tibia. Repita el procedimiento para ambos lados de la tibia y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 milímetros. Ahora, extirpe el tejido muscular del fémur de la misma manera y agregue el tejido a la placa de Petri.Repita el procedimiento para cada ratón utilizando un plato de Petri por ratón. A continuación, disocie el tejido en células individuales. Añada dos mililitros o 1000 unidades de colagenasa, y dos y 20 microlitros de solución stock de cloruro de calcio 250 milimolar a cada plato de Petri con tejido muscular.Luego, trabaje rápidamente y con cuidado. Utilice dos pinzas grises, una con estrías y otra con dos dientes, para desgarrar el tejido en trozos de un milímetro cúbico. Retire y deseche la mayor cantidad posible de tejido no muscular.Cubra las placas de Petri e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, retire las placas y devuélvalas a la cabina de seguridad biológica. Retire el émbolo de una jeringa de tres mililitros y úselo para machacar el tejido.Utilice un émbolo por placa para evitar la contaminación cruzada. Añada aproximadamente cinco mililitros de PBS frío estéril a cada placa de Petri y transfiera el contenido de la placa a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague con cinco mililitros adicionales de PBS para recuperar todo el tejido y añádalo al tubo cónico.Lave y centrifugue las muestras tres veces según el protocolo. A continuación, agregue un mililitro de una solución compuesta de colagenasa D dys espacio dos y cloruro de calcio a cada tubo e incube a 37 grados Celsius con rotación durante una hora. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de PBS frío estéril a los tubos, vortexe brevemente y triiture varias veces para disociar los agregados.Llene los tubos con PBS, mezcle bien y coloque en hielo. Para eliminar cualquier resto de fragmentos grandes de tejido, coloque un filtro celular de 40 micrones sobre un tubo cónico de 50 mililitros en hielo y filtre la suspensión celular. Divida el filtrado equitativamente en tres tubos cónicos de 50 mililitros llenos con PBS frío y estéril y centrifugue a 1600 RPM durante cinco minutos a ocho grados Celsius. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante y coloque las células en hielo para la tinción y clasificación de células progenitoras miogénicas y adipogénicas.Primero, prepare los seis controles mixtos de tinción monocromática según el protocolo escrito adjunto. Estos controles incluyen la tinción sin colorante, tinción con hulk, yodo de propidio, anticuerpos marcados con FSE para CD31 y CD45, anticuerpo marcado con SC one P tamaño siete y anticuerpo marcado con alfa siete A PC. A continuación, prepare las tres mezclas de control de tinción con isotipos de anticuerpos según el protocolo escrito.Una vez preparadas las mezclas de tinción, etiquete nueve tubos einor de 1,5 mililitros para las muestras de color único y control de isotipo. Resuspenda y combine las células de los tres tubos cónicos en un volumen total de un mililitro de tampón fax. A continuación, distribuya 100 microlitros de las células en cada tubo einor de control etiquetado y agregue entre cinco y 10 microlitros de las mezclas de tinción, según la concentración de los anticuerpos, a los tubos de control correspondientes mediante pipeta.Re-suspender las células del ratón de la muestra en 200 microlitros de tampón fax y combinar en uno de los tubos cónicos de 50 mililitros. A continuación, agregar 800 microlitros de la mezcla de anticuerpos. Mezclar cada uno de los tubos de control y los tubos de muestra.Incubar bien las muestras en hielo durante una hora. Tras la incubación, lavar las células añadiendo un mililitro de tampón fax a cada uno de los nueve tubos de control y aproximadamente 20 mililitros de tampón fax al tubo de muestra. Centrifugar los tubos einor de control a 3000 RPM durante cinco minutos.Centrifugar el tubo cónico de muestra a 1600 RPM durante cinco minutos. Luego aspirar y descartar el sobrenadante tras la centrifugación. ReSuspender las células control en cada tubo eppendorf con un mililitro de tampón fax y reSuspender las células de la muestra en cuatro mililitros de tampón fax.Añada yoduro de propidio a las células de la muestra, a los controles isotípicos y al control monocromático de PI. Pase las células a tubos para citómetro mediante la tapa con filtro celular para eliminar los agregados residuales que podrían afectar al citómetro.Configure el instrumento de citometría con un control de color único y controles isotípicos. Ordene las células de la muestra según el protocolo escrito adjunto y recolecte cada población por separado. Utilice un tubo de recolección de 3,5 mililitros. Los progenitores miogénicos viables corresponden a la población que es dispersa lateralmente, positiva para alfa siete