Name: Heterocarión Técnica para el Análisis de tipo de células específicas de localización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a rastrear la localización proteica específica de tipos celulares mediante la técnica de heterocarión con proteínas de fusión fluorescentes. Este método permite visualizar el tráfico nucleocitoplasmático en biología celular y cáncer.

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Nos gustaría dar las gracias al Instituto Politécnico de Worcester Departamento de Química y Bioquímica de la financiación.

1. Transfección de líneas celulares Transfección Método 1 (Nucleofection Lonza para una mayor eficiencia de la transfección de células primarias) <ol><li> Las células deben ser de reciente aprobación y registro en el crecimiento de la fase previa de la transfección. Lavar las células de fosfato (PBS) y las células de la cosecha por tripsinización. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 1500 xg durante 5 minutos. </li><li> Añadir esterilizados cubreobjetos en una placa de 6 pocillos. Cubreobjetos se pueden revestir para la adhesión celular mejorada. Coloque 1,5 ml de medio de cultivo (en este caso la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 10% de suero fetal bovino (SFB)) en cada pocillo y equilibrar los medios de comunicación en la incubadora. </li><li> Recoger las células por tripsinización y resuspender en un volumen mínimo de tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Contar las células y centrifugar la cantidad correcta de la resuspensión de proporcionar ~ 5x10 5 células por muestra. </li><li> Resuspender las células con cuidado en una solución de 100 Nucleofector sala de l temperatura por muestra. </li><li> Combine 100 L de suspensión de células con el ADN del plásmido 5 mg y la transferencia de la muestra a una cubeta Nucleofector teniendo cuidado de no incluir burbujas de aire. </li><li> Seleccione el programa adecuado Nucleofector (esto puede requerir pruebas previas para establecer la eficiencia de transfección óptima con un mínimo de mortalidad). </li><li> Inserte la cubeta con la suspensión de células / ADN en el soporte de la cubeta Nucleofector e iniciar el programa seleccionado. </li><li> Al terminar, retire la cubeta y añadir ~ 500 l de medio de cultivo pre-equilibrio a la misma (en la placa de 6 pocillos). </li><li> Inmediatamente la transferencia de la muestra en la placa de 6 pocillos con un volumen final de 1,5 ml por pocillo. Las células deben ser plateado, ya sea en poblaciones mixtas o por separado, para los controles. </li></ol> Transfección Método 2 (Qiagen Effectene transfección de líneas celulares) <ol><li> Preparar complejos de transfección usando el reactivo de Qiagen Effectene agregando primero 0,8 g de cada muestra de ADN del plásmido a 200 l buffer CE. </li><li> Añadir 6,4 l de reactivo potenciador de cada muestra, mezclar brevemente por prender el tubo, y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 20 l de reactivo Effectene a cada muestra, mezclar agitando el tubo, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Durante la incubación, preparar las dos líneas celulares de interés para la transfección. Lavar las células recientemente pasajes (&lt;80% de confluencia) una vez en tampón fosfato salino (PBS). Añadir 1,5 ml de nuevo medio de cultivo fresco caliente y equilibrada (en este caso la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 10% de suero fetal bovino (SFB)). </li><li> Una vez que los complejos de transfección se incubaron durante 15 minutos, la transferencia de 1,2 ml de los medios de comunicación a cada muestra. Mezclar con la pipeta, y de inmediato la transferencia de unos 700 l de los complejos de cada uno de los dos pozos en la placa de 6 pocillos. Añadir gota a gota, y mezclar suavemente haciendo girar el plato. Permiten a las células a transfectar por lo menos 3 horas (puede variar según el tipo de células). </li><li> Añadir esterilizados cubreobjetos a una nueva de 6 pocillos. Cubreobjetos se pueden revestir para la adhesión celular mejorada. </li><li> Después de que las células se transfectaron, lavar las células dos veces con PBS y la cosecha de las células por trysinization mínimo mediante la adición de aproximadamente 100 l de solución de tripsina a cada pocillo, agitar brevemente la placa a plena capa cada pozo, y de inmediato la aspiración de la tripsina. Una vez que las células se han levantado, añadir 1,5 ml de medio fresco. </li><li> En este punto, las células se sembraron en la población, ya sea mezclado o por separado (para controles) en el cubreobjetos estériles. </li><li> Permiten a las células para recuperarse durante 12 horas. </li></ol> 2. La fusión de células <ol><li> Eliminar los medios de cultivo de las células y lavar dos veces con PBS. </li><li> En este punto, se recomienda para tratar las células con cicloheximida (100 mg / mL) para inhibir la síntesis de proteínas. Permitir que las células se incuba durante 2 horas y luego se lavan las células dos veces con PBS. </li><li> Células se fusionan mediante la exposición a una solución de polietileno de 50% de 1000 glicol (PEG 1000) en el suero libre de DMEM durante 125 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con PBS para eliminar la solución de PEG 1000, y agregar 2 ml recién calentado y los medios de comunicación equilibrada. </li><li> Permitir que las células se incuba durante 18 a 24 horas. </li></ol> Microscopía de fluorescencia <ol><li> Eliminar los medios de cultivo, y lavar las células dos veces en PBS. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 minutos. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS fija. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos de la placa, la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos cargados con una gota de medio de montaje (90% de glicerol, 100 mM Tris pH 7,5, el 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo octanaje) con DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole). </li><li> Retire el exceso de medio de montaje de las diapositivas, y co sellover hojas con esmalte de uñas. </li><li> Visualizar las células a través de microscopía confocal o epifluorescencia. </li></ol> 3. Resultados representante La figura 2 muestra un experimento heterocarión ejemplo, con los fibroblastos primarios y H1299 células no pequeñas de pulmón de células cancerosas. La proteína de interés en este experimento (pollo Anemia Virus-VP3) muestra la localización citoplasmática principalmente en tipos de células primarias y la localización nuclear de tipos de células transformadas como se visualiza mediante microscopía de epifluorescencia. La proteína se expresa como una fusión de cualquiera de las buenas prácticas agrarias (pEGFP-N1 vector, Clontech) en fibroblastos de prepucio primaria (FPF) o dsRed (dsRed-N1 vector, Clontech) en las células H1299. Muestras de control de la participación auto-fusión (dos filas superiores) muestran células multinucleadas sin ningún cambio en los patrones de localización de estado estacionario. Estos cambios de lo contrario podría ocurrir debido a la sensibilidad a las condiciones de la fusión o la formación de sincitios. Fusiones heterocarión (fila inferior), demuestran la entrada nuclear de la GFP-fundido primario de células derivadas de proteínas y colocalización con la proteína dsRed fusionado en respuesta a la introducción de material de células transformadas. El ejemplo que se muestra es una fusión heterocarión relativamente raras como resultado de sólo dos células, una de cada tipo, como lo demuestra la presencia de ambas señales fluoroproteínicos. Además de detectar este tipo de transiciones de localización, actividad nucleocytoplasmic ir y venir puede ser fácilmente detectado por la presencia de un solo fluoróforo en ambos núcleos. Este tipo de determinación es clara al examinar 01:01 fusiones celulares y que dependen de la inhibición de la traducción. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del método heterocarión con fibroblastos primarios y H1299 no pequeñas células de carcinoma de células. El gen de interés es clonado para producir una fusión en el marco de uno de los dos genes de proteínas fluorescentes. Líneas celulares se transfectadas transitoriamente, ya sea con la construcción y les permitió recuperar. Heterocarión formación es inducida por el tratamiento breve con polietilenglicol (PEG), seguido de la incubación. Por último, la localización subcelular de la proteína de interés se observa mediante diversas formas de microscopía de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. El tráfico de ir y venir nucleocytoplasmic y la actividad de la proteína del virus de la Anemia de pollo VP3 visualizado por la fusión heterocarión. Fila superior: Imágenes representativas de la auto-fusionado H1299 células que expresan dsRed-VP3 Fila central:.. Representante imágenes de epifluorescencia de células primarias de fibroblastos de prepucio (PFF) que expresan GFP-VP3 después de la fusión PEG Fila inferior: fusión heterocarión de la FPF y las células H1299. El color amarillo indica colocalización de las buenas prácticas agrarias y las señales de dsRed. Las células fueron fotografiadas con un microscopio de fluorescencia Leica AF6000E y el software Leica imágenes.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
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<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

