La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

Cuando se cultivan en suspensión, las células progenitoras neurales aisladas de los nichos neurogénicos del cerebro proliferan para formar neuroesferas. Aquí mostramos el aislamiento y la sección seriada de neuroesferas derivadas del hipocampo postnatal, flotantes libres, para localizar la expresión proteica dentro de la neuroesfera tridimensional. Realizaremos tinción inmunológica para una proteína de interés, en este caso, Connexin 29, seguida del ensamblaje y reconstrucción de imágenes microscópicas bidimensionales en una representación tridimensional de la neuroesfera.

La visualización de proteínas dentro del contexto de sus estructuras tridimensionales nativas, como una neuroesfera libre o un tejido, permite comprender mejor la función de las proteínas según su ubicación dentro de estas estructuras, y también permite inferir posibles reglas para proteínas con localización conocida, pero funciones desconocidas. Hola, soy Sophia Ambo del Laboratorio de Regeneración Neural de la Universidad de Ottawa. Y yo soy Nicholas Valenzuela del Carlton Immersive Media Studio de la Universidad de Carleton en Ottawa.

Hoy demostraremos cómo aislar, expandir y seccionar en serie células progenitoras neuronales posnatales derivadas del hipocampo en forma de esferas neurales. Con el fin de localizar la expresión proteica mediante inmunotinción, utilizaremos imágenes bidimensionales de secciones seriadas de esferas neurales obtenidas tras la inmunotinción para ilustrar un método de reconstrucción de la ubicación celular y proteica en la estructura tridimensional y, de este modo, evaluar la organización espacial de la expresión proteica en todo el volumen de las esferas neurales. Comencemos.

Una vez que se han recolectado los cerebros, prepárelos para colocarlos sobre el portamuestras creando una superficie plana que permita que los cerebros reposen adecuadamente. Este proceso se denomina bloqueo. Bloquee el cerebelo utilizando una cuchilla de afeitar y pinzas.

A continuación, coloque una gota de pegamento rápido sobre el portamuestras y fije el primer cerebro sobre ella, con el lado anterior hacia arriba y el lado dorsal frente a usted. Proceda de la misma manera con los otros cerebros; para el último cerebro, es recomendable colocar el lado dorsal alejado de usted, ya que el corte a veces es incompleto en esta dirección. Si ocurriera un corte incompleto, use un escalpelo para seccionar y recoger el tejido.

La velocidad es esencial en el paso de pegado, ya que los cerebros no pueden estar expuestos al aire durante mucho tiempo. Una vez que todos los cerebros están pegados, el portamuestras se coloca en el vibrátomo y el soporte se llena con LCR frío como el hielo.

Configure el vibrátomo para una frecuencia de 8,5 y una velocidad de 3,5 a 4,5. Acerque la cuchilla al LCR y configure el corte automático. Ahora cortaremos secciones de 500 micrones.

Mantenga las secciones que contengan el hipocampo. Colóquelas en un recipiente lleno de A CSF frío con hielo y deseche el resto de las secciones. Una vez recolectadas todas las secciones, proceda a la disección del hipocampo.

Utilizando un microscopio estereoscópico, solo se toma el hipocampo dorsal aproximadamente entre bgma menos 1,65 milímetros y menos 2,10 milímetros. Coloque los hipocampos en un recipiente vacío frío con hielo. Cuando se hayan recolectado todos los hipocampos de los cortes, es momento de llevarlos a la cabina de flujo laminar para la disociación mecánica.

Con un escalpelo, rocíe la hoja del escalpelo con etanol al 70% y pásela por la llama para esterilizarla. Corte el tejido con el escalpelo hasta que parezca líquido. Luego, utilizando un medio de disociación que ya contiene pepaina, ADNasa y proteasa neural, recoga el tejido mediante pipeteo y colóquelo en un tubo de 15 mililitros.

Para la disección enzimática, coloque el tubo en un horno rotatorio ajustado a 37 grados y deje que la digestión ocurra durante 45 minutos a una hora. Una vez finalizada la digestión, agregue 10 mililitros de PBS estéril para cultivo de tejidos para detener la reacción enzimática y centrifugue las células a 300 ×g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado.

En cinco mililitros de PBS, utilice una pipeta Pasteur y agite la muestra para disociar aún más el tejido. Continúe agitando hasta que los fragmentos de tejido ya no disminuyan de tamaño. En este punto, vuelva a centrifugar las células para obtener el sedimento.