integrina, PC positiva, y negativa para PI, CD31, FE, CD45, FE y ska.Se aíslan progenitores adipogénicos viables negativos para PE tamaño siete y se seleccionan positivos para PE tamaño siete y negativos para CD 31, CD 45 y alfa siete a PC. Un solo ratón de tipo salvaje puede producir aproximadamente 1 × 10⁵ progenitores adipogénicos y de 1,5 a 2 × 10⁵ progenitores miogénicos con una viabilidad superior al 95 %.Para preparar las células para trasplante en ratones huéspedes, se lavan las células. Primero, centrifugue las células alteradas a 1500 RPM durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, resuspenda las células en 500 microlitros de PBS y transfiera las células a tubos einor.Centrifugar los tubos a 3000 RPM durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Luego, resuspender los progenitores miogénicos en PBS o los progenitores adipogénicos en matrigel a aproximadamente 10⁶ células por mililitro. Después de preparar los ratones huésped anestesiados para cada tipo de célula donante, según el protocolo escrito, utilizar una jeringa de insulina de tres décimas de centímetro cúbico para inyectar 20 microlitros (aproximadamente 20 000 células) de progenitores miogénicos o adipogénicos.Permita el tiempo apropiado para que las células trasplantadas se diferencien, generalmente alrededor de tres semanas. Luego, aísle el tejido diana y prepárelo para la criosección según se describe en el protocolo. En esta figura, se demuestra la estrategia de clasificación para aislar los progenitores adipogénicos y miogénicos; las células viables se identificaron según la dispersión directa y la dispersión lateral; la tinción con Hawk se utilizó para excluir restos nucleares, y la tinción con yoduro de propidio o PI se empleó para excluir células muertas. Las células hematopoyéticas y endoteliales, o células CD45 y CD31 respectivamente, se excluyeron luego de las compuertas de clasificación. Finalmente, el subconjunto que es positivo para alfa siete.SKA uno negativo contiene todos los progenitores miogénicos y la población que es alfa siete negativa. SKA uno positivo contiene todos los progenitores adipogénicos. Los controles de fluorescencia menos uno con isotipos confirman la especificidad de la tinción. Además, se realizaron controles de pureza de los subconjuntos adipogénicos y miogénicos.Después de la clasificación en este ejemplo representativo, las células donantes progenitoras adipogénicas que expresan fosfatasa alcalina humana transgénica inyectadas por vía subcutánea pueden identificarse en el tejido del hospedador mediante histoquímica, como lo indica la tinción marrón. Las células donantes progenitoras miogénicas que expresan fosfatasa alcalina humana transgénica inyectadas por vía intramuscular se identificaron en esta sección de tejido, tal como se muestra en marrón.Utilizando la histoquímica, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo correctamente. Si se están procesando más muestras, el tiempo aumentará. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente y con suavidad.Por lo tanto, evite procesar demasiadas muestras al mismo tiempo. Prolongar el tiempo de procesamiento reducirá considerablemente la variabilidad celular tras este procedimiento. Otros métodos, como el análisis de expresión de colono SC OG mediante R-T-P-C-R cuantitativa, también pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como: ¿cómo responden estas células progenitoras al daño in vivo tras su desarrollo?Esta técnica allanó el camino para que otros investigadores en el campo de la regeneración de tejidos exploraran la comunicación cruzada entre las células progenitoras en tejidos dañados. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo disociar estos tejidos sin causar daño. Las células progenitoras identifican a las células progenitoras según sus marcadores de superficie y analizan su potencial de desarrollo in vivo.Gracias por ver el video. Buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un...

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Este protocolo describe un método robusto, reproducible y simple de aislamiento y cultivo de células de mioblastos progenitoras del músculo esquelético de adultos y personas de edad avanzada. Los músculos que se usan aquí incluyen los músculos del pie y de la pierna. Este enfoque permite el aislamiento de una población enriquecida de mioblastos primarios para los estudios funcionales.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende a aislar progenitores miogénicos y adipogénicos de músculo esquelético murino mediante digestión enzimática y citometría de flujo. Este método permite analizar la viabilidad celular y la regeneración tisular in vivo.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

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