El protocolo heterocarión que aquí se presenta ofrece un método eficaz y fácilmente interpretable para la caracterización del comportamiento de la localización de células de tipo específico, así como la actividad nucleocytoplasmic yendo y viniendo. Este método se aprovecha de la sensibilidad de los análisis de fluorescencia, así como la capacidad de las células de la imagen en vivo y la realización de estudios de la dinámica de las proteínas. La técnica se adapta fácilmente a diferentes tipos de células y es susceptible de dos imágenes de células vivas y fijos. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia invertido se puede utilizar para imágenes en vivo y captura de lapso de tiempo de vídeo. Por el contrario, las células de montaje puede ser utilizado tanto en la microscopía de epifluorescencia para la determinación del estado de equilibrio o de imagen confocal localizaciones más detallada de localizaciones discretas. Por otra parte, las técnicas como la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP), o la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) se puede utilizar en la determinación de la cinética de una localización. La incorporación de fluoróforos se alternan en el protocolo permitiría a los experimentos de interacción de proteínas como la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) que se realizará en dos conciertos. Diferentes inhibidores de la trata de celulares, tales como B leptomycin o dominante negativo construye GTPasa Ran se puede utilizar para establecer la dependencia de la importación particular o vías de exportación 5,6,9. <ul><li> En algunos experimentos implican ir y venir de actividad, se debe tener cuidado para evitar los efectos de localización debido a la síntesis de nuevas proteínas. En estos casos, los inhibidores de la traducción o puntos de tiempo limitado se debe utilizar. Sin embargo, los artefactos debido a la inhibición de la traducción sigue siendo una posibilidad. Fusiones de células que contienen uno de cada tipo de células son los más deseados para una interpretación clara de ir y venir y el comportamiento de la localización. Optimización del número de células y las condiciones de la fusión (de tiempo y concentración) puede ser necesario para promover estos eventos favorables fusión 01:01. </li><li> Es importante tener en cuenta que la optimización de ciertas medidas en el protocolo, será necesario en función de los tipos de células utilizadas. Aspectos en el procedimiento experimental como la eficiencia de fusión, la eficiencia de transfección y viabilidad después de la fusión puede variar mucho entre los distintos tipos de células. En particular, los principales tipos de células pueden ser difíciles de manejar debido a las condiciones de cultivo complejos y bajas eficiencias de transfección. El uso de tecnologías tales como el dispositivo de Lonza Nucleofector puede permitir el procesamiento rápido de las células, así como aumentado dramáticamente la eficiencia de transfección. Además, los métodos de electroporación permite una fácil transferencia de células en suspensión a los pasos que siguen a la fusión. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>reactivo Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;medio s (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Alta glucosa</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Suero Hyclone (bovino fetal)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Placas Falcon de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Cubrebjetes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector HDF</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

heterocarión técnica para el análisis de tipo de células específicas de localización