Elimine el PBS y resuspenda el precipitado en tres mililitros de medio de mantenimiento. Una vez que haya tritulado bien la muestra, tome una alícuota de 15 microlitros y mézclela con un volumen igual de azul de tripano.

Tome dos muestras de 10 microlitros y cargue un hemocitómetro para el recuento celular. Cuente las células de tres campos en cada sección, para un total de seis campos. Promedie los números para calcular la densidad celular.

Teniendo en cuenta que la muestra está diluida. En la placa de azul de tripano, coloque las células en placas de baja adhesión a una densidad de 2,5 × 10⁵ células por placa en un volumen final de cinco mililitros de medio de mantenimiento. Si no hay disponibles placas de baja adhesión, puede utilizar placas de Petri.

En este caso, deberá golpear suavemente los neuroesferas por la mañana y por la tarde todos los días durante los primeros seis días para que los neuroesferas no se adhieran al fondo del recipiente. Añada EG, F y FGF antes de colocar los recipientes en el incubador. Estos factores de crecimiento deberán renovarse cada dos días durante toda la duración del cultivo. En el día 14 in vitro, fije los neuroesferas utilizando formaldehído hasta una concentración final de aproximadamente 4 %, añadiéndolo directamente al cultivo e incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Con centrifugación a 300 × g durante cinco minutos, obtener el pellet celular. Lavar las células dos veces con PBS y resuspender en una solución de sacarosa al 15-20% preparada en tampón fosfato 10 milimolar. Dejar en protección criogénica a cuatro grados durante al menos 24 horas antes de seccionar en un microtomo criostato.

Retire los neuroesferas con protección criogénica del refrigerador y colóquelas en una placa de 60 milímetros. Para el corte en serie, donde es fundamental recolectar cada sección individual, he encontrado mejor seleccionar neuroesferas de buen tamaño y forma utilizando un microscopio estereoscópico; con una pipeta, coloque una neuroesfera en un molde criogénico lleno de compuesto OCT. Marque el lugar donde se ubica la neuroesfera sobre el molde criogénico.

Este paso ayudará a localizar la neuroesfera durante el corte. Una vez que se hayan colocado cinco a diez esferas en el molde rápidamente, congélelas utilizando CO2. Utilizando las indicaciones del molde criogénico, marque directamente en el bloque de OTC congelado la ubicación de las neuroesferas.

Retire el bloque de OCT del molde y colóquelo sobre el portaobjetos del criostato. Fije el molde al portaobjetos utilizando CO2 y colóquelo en el criostato. Deje que las muestras se equilibren durante al menos 30 minutos.

Una vez hecho esto, corte rápidamente según las marcas realizadas en el molde, luego comience a recoger cada sección a partir de ese momento. Verifique dónde comienzan los cortes de la neuroesfera utilizando un microscopio óptico. Una vez completado el corte, guarde las láminas en un congelador hasta que esté listo para realizar la inmunoquímica. Para este paso, retire las láminas que contienen una de las neuroesferas cortadas en serie e incluya las láminas con cinco secciones previas y cinco secciones posteriores.

Esto garantizará que obtenga imágenes de toda la neuroesfera. Será imprescindible utilizar una tinción nuclear de contraste para localizar todas las secciones de su neuroesfera. Tenga esto en cuenta al planificar su tinción inmunohistoquímica mientras prepara los portaobjetos aplicando PBS y dejándolos calentar a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos; utilizamos un tampón de anticuerpo que contiene 0,3 % de Triton X-100 para la permeabilización y 3 % de albúmina sérica bovina para el bloqueo.

Diluya adecuadamente el anticuerpo primario en este tampón e incube en la cámara humana durante la noche a cuatro grados. Use PBS para hacer flotar el paraformo fuera de las neuroesferas y retírelo cuidadosamente con pinzas. Este es el primero de cuatro lavados con PBS de cinco minutos.

Aplique el anticuerpo secundario sobre los portaobjetos e incúbelos a temperatura ambiente durante una hora. Como antes, haga flotar el paraformo fuera del portaobjetos usando PBS y retírelo con pinzas. Nuevamente, este es el primero de cuatro lavados con PBS de cinco minutos cada uno.

