RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es eliminar la expresión génica endógena mediante la inyección de embriones de Drosophila con ARN bicatenario para identificar los genes necesarios para el desarrollo de los órganos. Esto se logra recolectando y alineando primero los embriones en línea recta. A continuación, se preparan agujas y se utilizan para inyectar ARN bicatenario en los embriones.

Finalmente, los embriones se colocan en una cámara húmeda para que se desarrollen. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran defectos en la fusión de la rama traqueal de Drosophila a través de la tinción de anticuerpos en embriones en etapa tardía, o mediante la observación de larvas bajo un microscopio de campo claro. La principal ventaja sobre esta técnica sobre los métodos existentes, como el cribado genético directo para identificar los genes necesarios para el desarrollo de los órganos, es que se trata de un enfoque genético inverso relativamente sencillo y rápido para analizar las funciones de los genes antes de que un mutante esté disponible para ese gen.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la identificación de genes críticos necesarios para el desarrollo del sistema traqueal D. Este es un excelente modelo para estudiar la morfogénesis de los órganos de los mamíferos, como las vías respiratorias de los vertebrados, el sistema circulatorio, los conductos renales y el epitelio exploratorio. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita tiempo para aprender los métodos, como alinear embriones, romper agujas e inyectar ARN trenzado en los embriones.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que involucran la cantidad de doble hebra. El ARN inyectado varía entre los embriones y la demostración escrita de cómo se ven los embriones sincitiales y blastodermogénicos puede ser difícil. Estos pasos son difíciles de aprender porque inyectar cantidades adecuadas de ARN bicatenario en embriones de blasto sincitial es un paso crítico para reducir eficazmente la expresión de genes endógenos.

Para comenzar, configure las jaulas a 25 grados centígrados con moscas W 1 1 1 1 8 de dos a cuatro días de edad, cambie los platos de jugo de uva cada hora durante el día para sincronizar la recolección de huevos durante un período de uno a dos días. Antes de la recogida. Recoja embriones de derm syn city o blaster durante una hora a 25 grados centígrados, un trozo rectangular de agar jugo de uva y luego corte ligeramente una línea en el medio del agar con la cuchilla de afeitar.

Use una sonda de metal para transferir embriones del plato de jugo de uva al trozo de jugo de uva. Agar-agar. Alinee alrededor de 50 embriones en línea recta con los embriones, ejes más largos en un ángulo de 45 grados con respecto a la línea en el medio del agar. Asegúrese de que todos los embriones apunten en la misma dirección con sus extremos posteriores apuntando en dirección opuesta a la línea.

Corta un trozo rectangular de cinta adhesiva de doble cara y pégalo en un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros. Recoja los embriones usando la cinta adhesiva en la cubierta de la cubierta. Coloque el cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio.

Presione los embriones ligeramente sobre la cinta adhesiva de doble cara y deje que los embriones se sequen al aire durante unos 10 minutos. Cubre los embriones con una fina capa de aceite de carbono de 700 halos. Espere unos 10 minutos hasta que los embriones estén limpios bajo el microscopio.

Las agujas se preparan para la microinyección tirando de tubos capilares de vidrio. Utilizamos un extractor de agujas de World Precision Instruments en la configuración del programa. Calienta uno retrasar cuatro atrás.

Cargue la aguja con dos microlitros de ARN bicatenario utilizando una pipeta Einor P 20 con puntas de microcargador einor. Prepare un portaobjetos con un cubreobjetos limpio encima y péguelos con cinta adhesiva. Lleve la aguja llena contra el borde del cubreobjetos, creando una punta afilada.

El ARN bicatenario se escapa de la punta de la aguja. Cuando se presione el pedal de la bomba pico, prepare una corredera con una gota de aceite en el medio. Inserte la aguja en la gota de aceite.

Ajuste la configuración de la bomba pico para expulsar de 100 a 200 picolitros de ARN bicatenario cuando se pisa el pedal. Doble hebra. El ARN se puede ver como una pequeña posición de gota.

La punta de la aguja en la porción posterior del primer embrión presiona el pedal de la bomba pico. El ARN bicatenario aparecerá como un pequeño. en el lugar de la inyección.

Termine de inyectar ARN bicatenario en los embriones en el portaobjetos. Mata a todos los embriones derm que no sean blaster. Coloque el cubreobjetos en una cámara húmeda cubierta, como una placa de Petri de plástico, a 18 grados centígrados hasta que los embriones se desarrollen hasta la etapa embrionaria o larvaria deseada.

En el caso de los embriones que se han desarrollado hasta la etapa embrionaria deseada, utilice una sonda para extraer los embriones de la cinta adhesiva de doble cara y empujarlos hasta el borde del cubreobjetos. Lave los embriones con heptano en un frasco de recolección con malla de nailon en la parte inferior. Lavar los embriones tres veces con PB tating en 50%Bleach durante cinco minutos y lavar los embriones de nuevo tres veces con PBT.

Transfiera los embriones del vial de recolección a una pieza de malla de nailon con una pipeta, sumerja la pieza de malla de nailon en la solución fijadora. Fija los embriones durante 30 minutos. Retire la capa inferior de la solución fijadora.

A continuación, se transfieren los embriones a un tubo de Eppendorf y se les somete a inmunotinción con dos A 12 y se les administran anticuerpos de difusión utilizando protocolos estándar de tinción de anticuerpos para los embriones que se han desarrollado hasta el estadio larvario deseado. Prepara un portaobjetos con una gota de carbono halo, 700 de aceite en el centro y dos pequeños cubreobjetos a cada lado de la gota de aceite. Transfiera una larva al portaobjetos y luego aplique un cubreobjetos encima de la gota de aceite.

Observe las larvas bajo un microscopio de campo claro. Resultados representativos de la difusión de ARN bicatenario y GFP bicatenario. Aquí se muestran las inyecciones de ARN.

GFP bicatenario. Los embriones inyectados con ARN muestran una fusión traqueal normal y la proteína de difusión está presente en las células de fusión. Las flechas apuntan a las células de fusión positiva de difusión lateral del tronco y el asterisco indica la ubicación de la fusión normal.

Sin embargo, los embriones inyectados de ARN bicatenario por difusión muestran una fusión de rama fallida y las proteínas de difusión no están presentes en las células de fusión. El triángulo indica el sitio de fusión fallida de la rama cuando los embriones inyectados con ARN bicatenario se desarrollaron hasta la etapa larvaria. Las larvas G-F-P-R-N AI muestran una fusión normal de las ramas traqueales indicada por un asterisco.

Por otro lado, las larvas de difusión RN AI demostraron una fusión de ramas fallida indicada por triángulos. Estos resultados muestran el efecto de la eliminación de la expresión génica de difusión endógena mediante la inyección de ARN bicatenario en embriones de Drosophila. Al intentar este procedimiento, es importante recordar matar todos los embriones de blaster de Enseal después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la función de nuevos genes para el desarrollo de órganos en drosophila. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derribar genes endógenos inyectando ARN bicatenario en embriones de Drosophila.