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Un número importante de proteínas están regulados por el tráfico subcelular o nucleocytolasmic yendo y viniendo. Estas proteínas muestran una gran variedad de funciones celulares, incluyendo la importación nuclear / exportación de ARN y proteínas, la regulación transcripcional y apoptosis. Curiosamente, los grandes reorganizaciones celulares, incluyendo la división celular, la diferenciación y la transformación, a menudo involucran actividades como 3,4,8,10. El estudio detallado de estas proteínas y sus mecanismos de regulación respectiva puede ser un reto como el estímulo para la localización de estos cambios puede ser difícil de alcanzar, y los movimientos se puede ser muy dinámico y difícil de rastrear. Los estudios que incluyen la oncogénesis celular, por ejemplo, seguir beneficiándose de las vías de entendimiento y las actividades de las proteínas que difieren entre las células normales de primaria y las células transformadas 6,7,11,12. De proteínas que muestran la localización alterado durante la transformación o como resultado de la transformación, los métodos para caracterizar de manera eficiente estas proteínas y las vías en las que participan de pie para mejorar la comprensión de la oncogénesis y abrir nuevas áreas de fármaco que se dirige. Aquí presentamos un método para el análisis de tráfico de proteínas y yendo y viniendo entre la actividad de las células de mamíferos primarios y transformados. Este método combina la generación de fusiones heterocarión con microscopía de fluorescencia para proporcionar un protocolo flexible que puede ser utilizado para detectar la proteína localizaciones en estado estable o dinámica. Como se muestra en la Figura 1, dos tipos de células separadas se transfectadas transitoriamente con las construcciones de plásmido lleva un gen fluoroproteínicos unido al gen de interés. Después de la expresión, las células se fusionan con glicol de polietileno, y localizaciones de la proteína se puede obtener imágenes con una variedad de métodos. El protocolo que aquí se presenta es un enfoque fundamental de las técnicas especializadas se pueden añadir.

Un método flexible y eficiente para la caracterización de la localización de la proteína tipo de células específicas y nucleocytoplasmic ir y venir se describe. Este enfoque heterocarión utiliza fluorescencia marcado con proteínas de fusión a la proteína localizaciones imagen después de la fusión celular. El protocolo es susceptible de estado estacionario localizaciones o más determinaciones dinámicas basadas en imágenes de células vivas.

Heterocarión Técnica para el Análisis de tipo de células específicas de localización

Un número significativo de proteínas están reguladas por el tráfico subcelular o el transporte nucleocitoplasmático. Estas proteínas presentan una gama diversa de...

