Name: La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Aprende a localizar proteínas en neuroesferas tridimensionales derivadas de células progenitoras neuronales del hipocampo postnatal. Este método combina inmunotinción y reconstrucción 3D para visualizar la expresión de proteínas como Connexin 29.

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Damos las gracias a Evan Dysart y Léonard Marc de asistencia técnica especializada en la producción y edición de vídeo, Matt Cooke para la asistencia en la recolección de datos, y Sarah Gelbard por su colaboración editorial de expertos. El trabajo fue financiado por subvenciones de funcionamiento del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR, RP 62626) para SALB, una Iniciativa para la Formación Estratégica en Salud programa de becas de investigación para SALB y SF (Programa de Formación en CIHR lipidómica neurodegenerativas, TGF 9.121), y la infraestructura el apoyo de la Fundación para la Innovación de Canadá y Ontario Innovación confianza a San Francisco. SI recibió una Beca de Ontario de Posgrado en Ciencia y Tecnología con la colaboración del Consorcio de Investigación del Parkinson. NV recibe un Instituto de Envejecimiento y el Programa de Formación en CIHR lipidómica neurodegenerativas post-profesional de la comunión. Agradecemos el apoyo de software educativo y técnico de AutoDesk investigación.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Ottawa Cuidado de Animales Comité y el Consejo Canadiense de los Animales.

Este protocolo describe un procedimiento para la cultura y la serie cryosection post-natal NPCs del hipocampo, localizar la expresión de proteínas por inmunodetección, y, finalmente, reconstruir y analizar la posición topográfica de las células dentro de la inmunopositivas neuroesfera 3D completo. Mediante la combinación de la cultura de la biología celular y técnicas de procesamiento, las imágenes de microscopía (Openlab, improvisación y otros softwares de análisis de imágenes), las capacidades de software de edición gráfica (Adobe Photoshop), y la animación 3D y capacidades de composición de software (Autodesk Maya), se presenta una metodología para reconstruir el toda la composición celular de las culturas 3D de imágenes 2D de serie que permite la reconstrucción fiel de la posición de celular y expresión de la proteína a través de una cultura neuroesfera. Este protocolo se puede combinar con la misma eficacia para el registro y la reconstrucción de epifluorescencia secciones delgadas serial o confocal pilas Z-a través de las secciones más gruesas de serie. Debido a la expansión clonal de los PNJ en un solo recapitula la cultura neuroesfera muchas de las etapas observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro, el impacto de la estructura 3D representa un factor determinante de la APN destino importante en la descendencia expuesta al mismo medio experimental 1. La divergencia en el linaje y la expresión de proteínas en el núcleo y la periferia de las secciones neuroesfera serie sugiere que varios factores físicos como la posición de la celda, la tensión mecánica, y la fuerza de cizallamiento juegan un papel importante en la regulación de la biología NPC 2. Por otra parte, la expresión de la conexina proteínas, aquí analizados, se ha demostrado que el cambio, dependiendo de cuándo NPCs se cultivan como neuroesferas 3D en la suspensión o plateado sobre un sustrato de laminina funcional con la conexina la comunicación mediada alterado si las células son cultivadas en plástico y el sustrato o en 3D gratis flotante culturas 3. El impacto de la posición del móvil en el destino de la APN no está claro. Es un desafío técnico para analizar el impacto de la ubicación espacial dentro de la cultura en 3D sobre la biología de la APN, dado que la evaluación de antígenos de linaje y de proteínas de señalización requiere la interrupción de la arquitectura en 3D para permitir la permeabilización de las células y anticuerpos acceso a todas las células. Aquí mostramos que un método de visualización híbrida proporciona un medio para determinar si ciertas proteínas muestra única posición en la cultura localizaciones en 3D, se puede utilizar para inferir y prueba de función de la proteína y la regulación con respecto a la localización regional dentro de la neuroesfera, y, quizás lo más importante , proporciona los datos de posición necesarios para estudiar el impacto de la topografía en 3D y posicionamiento celular sobre el destino de la APN en la cultura en 3D.