En el tercer lavado, incluimos HOS 3 3 2, 5 8 como tinción nuclear de contraste, que se diluye a 0,5 microgramos por mililitro. En PBS, hay un lavado adicional de cinco minutos tras el lavado con hos. Una vez completados todos los lavados, aplique una cantidad generosa de medio de montaje en la parte inferior del portaobjetos y cúbralo con una laminilla de vidrio.

Sujete las esquinas con esmalte de uñas. Una vez que todas las laminillas estén cubiertas, asegure los bordes restantes de las cubreobjetos. Observe la laminilla inmediatamente o almacénelas a menos 20 hasta que esté listo para hacerlo.

Al realizar la imagen, encontrar las células en el portaobjetos es la parte más difícil; será fácil detectar las células pertenecientes a la esfera si las busca utilizando la tinción nuclear de contraste. Una vez que encuentre el inicio de la neuroesfera, que puede constar de solo unas pocas células, capture imágenes de cada corte a partir de ese momento. Tome fotografías de la tinción nuclear, de su proteína o proteínas de interés y una imagen de contraste de fase.

Esta imagen de contraste de fases será muy importante en las etapas de modelado. Se importan imágenes con barras de escala integradas de 10 micrómetros y 50 micrómetros, establecidas en el software Open Lab 3.56, a Photoshop CS4 utilizando un tamaño de lienzo estándar de 3.300 por 2.550 píxeles.

Todas las imágenes de secciones seriadas se guardan como archivos TIFF manteniendo el tamaño estándar del lienzo. Abra las imágenes de contraste de la primera y segunda fase de las secciones seriadas de neuroesferas. Aumente la transparencia de la segunda sección en la pestaña de imagen, abra la rotación de imagen y elija arbitrario.

Gire la segunda sección hasta poder identificar puntos de continuidad geométrica y estructural entre las imágenes. Repita este procedimiento para todas las secciones seriadas, guardando cada sección como una capa independiente. Asegúrese de que cada capa de imagen correspondiente a la fase y a la expresión proteica esté vinculada, de modo que todas las rotaciones para cada canal se realicen simultáneamente.

Cree un plano en Maya que tenga las mismas proporciones que el archivo de Photoshop, según la línea de estado de la interfaz de usuario de Maya. Cambie la barra de menú desde su configuración predeterminada de animación a superficies. Utilice una esfera de subdivisión primitiva para crear el cuerpo celular con la esfera seleccionada.

Comience a manipular sus vértices haciendo clic derecho con el botón del ratón sobre el objeto y seleccionando vértice en el menú marcado. Además, refine la superficie de la esfera cambiando el nivel de visualización en el menú marcado, desde la pestaña de superficies de subdivisión del menú principal. Abra el cuadro de opciones de colapso de jerarquía y establezca el número de niveles en dos.

Colapse la esfera. Cambie la barra de menú de superficies a polígonos con la esfera seleccionada. Abra la herramienta de geometría de escultura desde la pestaña de malla en el menú principal.

Perfeccione la superficie de la célula hasta su forma final. Utilice el conjunto de herramientas de escultura de geometría desde la pestaña de configuración de herramientas. Repita este proceso para cada célula de su tipología con el fin de simular la variedad de células progenitoras presentes en las neuroesferas.

En esta demostración, 10 células progenitoras diferentes formarán la base de la neuroesfera. Seleccione la tipología celular y congele las transformaciones con las células de su tipología. Se diseñarán dos sombreadores de superficie para representar tanto las células que expresan la proteína conectina en 29 como las células en las que la proteína está ausente.

Abra la ventana de sombreado hiper del menú principal, en la pestaña del editor de renderizado de ventanas. Elija un shader de rampa en la pestaña de materiales de superficie. Abra el editor de atributos y configure los atributos de color del shader, color ambiental incandescente, mapa de relieve y color especular.

Asigne una textura 3D de tipo Brownian al nodo de color ambiental y una textura fractal 2D al nodo de mapeado de relieve. Seleccione las conexiones de entrada y salida del sombreador resultante y exporte la red seleccionada. Seleccione la tipología celular y abra el cuadro de opciones de exportación de la selección.

Seleccione el tipo de archivo Maya A-S-C-I-I y desmarque la casilla de exportación de selección incluir estas entradas. Abra el archivo de secciones seriadas alineadas en Adobe Photoshop. Establezca una clave de trazos de lápiz para marcar la ubicación de cada célula progenitora en las secciones seriadas.