El objetivo general de este procedimiento es rastrear el movimiento de proteínas mediante la expresión de una única proteína que porta dos fluoróforos diferentes en dos líneas celulares separadas y fusionando luego estas líneas celulares. Esto se logra primero transfectando plásmidos que contienen el gen de interés fusionado a cualquiera de dos genes diferentes de proteínas fluorescentes en dos tipos celulares distintos. El segundo paso del procedimiento consiste en mezclar las células y permitir que cada tipo celular acumule la proteína.El tercer paso del procedimiento consiste en inhibir la síntesis de proteínas y luego fusionar las células utilizando polietilenglicol. El paso final del procedimiento es visualizar la localización proteica mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren alteraciones en la localización proteica o en el comportamiento de tráfico mediante microscopía de fluorescencia.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como cómo cambian las funciones y comportamientos discretos de las proteínas a medida que las células se transforman. Aunque este método puede proporcionar información sobre cambios específicos en células transformadas, también puede aplicarse a otros estudios, como la diferenciación celular, la biología del desarrollo y la señalización celular.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque será necesario optimizar las condiciones de transfección, así como las condiciones de fusión, para cada tipo celular diferente. El primer método mostrado en este protocolo para la introducción de ADN plasmídico en células es el método NU Nuclear Affection, que utiliza la solución efectora nuclear de Lonza para lavar células que han sido recientemente pasadas y se encuentran en fase de crecimiento logarítmico con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y recolectarlas mediante centrifugación. Una vez que las células hayan perdido adherencia, neutralice la tripsina mediante la adición de medio que contenga suero y recolecte las células por centrifugación a 1500 ×g durante cinco minutos mientras las células están siendo centrifugadas.Agregue laminillas esterilizadas a un placa de seis pocillos en la cabina de cultivo celular, luego pipetee 1.5 mililitros de medio de cultivo completo en cada pocillo, tápelo y traslade la placa al incubador de cultivo celular para su equilibrio.Después de la centrifugación, transfiera los tubos a la campana, aspire el sobrenadante y resuspenda los botones celulares en un volumen mínimo de PBS. A continuación, cuente las células y alícuota el volumen de suspensión celular en tubos estériles para microcentrífuga. Esto proporcionará aproximadamente cinco veces 10 a la quinta células por muestra; centrifugue nuevamente a 1500 ×g durante cinco minutos.Una vez finalizada la centrifugación, coloque los tubos en la campana de cultivo celular, aspire el SNA y resuspenda cuidadosamente. Suspenda las células de cada tubo con 100 microlitros de solución efectora nuclear a temperatura ambiente. A continuación, añada cinco microgramos de ADN plasmático a cada muestra y transfiera la muestra a un vial efector nuclear Q y tápela.Tenga cuidado para evitar burbujas de aire. Inserte el vial de muestra en el portaviales de Q vet. Seleccione el programa de efector nuclear adecuado e inícielo.La selección del programa más adecuado puede requerir pruebas previas para establecer una eficiencia de transfección óptima con una mortalidad mínima. A continuación, siembre las células en la placa de seis pocillos, ya sea en poblaciones mezcladas o por separado como controles. Devuelva la placa al incubador y permita que las células se recuperen durante 12 horas.El segundo método demostrado para la expresión transitoria de plásmidos es la transfección con un reactivo que afecta kagen. Para comenzar, añada 0,8 microgramos de cada muestra de ADN plasmídico a 200 microlitros de tampón EC en un tubo fuge estéril. Luego, añada 6,4 microlitros de reactivo potenciador a cada muestra.Mezcle brevemente golpeando el tubo e incube durante dos minutos a temperatura ambiente. Tras esta incubación breve, agregue 20 microlitros de reactivo afectante a cada muestra. Mezcle cada tubo golpeándolo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Durante la incubación, prepare las dos líneas celulares que se utilizarán en el experimento. Para la transfección, las células deben haberse pasado recientemente y estar en fase de crecimiento logarítmico con una confluencia aproximada del 80 %. Lave las células una vez con PBS y agregue nuevamente 1,5 mililitros de DMEM fresco con 10 % de FBS.Tras incubar los reactvos de transfección de ADN durante 15 minutos, añada 1,2 mililitros de medio DMEM más 10% de FBS a cada muestra mezclando mediante pipeteo, y transfiera inmediatamente