Name: Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende un ensayo de cortes organotípicos optimizado para el cerebro postnatal que permite visualizar la migración de neuroblastos mediante trasplante cruzado de tejido entre cortes de cerebro de ratón.

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Damos las gracias a Dan McWhorter para narrar el protocolo en el video. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención 5R01NS062182, una beca de la Federación Americana para la Investigación sobre el Envejecimiento, y los fondos institucionales otorgados a HTG.

<ol><li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+adult+brain%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
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<li>Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polysialic+acid+in+migration+of+olfactory+bulb+interneuron+precursors+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone.</a> Neuron. 16, 735-743 (1996).</li>
<li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li>
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<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Polleux, F. &amp, Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li>
<li>Murase, S. &amp, Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
<li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li>
<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por North Carolina State University y su Facultad de Medicina Veterinaria. No hay conflictos de interés declarado.

La migración neuronal en el RMS es un componente esencial de la neurogénesis postnatal en los bulbos olfatorios 1. La migración a través de la RMS se produce en un plano tangente a la superficie del cerebro. Neuroblastos tangencialmente la migración son diferentes de forma radial migración de las células basadas en la ubicación de la fuente de progenitores, así como el destino divergente de sus productos finales neuronal 1, 2, 3. La población relativamente pura de células que migran tangencialmente...

un ensayo cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogénesis en el cerebro postnatal depende del mantenimiento de los tres eventos biológicos: la proliferación de las células progenitoras, la migración de los neuroblastos, así como la diferenciación y la integración de nuevas neuronas en circuitos neuronales ya existentes. Para la neurogénesis postnatal en los bulbos olfatorios, estos eventos están separados en tres áreas anatómicamente diferentes: la proliferación en gran medida se produce en la zona subependimaria (ZEE) de los ventrículos laterales, la migración de los neuroblastos recorrer a través de la corriente migratoria rostral (RMS), y las nuevas neuronas se diferencian y integrar dentro de los bulbos olfatorios (OB). Los tres dominios de servir como plataformas ideales para estudiar los mecanismos celulares, moleculares y fisiológicos que regulan cada uno de los eventos biológicos claramente. Este artículo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el tejido cerebral post-natal, en el que las condiciones extracelular imitan el ambiente in vivo para la migración de los neuroblastos. Se demuestra que nuestro ensayo permite el movimiento uniforme, orientado y rápida de los neuroblastos en el RMS. Este ensayo será muy adecuado para el estudio de la regulación de las células autónomas y no autónomas de la migración neuronal mediante el uso de trasplante cruzado enfoques de ratones en diferentes fondos genéticos.

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

La neurogénesis en el cerebro postnatal depende del mantenimiento de tres eventos biológicos: la proliferación de células progenitoras, la migración de neuroblastos, así como...