En esta demostración, se utilizará una clave de tres trazos. Un cuadrado sólido, un cuadrado con una línea discontinua y un cuadrado con una cruz indicarán si una célula se encuentra en una, dos o tres secciones.

Esta clave de trazos se define además mediante el color rojo que representa las células que expresan la conexina 29 y el blanco que representa las células que no expresan la conexina 29. Active la capa de fase e inicie el marcado del centro de cada célula progenitora con un trazo de lápiz blanco. Utilice una capa separada dentro de la carpeta de la sección para crear sus mapas.

Alterne entre secciones para localizar la posición de la célula, asegurándose de que las células presentes en más de una sección se indiquen correctamente. Con la capa CX 29 activada, seleccione las células que se encuentran en las regiones donde CX 29 se expresa positivamente.

Seleccione el comando de relleno desde la pestaña de edición en la barra de menú principal de Photoshop y cambie los trazos blancos a rojo una vez completados los mapas. Guarde cada sección como una imagen JPEG independiente en la carpeta de imágenes fuente del proyecto Maya. Para ello, primero deberá crearse un nuevo proyecto Maya desde la línea de estado de la interfaz de usuario de Maya.

Cambie la barra de menú desde su configuración de animación predeterminada a polígonos e importe los planos. Importe los archivos ma y la barra de escala. Archivos ma desde la carpeta de proyectos vistos con el plano seleccionado.

Asigne un shader Lambert haciendo clic con el botón derecho del ratón sobre el objeto y abriendo la pestaña asignar nuevo material en el editor de atributos. Haga clic en el cuadro cuadriculado a la derecha del atributo de color del material en el menú emergente. Elija archivo en la sección de textura 2D bajo la sección de atributo de archivo en el editor de atributos.

Haga clic en el icono de archivo a la derecha del atributo de nombre de la imagen. Elija la primera sección de la carpeta de imágenes de origen. Cambie la cámara de la ventana del área de trabajo de la vista perspectiva a la vista superior ortográfica predeterminada abriendo la pestaña de ese panel.

Seleccione la herramienta crear polígono en la pestaña de malla del menú principal y trace el contorno de la sección. Elija el primer mapa de la carpeta de imágenes de origen y asígnelo al plano de polígono recién creado. Después de seguir los pasos establecidos para crear el plano de polígono con el objeto seleccionado, elija UV en el menú contextual haciendo clic con el botón derecho del ratón sobre el plano.

Seleccione todos los puntos UV de los planos y abra el editor de texturas UV desde la pestaña ventanas del menú principal; luego, escale los UV proporcionalmente para ajustarlos al plano de la sección. Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera, asegurándose de que los espacios entre cada sección correspondan a la altura de la barra de escala de la línea de estado de la interfaz de usuario de Maya. Cambie la barra de menús desde su configuración predeterminada de animación a dinámica, dejando visible únicamente la primera sección de la neuroesfera.

Oculte todas las demás secciones cambiando la configuración de visualización desde la pestaña de visualización del menú principal con el cuadro de opciones de herramientas de curva CV abierto; seleccione una opción lineal en la configuración de la curva CV. Viendo la escena desde la cámara de vista superior, comience a asignar puntos a los mapas celulares, creando una curva para las células CX 29 negativas y otra para las células CX 29 positivas. Las curvas resultantes son planas cuando se observan desde la cámara de vista lateral.

Aproxime el grosor de las secciones desplazando los puntos de la curva en el eje Y, utilizando la barra de escala como guía. Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera.

Importe el archivo de tipología celular ma desde la carpeta de escenas del proyecto y duplique la tipología celular para ambos progenitores, CX 29 negativo y CX 29 positivo. Abra la ventana de hipersombreado desde la pestaña editores de renderizado de ventanas del menú principal.

Importe los sombreadores creados previamente asignándolos a las celdas de la tipología desde la ventana de estructura. Elimine el nombre del archivo al comienzo de los objetos importados. Esto será importante en etapas posteriores del proceso de modelado.

Seleccione la pestaña de partículas en el menú principal y cree un emisor de partículas para la primera curva CV. Abra la pestaña de forma de partícula uno y, en los atributos de emisión, cambie el valor máximo de recuento de menos uno al número de puntos de su primera curva. En la pestaña de atributos de renderizado, cambie el tipo de renderizado de partículas a superficie tipo blob.

