Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Soy Troy Gasai. Vamos a hablar de un ensayo de corte organotípico que se ha perfeccionado en mi laboratorio durante los últimos años. Ben jacket en mi laboratorio le demostrará cómo se realiza este ensayo.

El ensayo de corte organotípico del cerebro postnatal es un método poderoso para probar varios factores y el papel en la migración neuronal en el cerebro postnatal y el flujo migratorio TRO. Hola, soy Ben Jakay. Soy becario postdoctoral en el laboratorio del Dr. Troy gge en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte, y estoy aquí hoy para mostrarles cómo realizamos el trasplante cruzado de tejido entre cortes de cerebro de ratón organotípicos para visualizar la migración del neuroblasto en el cerebro postnatal.

Todas las técnicas descritas en este video deben realizarse en un ambiente estéril, preferiblemente una campana de flujo laminar con herramientas esterilizadas. Se coloca una gota de 150 microlitros de medio para rebanadas en el centro del vaso, parte inferior del plato con una jeringa desechable equipada con una aguja de calibre 23. Se colocan varios puntos de pegamento fuera del cubreobjetos circulares del fondo de vidrio mientras se deja un lado sin pegar para el intercambio de fluidos A.A continuación, se coloca suavemente una membrana de poros nucleares sobre el medio con micropinzas, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de la membrana.

A continuación, se utilizan las pinzas curvas para aplanar los puntos de pegamento y asegurar la membrana en su lugar. Se agrega un mililitro de medio de rebanada en la parte superior de la membrana y, finalmente, los platos se colocan en una incubadora hasta que estén listos para usar. Los mejores resultados se obtienen cuando se preparan cortes de ratones jóvenes postnatales, primero de P uno a P diez, la cabeza se estabiliza sosteniendo el hocico con micro pinzas.

La piel se extirpa longitudinalmente desde el cuello hasta el hocico. El cuero cabelludo se despega para exponer el hueso y el cráneo se corta longitudinal y anteriormente comenzando en el esternón magna haciendo un corte medial y dos laterales, uno a cada lado. Se debe tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido cortical subyacente.

A medida que los colgajos craneales se retiran lejos del cerebro para mejorar la estabilidad del tejido. Durante el corte del vibram, se extirpan los aspectos más lateral y codal del cerebro con una cuchilla de afeitar. Los dos hemisferios se extraen cuidadosamente del cráneo y se colocan en la superficie medial hacia abajo en un molde de inclusión.

Se cubren inmediatamente con gel de rosas AGA derretido al 3% de grado de ADN disuelto en un tampón de preparación de tejidos que se mantiene a 37 grados centígrados. Después de dos minutos de estabilización sobre una superficie horizontal plana. Para asegurar un endurecimiento uniforme de las rosas aga, los moldes se colocan sobre hielo para completar el fraguado.

Una vez que el gel que contiene los hemisferios está fijado, se retira del molde y se recorta alrededor del tejido cerebral. A continuación, el tejido incrustado en gel se monta en el disco de muestra del tono vibratorio con una superficie medial hacia arriba y se asegura con adhesivo de cianoacrilato. A continuación, el disco se instala en la bandeja de muestras de vibración llena de medio de preparación de tejido helado y se secciona el cerebro con un grosor de 150 micrómetros.

Una vez que las rodajas que contienen RMS se liberan de la hoja, se sacan cuidadosamente con una pequeña espátula de cabeza plana y se colocan planas en el centro de los platos de cultivo. Es fundamental que la manipulación de las rodajas se mantenga al mínimo, ya que el tejido es muy frágil. La cantidad de medio en las placas de cultivo se ajusta al nivel suficiente para cubrir las secciones del cerebro y evitar que se muevan.

Las placas se etiquetan y se transfieren a una incubadora. Los cerebros de los donantes se preparan de una manera similar a la de los cerebros de los receptores, excepto que las secciones se cortan a 250. El grosor del micrómetro y las rodajas se recogen en hielo.

Preparación de pañuelos fríos. Los cortes de tampón se colocan inmediatamente bajo un microscopio de disección con capacidad de epifluorescencia. El RMS es visible como una estructura gris en forma de U que se extiende desde la zona subependimaria hasta el bulbo olfatorio.