Soy Troy Gasai. Vamos a hablar sobre un ensayo de corte organotípico que se ha perfeccionado en mi laboratorio durante los últimos años. Ben Jacket, de mi laboratorio, les demostrará cómo se realiza este ensayo.El ensayo de corte organotípico del cerebro posnatal es un método potente para evaluar diversos factores y su papel en la migración neuronal en el cerebro posnatal y en la corriente migratoria TRO. Hola, soy Ben Jakay, investigador posdoctoral en el laboratorio del Dr. Troy GGE en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte, y hoy estoy aquí para mostrarles cómo realizamos trasplantes cruzados de tejido entre cortes cerebrales organotípicos de ratón con el fin de visualizar neuroblastos migratorios en el cerebro posnatal.Todas las técnicas descritas en este video deben realizarse en un entorno estéril, preferiblemente en una cabina de flujo laminar utilizando instrumentos esterilizados. Se coloca una gota de 150 microlitros de medio para cortes en el centro de la parte inferior de vidrio del recipiente, utilizando una jeringa desechable equipada con una aguja de calibre 23. Se aplican varios puntos de adhesivo en la periferia del cubreobjetos circular de vidrio, dejando un lado sin pegar para permitir el intercambio de fluido. Luego, se coloca suavemente una membrana de poros nucleares encima del medio utilizando pinzas microquirúrgicas, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de la membrana.Las pinzas curvas se utilizan entonces para aplanar los puntos de pegamento y asegurar la membrana en su lugar. Se añade un mililitro de medio para cortes encima de la membrana, y finalmente, los cultivos se colocan en un incubador hasta que estén listos para su uso. Los mejores resultados se obtienen cuando los cortes se preparan a partir de ratones posnatales jóvenes, desde P1 hasta P10. En primer lugar, se estabiliza la cabeza sujetando el hocico con pinzas microscópicas.La piel se excisa longitudinalmente desde el cuello hasta la nariz. El cuero cabelludo se separa para exponer el hueso y el cráneo se corta longitudinal y anteriormente, comenzando en la apófisis espinosa por medio de un corte medial y dos cortes laterales, uno en cada lado. Se debe tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido cortical subyacente.Mientras se retiran las láminas craneales del cerebro para mejorar la estabilidad del tejido. Durante el corte con vibrátomo, se eliminan los aspectos laterales y caudales del cerebro con una cuchilla de afeitar. Los dos hemisferios se extraen cuidadosamente del cráneo y se colocan con la superficie medial hacia abajo en un molde de inclusión.Se cubren inmediatamente con gel de AGA roses al 3% grado ADN fundido, disuelto en tampón de preparación de tejidos que se mantiene a 37 grados Celsius. Después de dos minutos de estabilización sobre una superficie horizontal plana. Para asegurar un endurecimiento uniforme del AGA roses, los moldes se colocan sobre hielo para completar la solidificación.Una vez que el gel que contiene los hemisferios ha solidificado, se retira del molde y se recorta alrededor del tejido cerebral. Luego, el tejido embebido en gel se monta sobre el disco de muestra del vibrátomo con la superficie medial hacia arriba y se fija con adhesivo de cianoacrilato. A continuación, el disco se instala en la bandeja de muestra del vibrátomo, que está llena de medio de preparación de tejidos frío con hielo, y el cerebro se secciona con un grosor de 150 micrómetros.Una vez que los cortes que contienen la ZMS son liberados de la cuchilla, se recogen cuidadosamente con una espátula plana pequeña y se colocan horizontalmente en el centro de las placas de cultivo. Es fundamental minimizar el manejo de los cortes, ya que el tejido es muy frágil. La cantidad de medio en las placas de cultivo se ajusta a un nivel suficiente para cubrir las secciones cerebrales, evitando que se muevan.Las placas se etiquetan y se transfieren a una incubadora. Los cerebros de los donantes se preparan de manera similar a la de los cerebros receptores, excepto que los cortes se realizan con un grosor de 250 micrómetros y las secciones se recogen en hielo.Preparación de tejido frío. Los cortes de tejido se colocan inmediatamente bajo un microscopio estereoscópico con capacidad de fluorescencia epiluminiscente. La RMS es visible como una estructura en forma de U de color gris que se extiende desde la zona subependimaria hasta el bulbo olfatorio.El SMS se microdisecciona suavemente utilizando pinzas microquirúrgicas. Una pinza se utiliza para estabilizar el corte mientras que la otra se emplea para realizar pequeños cortes alrededor del SMS hasta que se libera del corte. El SMS extirpado luego se corta en pequeños explantes de aproximadamente 200 a 500 micrómetros de diámetro.En este ejemplo, se preparan explantes de ratones que expresan la proteína fluorescente roja, TD tomate vítreo. Los cultivos inferiores que contienen cortes hospedadores se retiran del incubador y se colocan bajo el microscopio estereoscópico utilizando luz visible. Se realiza una pequeña incisión en el segmento inicial de la RMS y, mediante una pipeta equipada con una punta de 20 microlitros, se transfiere un único explante de RMS donante al sitio incisionado en la RMS del hospedador.El explante se introduce suavemente en la incisión para establecer el contacto entre los dos tejidos. Para asegurar que este contacto sea estable, los explantes se introducen ligeramente entre la sección y la membrana pobre en núcleos. A continuación, las placas se devuelven al incubador durante al menos una hora para permitir que las secciones se asienten sobre la membrana.Los neuroblastos deben comenzar a migrar desde el explante hacia la RMS del huésped después de aproximadamente una a dos horas. La migración celular se visualiza mejor utilizando objetivos de 20 aumentos con distancia de trabajo extra larga. Los tejidos cultivados se transfieren desde el incubador a una cámara incubada sobre el microscopio.Los neuroblastos fluorescentes pueden ser observados en intervalos que van desde cero hasta 10 minutos, dependiendo del tipo de análisis deseado. Nuestro protocolo de cultivo de explantes orgánicos ha sido rigurosamente probado y optimizado durante los últimos años para lograr consistencia en el patrón y la orientación de la migración en la RMS. En este ejemplo, el análisis de células que emigran desde el explante, obtenido de ratones en los que se expresa el tomate rojo fluorescente (TD-tomato) bajo el promotor de nestina, revela una migración altamente orientada y rápida hacia la RMS del hospedador.Alto aumento. El análisis de lapso de tiempo muestra una excelente resolución de toda la longitud de un neuroblasto migrante durante una sesión de imágenes de 20 minutos. Una vez finalizada la adquisición de imágenes, los cortes pueden fijarse con paraformaldehído al 4 %, recién preparado y frío con hielo, e inmunotincionarse para diferentes componentes del torrente de migración.En este caso, los astrocitos positivos para GFAP en azul y los vasos sanguíneos positivos para CD31 en verde se revelan mediante inmunohistoquímica fluorescente; el análisis de alta magnificación de cortes teñidos para las proteínas del citoesqueleto actina en azul y tubulina en verde revela una expresión no uniforme de estos componentes por parte de una célula en plena migración. Nuestro protocolo presenta algunos desafíos que requieren paciencia, práctica y tiempo dedicado tanto a la preparación como al análisis de los resultados.Aquí hay algunas sugerencias útiles que le ayudarán a obtener los mejores resultados en sus experimentos. Según nuestra experiencia, los ratones en el rango de edad de P uno a P 10 proporcionan los mejores resultados. La coincidencia de edad entre los cerebros donantes y receptores también mejora la reproducibilidad de los experimentos.Dado que la mayoría de los reactivos y placas de cultivo deben prepararse frescos, nuestro ensayo con secciones requiere varias horas de preparación ininterrumpida y adquisición de imágenes en un solo día. Una vez que se extraen los cerebros, los pasos consecuentes deben realizarse lo más rápidamente posible. Entre la decapitación y la preparación de las secciones, todos los pasos deben realizarse utilizando hielo y reactivos fríos, y la manipulación del tejido debe mantenerse al mínimo para evitar alteraciones anatómicas.Las herramientas utilizadas para estas disecciones deben ser estériles y reservarse exclusivamente para manipulaciones de tejido vivo. Nunca utilice herramientas que hayan estado en contacto con fijadores como el formaldehído. Los fragmentos generalmente son viables hasta 36 horas, con un declive visible en la migración, velocidad y orientación entre las 24 y las 36 horas.Tenga cuidado con esta limitación al planificar sus experimentos y análisis.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende un ensayo de cortes organotípicos optimizado para el cerebro postnatal que permite visualizar la migración de neuroblastos mediante trasplante cruzado de tejido entre cortes de cerebro de ratón.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal (Video) | JoVE Journal

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

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