aproximadamente 700 microlitros de los complejos a cada uno de dos pozos. En la placa de seis pozos, mezcle moviendo suavemente la placa en círculos. Deje que las células se transfecten durante al menos tres horas en el incubador dentro de la cabina de cultivo celular; si se desea, coloque un cubreobjetos esterilizado por pozo en una placa de seis pozos.Los portaobjetos recubiertos pueden utilizarse para mejorar la adhesión celular. A continuación, lave las células transfectadas dos veces con PBS y recoga las células mediante una mínima acción de tripsina. Esto se logra añadiendo 100 microlitros de solución de tripsina a cada pocillo, agitando la placa para asegurar una cobertura completa.Luego aspire inmediatamente la tripsina residual. Neutralice la tripsina restante suspendiendo las células en 1,5 mililitros de DMEM fresco con 10% de FBS y siembre las células en poblaciones mixtas o por separado como controles. En la placa de seis pocillos que contiene cubreobjetos, permita que las células se recuperen durante 12 horas en el incubador de cultivo celular.Independientemente del método de transfección, el procedimiento para la generación de infusiones heterólogas es el mismo. Tras la transfección, retire el medio de cultivo de los pocillos y lave las células dos veces con PBS. A continuación, se recomienda tratar las células con cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas adicional.Añada cyclo heide a una concentración de 100 microgramos por mililitro en medio de cultivo para cubrir las células e incube durante dos horas en la incubadora de cultivo celular. Después de dos horas, retire las células de la incubadora y lave las células dos veces con PBS. Para iniciar la fusión, cubra las células con una solución de 50% polietilenglicol 1000 en DMEM sin suero e incube durante 125 segundos.A temperatura ambiente, retire la solución de PEG y lave las células con PBS para eliminar el PEG residual. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM más 10 %FBS calentado a 37 grados Celsius. Incube las células durante 18 a 24 horas en el incubador de cultivo celular.Tras la incubación de 18 a 24 horas, retire la placa del incubador y lave las células dos veces con PBS. A continuación, pipetee un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS en cada pocillo y agite suavemente durante 15 minutos.Durante la incubación, prepare los portaobjetos que se van a utilizar añadiendo una gota individual de medio de montaje que contenga dpi. Luego lave las células fijadas dos veces con PBS y retire cuidadosamente cada cubreobjetos con pinzas pequeñas. Elimine por absorción el PBS residual sobre un trozo de papel de tejuelo antes de colocarlo con la cara celular hacia abajo sobre un portaobjetos con medio de montaje más tappi.Retire el medio de montaje en exceso del portaobjetos con papel de tejuelo y selle los bordes de las cubreobjetos. Con esmalte de uñas, las células ahora pueden visualizarse mediante microscopía confocal o de fluorescencia epiescopia. En este diagrama de flujo, el método hetero para el análisis de la localización específica de proteínas según el tipo celular se muestra en tres pasos básicos.La transfección del plásmido que expresa una proteína marcada con un fluoróforo junto con la fusión celular mediante polietilenglicol 1000 y el análisis por microscopía de fluorescencia, como se observa en estas imágenes de fluorescencia epiescopia, muestra que los controles de autofusión de fibroblastos primarios del prepucio, que expresan la proteína VP3 del virus de la anemia del pollo marcada con GFP, presentan principalmente una localización citoplasmática de la proteína en la línea de carcinoma de pulmón de células no pequeñas H 1299. Los controles de autofusión con la misma proteína VP3 marcada con DS.RED muestran principalmente una localización nuclear. La fusión heterocariótica entre los fibroblastos primarios del prepucio y las células H 1299 conduce a la introducción de material celular transformado en los fibroblastos primarios y provoca un cambio en la localización de la proteína VP3 derivada de células primarias marcada con GFP hacia el núcleo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito dependerá en gran medida de las eficiencias de transfección en los tipos celulares específicos que se estén utilizando, así como de la optimización de las condiciones de fusión para estas células particulares. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como flip y frap para responder preguntas adicionales que impliquen el análisis en tiempo real de la dinámica de localización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar las localizaciones de proteínas específicas de un tipo celular mediante la introducción de proteínas marcadas con fluoróforos y la generación de fusiones celulares.