El RMS se microdisecciona suavemente con micropinzas. Una pinza se usa para estabilizar la rebanada, mientras que la otra se usa para hacer pequeños cortes alrededor del RMS hasta que se libera de la rebanada. A continuación, el RMS extirpado se corta en pequeños x explan, de aproximadamente 200 a 500 micrómetros de diámetro.

En este ejemplo, las berenjenas se preparan a partir de ratones que expresan la proteína fluorescente roja, el vidrio de tomate TD. Las placas inferiores que contienen rodajas del huésped se retiran de la incubadora y se colocan bajo el microscopio de disección con luz visible. Se realiza una pequeña incisión en el segmento inicial del RMS y, utilizando una pipeta equipada con una punta de 20 microlitros, se transfiere un solo donante RMS Explan al sitio inciso en el RMS del huésped.

El explan se empuja suavemente en la incisión para establecer contacto entre los dos tejidos. Para asegurar que este contacto sea estable, los explan se empujan ligeramente entre el corte y la membrana nuclear pobre. Luego, las placas se devuelven a la incubadora durante al menos una hora para permitir que las secciones se asienten en la membrana.

Neuroblast debería comenzar a migrar del explan al RMS del host después de aproximadamente una o dos horas. La migración de células se visualiza mejor mediante el uso de objetivos de potencia de distancia de trabajo extra larga de 20. Los tejidos cultivados se transfieren de la incubadora a una cámara de incubación en el microscopio.

Las imágenes de los neuroblastos fluorescentes se pueden obtener a intervalos que van de cero a 10 minutos, dependiendo del tipo de análisis deseado. Nuestro protocolo de cultivo de rebanadas típicas orgánicas ha sido probado y optimizado minuciosamente en los últimos años para garantizar la consistencia en el patrón de migración y la orientación en el RMS. En este ejemplo, el análisis de células que emigran de explan, obtenidas de ratones en los que el tomate TD se expresa bajo el nido en el promotor, revela una migración altamente orientada y rápida hacia el huésped RMS.

Gran aumento. El análisis de lapso de tiempo muestra una excelente resolución de toda la longitud de un neuroblasto migratorio durante una sesión de imágenes de 20 minutos. Una vez que se completan las imágenes, se fijan las rodajas de piel con hielo, frías y recién preparadas, 4% de paraforma, aldehído e inmunotinción para los diferentes componentes del flujo de migración.

En este caso, los astrocitos GFAP positivos en azul y los vasos sanguíneos CD 31 positivos en verde se revelan mediante inmunohistoquímica fluorescente, el análisis de alta ampliación de cortes teñidos para las proteínas del citoesqueleto actina en azul y tubulina en verde revela una expresión no uniforme de estos componentes por parte de una célula. En medio de la migración. Nuestro protocolo presenta algunos desafíos que requieren paciencia, práctica y tiempo comprometido tanto en la preparación como en el análisis de sus resultados.

Así que aquí tienes algunas sugerencias útiles que te ayudarán a obtener los mejores resultados de tus experimentos. En nuestra experiencia, los ratones en el rango de edad de P 1 a P 10 proporcionan los mejores resultados. La coincidencia de edad entre los cerebros del donante y del receptor también mejora la reproducibilidad de los experimentos.

Dado que la mayoría de los reactivos y placas de cultivo deben estar recién preparados, nuestro ensayo de corte requiere varias horas de preparación ininterrumpida y obtención de imágenes en un solo día. Una vez que se cosechan los cerebros, los pasos posteriores deben lograrse lo más rápido posible. Entre la decapitación y la preparación de los cortes, todos los pasos deben realizarse con hielo, reactivos fríos y la manipulación de los tejidos debe reducirse al mínimo para evitar alteraciones anatómicas.

Las herramientas utilizadas para estas disecciones deben ser estériles y reservadas solo para manipulaciones de tejido vivo. Nunca utilice herramientas que hayan estado en contacto con fijadores como el formaldehído. Los cortes son generalmente viables hasta por 36 horas con una disminución visible en la migración, la velocidad y la orientación entre 24 y 36 horas.

Tenga cuidado con esta limitación cuando planifique sus experimentos y análisis.