Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Soy Troy Gasai. Vamos a hablar sobre un ensayo de corte organotípico que se ha perfeccionado en mi laboratorio durante los últimos años. Ben Jacket, de mi laboratorio, les demostrará cómo se realiza este ensayo.

El ensayo de corte organotípico del cerebro posnatal es un método potente para evaluar diversos factores y su papel en la migración neuronal en el cerebro posnatal y en la corriente migratoria TRO. Hola, soy Ben Jakay, investigador posdoctoral en el laboratorio del Dr. Troy GGE en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte, y hoy estoy aquí para mostrarles cómo realizamos trasplantes cruzados de tejido entre cortes cerebrales organotípicos de ratón con el fin de visualizar neuroblastos migratorios en el cerebro posnatal.

Todas las técnicas descritas en este video deben realizarse en un entorno estéril, preferiblemente en una cabina de flujo laminar utilizando instrumentos esterilizados. Se coloca una gota de 150 microlitros de medio para cortes en el centro de la parte inferior de vidrio del recipiente, utilizando una jeringa desechable equipada con una aguja de calibre 23. Se aplican varios puntos de adhesivo en la periferia del cubreobjetos circular de vidrio, dejando un lado sin pegar para permitir el intercambio de fluido. Luego, se coloca suavemente una membrana de poros nucleares encima del medio utilizando pinzas microquirúrgicas, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de la membrana.

Las pinzas curvas se utilizan entonces para aplanar los puntos de pegamento y asegurar la membrana en su lugar. Se añade un mililitro de medio para cortes encima de la membrana, y finalmente, los cultivos se colocan en un incubador hasta que estén listos para su uso. Los mejores resultados se obtienen cuando los cortes se preparan a partir de ratones posnatales jóvenes, desde P1 hasta P10. En primer lugar, se estabiliza la cabeza sujetando el hocico con pinzas microscópicas.

La piel se excisa longitudinalmente desde el cuello hasta la nariz. El cuero cabelludo se separa para exponer el hueso y el cráneo se corta longitudinal y anteriormente, comenzando en la apófisis espinosa por medio de un corte medial y dos cortes laterales, uno en cada lado. Se debe tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido cortical subyacente.

Mientras se retiran las láminas craneales del cerebro para mejorar la estabilidad del tejido. Durante el corte con vibrátomo, se eliminan los aspectos laterales y caudales del cerebro con una cuchilla de afeitar. Los dos hemisferios se extraen cuidadosamente del cráneo y se colocan con la superficie medial hacia abajo en un molde de inclusión.

Se cubren inmediatamente con gel de AGA roses al 3% grado ADN fundido, disuelto en tampón de preparación de tejidos que se mantiene a 37 grados Celsius. Después de dos minutos de estabilización sobre una superficie horizontal plana. Para asegurar un endurecimiento uniforme del AGA roses, los moldes se colocan sobre hielo para completar la solidificación.

Una vez que el gel que contiene los hemisferios ha solidificado, se retira del molde y se recorta alrededor del tejido cerebral. Luego, el tejido embebido en gel se monta sobre el disco de muestra del vibrátomo con la superficie medial hacia arriba y se fija con adhesivo de cianoacrilato. A continuación, el disco se instala en la bandeja de muestra del vibrátomo, que está llena de medio de preparación de tejidos frío con hielo, y el cerebro se secciona con un grosor de 150 micrómetros.

Una vez que los cortes que contienen la ZMS son liberados de la cuchilla, se recogen cuidadosamente con una espátula plana pequeña y se colocan horizontalmente en el centro de las placas de cultivo. Es fundamental minimizar el manejo de los cortes, ya que el tejido es muy frágil. La cantidad de medio en las placas de cultivo se ajusta a un nivel suficiente para cubrir las secciones cerebrales, evitando que se muevan.

Las placas se etiquetan y se transfieren a una incubadora. Los cerebros de los donantes se preparan de manera similar a la de los cerebros receptores, excepto que los cortes se realizan con un grosor de 250 micrómetros y las secciones se recogen en hielo.

Preparación de tejido frío. Los cortes de tejido se colocan inmediatamente bajo un microscopio estereoscópico con capacidad de fluorescencia epiluminiscente. La RMS es visible como una estructura en forma de U de color gris que se extiende desde la zona subependimaria hasta el bulbo olfatorio.