Haga clic en el cuadro del tipo de renderizado actual que aparece a continuación y cambie el radio de las partículas a 0,01. Asocie las partículas a los vértices de la curva seleccionando primero las partículas y luego manteniendo pulsada la tecla Mayús mientras selecciona la curva.

Abra las opciones de objetivo desde la pestaña de partículas del menú principal y establezca el peso del objetivo en uno. Haga clic en crear. Seleccione las celdas del número uno al 10 en orden en la ventana de esquema y abra el cuadro de opciones de reemplazo instantáneo desde la pestaña de partículas del menú principal.

En el cuadro de objetos de instancia, deben aparecer listadas las 10 celdas en orden. Seleccione el nombre correcto de la forma de la partícula en la lista desplegable de la pestaña de objeto de partícula para instanciar. Haga clic en crear. Por defecto, solo la primera celda seleccionada reemplazará a las partículas a lo largo de la curva; para que aparezcan las 10 y se alternen aleatoriamente entre las partículas, se necesita una expresión.

Una segunda expresión garantizará que las células emitan de forma aleatoria de la misma manera cada vez. Se reposiciona el control deslizante de rango con el emisor seleccionado. Abra el editor de atributos en la pestaña de forma de partícula, en Añadir atributo dinámico.

Haga clic en el cuadro general bajo el nombre largo. Escriba un índice con guion bajo aleatorio en el tipo de atributo, cambie de matriz escalar a matriz por partícula y pulse agregar en la pestaña de atributos de matriz por partícula. Se ha agregado un cuadro de índice con guion bajo aleatorio.

Haga clic con el botón derecho del ratón sobre el espacio vacío y seleccione crear expresión en el cuadro desplegable. Escriba el siguiente texto en el cuadro de expresión para completarla. Abra la pestaña de reemplazo rápido de geometría en el editor de atributos y en el índice de objetos de opciones generales.

Seleccione un índice aleatorio de la lista desplegable. Lleve el control deslizante de tiempo al primer fotograma y presione reproducir. Ahora los tipos celulares están distribuidos aleatoriamente entre las partículas.

Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera. Asegúrese de que cada nueva instancia de emisor y cada índice aleatorio se diferencien por nombre y estén organizados adecuadamente en la ventana de esquema del renderizado. En la sección de la ventana de configuración de renderizado, cambie el renderizado de Maya Software a Mental Ray.

Abra la pestaña de calidad y, en ray tracing, cambie la configuración de reflexión a cero. Abra la pestaña de buffer de fotogramas y cambie el recorte de color de crudo a alfa y desactive la casilla Pre multiplicar.

Abra el editor de capas del cuadro de canales y cambie la configuración del editor de capas de visualización a renderizado. Seleccione las células importadas de la tipología y haga clic en el icono crear nueva capa y asignar objetos seleccionados. Cambie el nombre de la capa a oclusión ambiental.

Haga clic con el botón derecho del ratón sobre la capa recién creada y seleccione atributos en el menú a la derecha del cuadro de capa de renderizado. Haga clic en el botón de preajustes y seleccione oclusión en la lista desplegable. Seleccione la pestaña MIB_amb_occlusion1 y cambie las muestras de 16 a 256.

Vuelva a abrir el editor de capas del cuadro de canales y, en la pestaña de opciones, abra el cuadro de opciones de renderizar todas las capas, seleccione composición y mantenga las capas con la capa de oclusión ambiental seleccionada. Cambie de normal a multiplicar en el cuadro desplegable justo encima de la lista de capas, renderice dos pases de la neuroesfera, una vez con la capa de oclusión ambiental activada y otra con la capa maestra activada. Guarde las imágenes como archivos IFF en la carpeta de imágenes del proyecto.

Abra ambas imágenes en Adobe Photoshop. Coloque la capa de oclusión ambiental encima de la capa maestra y ajústela a multiplicar. Cree un fondo y aplane la imagen.

Acabamos de mostrarle cómo cultivar. Células neurogénicas derivadas del hipocampo como neuroesferas, cómo seccionar en serie cultivos de neuroesferas utilizando un criostato y cómo realizar tinción inmunohistoquímica para una proteína de interés. También le hemos mostrado cómo modelar la ubicación espacial de la expresión de esa proteína en tres dimensiones mediante una combinación de cultivo celular, registro y software de modelado tridimensional.

Esperamos que esto les sea útil y les deseamos éxito en sus experimentos.