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Biología

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

El análisis del transcriptoma de células individuales

Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

El objetivo de este protocolo es utilizar la técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar tipos específicos de células neuronales para su posterior análisis de la expresión génica específica del tipo de célula, marcadores epigenéticos y/o expresión de proteínas.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

A granel gene expresión medidas nube célula individual diferencias en poblaciones celulares heterogéneas. Aquí, describimos un protocolo para análisis de expresión génica e índice cómo sola célula clasificación de Florescence activa célula clasificación (FACS) puede combinarse para delinear la heterogeneidad y immunophenotypically caracterizar poblaciones celulares molecularmente distintos.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.

Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

Presentamos un protocolo de tinción y análisis de microscopía de localización de molécula única de cromatina en tres colores (SMLM) que permite el mapeo reproducible de eucromatina, heterocromatina y RNAP II para análisis espacial. Este protocolo permite un marcado multicolor eficiente en entornos nucleares densos, incluyendo objetivos asociados a la cromatina, permitiendo una detección simultánea fiable.

Un protocolo de microscopía de localización de molécula única multimarca para la investigación de la cromatina en el entorno nuclear denso

Aprende a rastrear la localización proteica específica de tipos celulares mediante la técnica de heterocarión con proteínas de fusión fluorescentes. Este método permite visualizar el tráfico nucleocitoplasmático en biología celular y cáncer.

Heterocarión Técnica para el Análisis de tipo de células específicas de localización

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