* Todos los demás reactivos químicos estándar que figuran en el protocolo son de Sigma-Aldrich. Todos los demás reactivos de cultivo de tejidos son de Invitrogen.

la localización de la proteína en 3d cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

La importancia de tres dimensiones (3D) para influir en la topografía madre neuronales y células progenitoras (NPC) fenotipo es ampliamente reconocido todavía difíciles de estudiar. Cuando se disocian del cerebro embrionario o después del parto, los personajes solo se proliferan en la suspensión para formar neuroesferas. Células hijas dentro de estas culturas adoptan espontáneamente distintos linajes de desarrollo (neuronas, oligodendrocitos y astrocitos) en el transcurso de la expansión a pesar de estar expuesto al medio extracelular mismo. Este recapitula la progresión de muchos de los estadios observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro y se utiliza a menudo para estudiar la biología básica NPC en un entorno controlado. Evaluar el impacto completo de la topografía en 3D y posicionamiento celular dentro de estas culturas sobre el destino de la APN, sin embargo, difícil. Para localizar las proteínas diana y determinar los linajes NPC por inmunocitoquímica, de libre flotación neuroesferas se colocan sobre un sustrato o seccionado en serie. Este proceso es necesario para garantizar la permeabilización de células equivalentes y el acceso de anticuerpos a lo largo de la esfera. Como resultado, las imágenes 2D de epifluorescencia cryosections o reconstrucciones en 3D confocal de Z-pilas sólo puede proporcionar información acerca de la posición espacial de células en 3D discreta rebanadas físico o digital y no se visualiza la posición en el ámbito celular intacta. En este caso, reiterar la topografía de la cultura neuroesfera y permitir el análisis espacial de la expresión de la proteína a lo largo de toda la cultura, se presenta un protocolo para el aislamiento, la expansión, y la sección de serie de post-natal neuroesferas hipocampo adecuado para inmunodetección epifluorescencia o confocal de las proteínas diana. Connexin29 (Cx29) se analiza como un ejemplo. A continuación, utilizando un híbrido de edición gráfica y software de modelado 3D aplicado rigurosamente para mantener el detalle biológica, se describe cómo volver a montar el posicionamiento estructural en 3D de estas imágenes y mapa digital de las células marcadas en el neuroesfera completa. Esta metodología permite la visualización y análisis de la situación celular de las proteínas diana y las células a través de la topografía en 3D toda la cultura y facilitará un análisis más detallado de las relaciones espaciales entre las células a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis in vitro. Ambos Imbeault y Valenzuela han contribuido por igual y deben ser considerados comparten la primera autoría.

Aquí se describe cómo producir, expandir y immunolabel postnatal las células del hipocampo progenitoras neuronales (CPN) en tres dimensiones (3D) la cultura. A continuación, utilizando las tecnologías híbridas de visualización, se demuestra cómo las imágenes digitales de cryosections immunolabelled se puede utilizar para reconstruir y mapa de la posición espacial de las células en todo el inmunopositivas neuroesfera 3D completo.

La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

La importancia de la topografía tridimensional (3D) en la influencia sobre el fenotipo de las células madre neurales y las células progenitoras neurales (NPC) es ampliamente reconocida, aunque resulta difícil de...

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Neurociencia

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Este video muestra el desarrollo y la diferenciación de las células madre neurales humanas dentro de un andamio tridimensional. Un recubrimiento de laminina en el andamio promueve la unión celular, mientras que un medio neural libre de factor de crecimiento induce la diferenciación celular en células progenitoras neurales, que extienden sus procesos dentro de una arquitectura porosa en múltiples direcciones, formando un cultivo...

Diferenciación de células madre neuronales humanas en cultivo 3D utilizando un andamio poroso

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imágenes en vivo seguidas de seguimiento de una sola célula para monitorear la biología celular y la progresión del linaje de múltiples poblaciones neuronales. J. Vis. Exp. (2017) &lt;p style='line-height:1.799999999999999998;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;El video demuestra el proceso de preparación, obtención de imágenes y seguimiento de células madre neurales adultas en tiempo real para estudiar células madre celulares...

 Imágenes en vivo y seguimiento de una sola célula para monitorear el linaje neuronal en células madre neurales adultas

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.

Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales

El método presentado aquí utiliza micropatrones junto con imágenes cuantitativas para revelar la organización espacial dentro de los cultivos de mamíferos. La técnica es fácil de establecer en un laboratorio de biología celular estándar y ofrece un sistema manejable para estudiar el patrón in vitro.

Mapeo de la Organización Espacial Emergente de Células De mamíferos usando Micropatrones e Imágenes Cuantitativas

Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Aprende a localizar proteínas en neuroesferas tridimensionales derivadas de células progenitoras neuronales del hipocampo postnatal. Este método combina inmunotinción y reconstrucción 3D para visualizar la expresión de proteínas como Connexin 29.

La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

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