El SMS se microdisecciona suavemente utilizando pinzas microquirúrgicas. Una pinza se utiliza para estabilizar el corte mientras que la otra se emplea para realizar pequeños cortes alrededor del SMS hasta que se libera del corte. El SMS extirpado luego se corta en pequeños explantes de aproximadamente 200 a 500 micrómetros de diámetro.

En este ejemplo, se preparan explantes de ratones que expresan la proteína fluorescente roja, TD tomate vítreo. Los cultivos inferiores que contienen cortes hospedadores se retiran del incubador y se colocan bajo el microscopio estereoscópico utilizando luz visible. Se realiza una pequeña incisión en el segmento inicial de la RMS y, mediante una pipeta equipada con una punta de 20 microlitros, se transfiere un único explante de RMS donante al sitio incisionado en la RMS del hospedador.

El explante se introduce suavemente en la incisión para establecer el contacto entre los dos tejidos. Para asegurar que este contacto sea estable, los explantes se introducen ligeramente entre la sección y la membrana pobre en núcleos. A continuación, las placas se devuelven al incubador durante al menos una hora para permitir que las secciones se asienten sobre la membrana.

Los neuroblastos deben comenzar a migrar desde el explante hacia la RMS del huésped después de aproximadamente una a dos horas. La migración celular se visualiza mejor utilizando objetivos de 20 aumentos con distancia de trabajo extra larga. Los tejidos cultivados se transfieren desde el incubador a una cámara incubada sobre el microscopio.

Los neuroblastos fluorescentes pueden ser observados en intervalos que van desde cero hasta 10 minutos, dependiendo del tipo de análisis deseado. Nuestro protocolo de cultivo de explantes orgánicos ha sido rigurosamente probado y optimizado durante los últimos años para lograr consistencia en el patrón y la orientación de la migración en la RMS. En este ejemplo, el análisis de células que emigran desde el explante, obtenido de ratones en los que se expresa el tomate rojo fluorescente (TD-tomato) bajo el promotor de nestina, revela una migración altamente orientada y rápida hacia la RMS del hospedador.

Alto aumento. El análisis de lapso de tiempo muestra una excelente resolución de toda la longitud de un neuroblasto migrante durante una sesión de imágenes de 20 minutos. Una vez finalizada la adquisición de imágenes, los cortes pueden fijarse con paraformaldehído al 4 %, recién preparado y frío con hielo, e inmunotincionarse para diferentes componentes del torrente de migración.

En este caso, los astrocitos positivos para GFAP en azul y los vasos sanguíneos positivos para CD31 en verde se revelan mediante inmunohistoquímica fluorescente; el análisis de alta magnificación de cortes teñidos para las proteínas del citoesqueleto actina en azul y tubulina en verde revela una expresión no uniforme de estos componentes por parte de una célula en plena migración. Nuestro protocolo presenta algunos desafíos que requieren paciencia, práctica y tiempo dedicado tanto a la preparación como al análisis de los resultados.

Aquí hay algunas sugerencias útiles que le ayudarán a obtener los mejores resultados en sus experimentos. Según nuestra experiencia, los ratones en el rango de edad de P uno a P 10 proporcionan los mejores resultados. La coincidencia de edad entre los cerebros donantes y receptores también mejora la reproducibilidad de los experimentos.

Dado que la mayoría de los reactivos y placas de cultivo deben prepararse frescos, nuestro ensayo con secciones requiere varias horas de preparación ininterrumpida y adquisición de imágenes en un solo día. Una vez que se extraen los cerebros, los pasos consecuentes deben realizarse lo más rápidamente posible. Entre la decapitación y la preparación de las secciones, todos los pasos deben realizarse utilizando hielo y reactivos fríos, y la manipulación del tejido debe mantenerse al mínimo para evitar alteraciones anatómicas.

Las herramientas utilizadas para estas disecciones deben ser estériles y reservarse exclusivamente para manipulaciones de tejido vivo. Nunca utilice herramientas que hayan estado en contacto con fijadores como el formaldehído. Los fragmentos generalmente son viables hasta 36 horas, con un declive visible en la migración, velocidad y orientación entre las 24 y las 36 horas.

Tenga cuidado con esta limitación al planificar sus experimentos y análisis.