RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es silenciar la expresión génica endógena mediante la inyección de ARN bicatenario en embriones de drosófila para identificar los genes necesarios para el desarrollo de órganos. Esto se logra primero recolectando y alineando los embriones en una línea recta. A continuación, se preparan agujas y se utilizan para inyectar ARN bicatenario en los embriones.

Finalmente, los embriones se colocan en una cámara húmeda para que se desarrollen. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren defectos en la fusión de las ramas traqueales de *Drosophila* mediante tinción con anticuerpos de embriones en estadios tardíos, o mediante la observación de larvas bajo un microscopio de campo brillante. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la pantalla genética directa para identificar genes necesarios para el desarrollo de órganos, es que se trata de un enfoque genético inverso relativamente sencillo y rápido para analizar las funciones génicas antes de que esté disponible un mutante para ese gen.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la identificación de genes esenciales necesarios para el desarrollo del sistema traqueal de D. Este es un excelente modelo para estudiar la morfogénesis de órganos mamíferos como las vías respiratorias de los vertebrados, el sistema circulatorio, los conductos renales y el epitelio exploratorio. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque lleva tiempo aprender técnicas como alinear embriones, romper agujas e inyectar ARN de cadena sencilla en los embriones.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que implican la cantidad de ARN bicatenario inyectado varían entre embriones, y resulta difícil describir por escrito cómo se ven los embriones sincitiales y del tipo blastodermo. Estos pasos son difíciles de aprender porque inyectar cantidades adecuadas de ARN bicatenario en embriones sincitiales de tipo blastodermo es un paso crítico para reducir eficazmente la expresión de genes endógenos.

Para comenzar, prepare jaulas a 25 grados Celsius utilizando moscas W 1 1 1 8 de dos a cuatro días de edad, y cambie las placas de jugo de uva cada hora durante el día para sincronizar la recolección de huevos durante un período de uno a dos días. Antes de la recolección, recolecte embriones de syn city o blaster derm durante una hora a 25 grados Celsius; luego tome un trozo rectangular de agar de jugo de uva y corte ligeramente una línea en el centro del agar con la hoja de afeitar.

Utilice una sonda metálica para transferir embriones desde la placa de jugo de uva hasta el trozo de agar de jugo de uva. Alinee aproximadamente 50 embriones en una línea recta, con los ejes más largos de los embriones en un ángulo de 45 grados respecto a la línea en el centro del agar. Asegúrese de que todos los embriones apunten en la misma dirección, con sus extremos posteriores orientados lejos de la línea.

Corte un trozo rectangular de cinta adhesiva de doble cara y péguelo sobre un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros. Recojan los embriones utilizando la cinta del cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio.

Presione ligeramente los embriones sobre la cinta adhesiva de doble cara y deje secar al aire los embriones durante aproximadamente 10 minutos. Cubra los embriones con una capa delgada de aceite de halo carbono 700. Espere alrededor de 10 minutos hasta que los embriones estén claros bajo el microscopio.

Las agujas se preparan para la microinyección tirando de tubos capilares de vidrio. Utilizamos un extractor de agujas de World Precision Instruments con la configuración del programa: calor uno, retardo cuatro, atrás.

Cargue la aguja con dos microlitros de ARN bicatenario utilizando una pipeta Einor P 20 con puntas micro cargadoras Einor. Prepare un portaobjetos con un cubreobjetos limpio encima y sujételos con cinta. Acercar la aguja cargada al borde del cubreobjetos, creando un punto afilado.

El ARN bicatenario sale por la punta de la aguja. Cuando se presione el pedal del picoinyector, prepare un portaobjetos con una gota de aceite en el centro. Introduzca la aguja en la gota de aceite.

Ajuste la configuración de la bomba de picolitros para expulsar de 100 a 200 picolitros de ARN bicatenario cuando se presione el pedal con el pie. El ARN bicatenario puede observarse como una pequeña gota en posición.

La punta de la aguja en la porción posterior del primer embrión presiona el pedal del pie de la bomba de pico. El ARN bicatenario aparecerá como un pequeño bulto en el sitio de inyección.

Termine de inyectar ARN bicatenario en los embriones sobre el portaobjetos. Elimine todos los embriones que no sean de tipo blaster derm. Coloque el cubreobjetos en una cámara húmeda cubierta, como una placa de Petri de plástico, a 18 grados Celsius hasta que los embriones desarrollen hasta la etapa embrionaria o larval deseada.

Para embriones que han desarrollado hasta la etapa embrionaria deseada, utilice una sonda para retirar los embriones de la cinta de doble cara e impulsarlos hacia el borde del cubreobjetos. Lave los embriones con heptano hacia un vial de recolección con malla de nailon en el fondo. Lave los embriones tres veces con PB, permaneciendo cinco minutos en lejía al 50%, y luego lave nuevamente los embriones tres veces con PBT.

Transfiera los embriones desde el vial de recolección hasta un trozo de malla de nailon utilizando una pipeta; sumerja el trozo de malla de nailon en la solución fijadora. Fije los embriones durante 30 minutos. Retire la capa inferior de la solución fijadora.

Luego, fije los embriones con metanol y transfiéralos a un tubo eppendorf para realizar una inmunotinción con los anticuerpos A 12 y de difusión, utilizando protocolos estándar de tinción con anticuerpos para embriones que han desarrollado hasta la fase larval deseada. Prepare un portaobjetos con una gota de aceite de halo carbono 700 en el centro y dos cubreobjetos pequeños a cada lado de la gota de aceite. Transfiera una larva al portaobjetos y luego coloque un cubreobjetos encima de la gota de aceite.

Observe las larvas bajo un microscopio de campo claro. Aquí se muestran resultados representativos tanto de la difusión de ARN bicatenario como de la inyección de ARN bicatenario de GFP.

Los embriones inyectados con ARN bicatenario de GFP muestran fusión traqueal normal y la proteína de difusión está presente en las células de fusión. Las flechas indican las células de fusión positivas para difusión en el tronco lateral y el asterisco señala la ubicación de la fusión normal.

Sin embargo, los embriones inyectados con ARN bicatenario muestran fusión de ramas fallida y las proteínas de difusión no están presentes en las células de fusión. El triángulo indica el sitio de fusión de ramas fallida cuando los embriones inyectados con ARN bicatenario desarrollaron hasta la etapa larval. Las larvas G-F-P-R-N AI muestran fusión normal de ramas traqueales indicada por un asterisco.

Por otro lado, las larvas de RN AI de difusión demostraron fusión de ramas fallida, indicada por triángulos. Estos resultados muestran el efecto del silenciamiento de la expresión génica endógena de difusión mediante la inyección de ARN de doble cadena en embriones de Drosophila. Al intentar este procedimiento, es importante recordar eliminar todos los embriones de blaster enseal tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la función de genes novedosos en el desarrollo de órganos en drosophila. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo silenciar genes endógenos mediante la inyección de ARN bicatenario en embriones de drosophila.