Heterocarión Técnica para el Análisis de tipo de células específicas de localización

El objetivo general de este procedimiento es rastrear el movimiento de proteínas mediante la expresión de una única proteína que porta dos fluoróforos diferentes en dos líneas celulares separadas y fusionando luego estas líneas celulares. Esto se logra primero transfectando plásmidos que contienen el gen de interés fusionado a cualquiera de dos genes diferentes de proteínas fluorescentes en dos tipos celulares distintos. El segundo paso del procedimiento consiste en mezclar las células y permitir que cada tipo celular acumule la proteína.

El tercer paso del procedimiento consiste en inhibir la síntesis de proteínas y luego fusionar las células utilizando polietilenglicol. El paso final del procedimiento es visualizar la localización proteica mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren alteraciones en la localización proteica o en el comportamiento de tráfico mediante microscopía de fluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como cómo cambian las funciones y comportamientos discretos de las proteínas a medida que las células se transforman. Aunque este método puede proporcionar información sobre cambios específicos en células transformadas, también puede aplicarse a otros estudios, como la diferenciación celular, la biología del desarrollo y la señalización celular.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque será necesario optimizar las condiciones de transfección, así como las condiciones de fusión, para cada tipo celular diferente. El primer método mostrado en este protocolo para la introducción de ADN plasmídico en células es el método NU Nuclear Affection, que utiliza la solución efectora nuclear de Lonza para lavar células que han sido recientemente pasadas y se encuentran en fase de crecimiento logarítmico con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y recolectarlas mediante centrifugación. Una vez que las células hayan perdido adherencia, neutralice la tripsina mediante la adición de medio que contenga suero y recolecte las células por centrifugación a 1500 ×g durante cinco minutos mientras las células están siendo centrifugadas.

Agregue laminillas esterilizadas a un placa de seis pocillos en la cabina de cultivo celular, luego pipetee 1.5 mililitros de medio de cultivo completo en cada pocillo, tápelo y traslade la placa al incubador de cultivo celular para su equilibrio.

Después de la centrifugación, transfiera los tubos a la campana, aspire el sobrenadante y resuspenda los botones celulares en un volumen mínimo de PBS. A continuación, cuente las células y alícuota el volumen de suspensión celular en tubos estériles para microcentrífuga. Esto proporcionará aproximadamente cinco veces 10 a la quinta células por muestra; centrifugue nuevamente a 1500 ×g durante cinco minutos.

Una vez finalizada la centrifugación, coloque los tubos en la campana de cultivo celular, aspire el SNA y resuspenda cuidadosamente. Suspenda las células de cada tubo con 100 microlitros de solución efectora nuclear a temperatura ambiente. A continuación, añada cinco microgramos de ADN plasmático a cada muestra y transfiera la muestra a un vial efector nuclear Q y tápela.

Tenga cuidado para evitar burbujas de aire. Inserte el vial de muestra en el portaviales de Q vet. Seleccione el programa de efector nuclear adecuado e inícielo.

La selección del programa más adecuado puede requerir pruebas previas para establecer una eficiencia de transfección óptima con una mortalidad mínima. A continuación, siembre las células en la placa de seis pocillos, ya sea en poblaciones mezcladas o por separado como controles. Devuelva la placa al incubador y permita que las células se recuperen durante 12 horas.

El segundo método demostrado para la expresión transitoria de plásmidos es la transfección con un reactivo que afecta kagen. Para comenzar, añada 0,8 microgramos de cada muestra de ADN plasmídico a 200 microlitros de tampón EC en un tubo fuge estéril. Luego, añada 6,4 microlitros de reactivo potenciador a cada muestra.

Mezcle brevemente golpeando el tubo e incube durante dos minutos a temperatura ambiente. Tras esta incubación breve, agregue 20 microlitros de reactivo afectante a cada muestra. Mezcle cada tubo golpeándolo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Durante la incubación, prepare las dos líneas celulares que se utilizarán en el experimento. Para la transfección, las células deben haberse pasado recientemente y estar en fase de crecimiento logarítmico con una confluencia aproximada del 80 %. Lave las células una vez con PBS y agregue nuevamente 1,5 mililitros de DMEM fresco con 10 % de FBS.

Tras incubar los reactvos de transfección de ADN durante 15 minutos, añada 1,2 mililitros de medio DMEM más 10% de FBS a cada muestra mezclando mediante pipeteo, y transfiera inmediatamente aproximadamente 700 microlitros de los complejos a cada uno de dos pozos. En la placa de seis pozos, mezcle moviendo suavemente la placa en círculos. Deje que las células se transfecten durante al menos tres horas en el incubador dentro de la cabina de cultivo celular; si se desea, coloque un cubreobjetos esterilizado por pozo en una placa de seis pozos.

Los portaobjetos recubiertos pueden utilizarse para mejorar la adhesión celular. A continuación, lave las células transfectadas dos veces con PBS y recoga las células mediante una mínima acción de tripsina. Esto se logra añadiendo 100 microlitros de solución de tripsina a cada pocillo, agitando la placa para asegurar una cobertura completa.

Luego aspire inmediatamente la tripsina residual. Neutralice la tripsina restante suspendiendo las células en 1,5 mililitros de DMEM fresco con 10% de FBS y siembre las células en poblaciones mixtas o por separado como controles. En la placa de seis pocillos que contiene cubreobjetos, permita que las células se recuperen durante 12 horas en el incubador de cultivo celular.

Independientemente del método de transfección, el procedimiento para la generación de infusiones heterólogas es el mismo. Tras la transfección, retire el medio de cultivo de los pocillos y lave las células dos veces con PBS. A continuación, se recomienda tratar las células con cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas adicional.

Añada cyclo heide a una concentración de 100 microgramos por mililitro en medio de cultivo para cubrir las células e incube durante dos horas en la incubadora de cultivo celular. Después de dos horas, retire las células de la incubadora y lave las células dos veces con PBS. Para iniciar la fusión, cubra las células con una solución de 50% polietilenglicol 1000 en DMEM sin suero e incube durante 125 segundos.

A temperatura ambiente, retire la solución de PEG y lave las células con PBS para eliminar el PEG residual. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM más 10 %FBS calentado a 37 grados Celsius. Incube las células durante 18 a 24 horas en el incubador de cultivo celular.

Tras la incubación de 18 a 24 horas, retire la placa del incubador y lave las células dos veces con PBS. A continuación, pipetee un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS en cada pocillo y agite suavemente durante 15 minutos.

Durante la incubación, prepare los portaobjetos que se van a utilizar añadiendo una gota individual de medio de montaje que contenga dpi. Luego lave las células fijadas dos veces con PBS y retire cuidadosamente cada cubreobjetos con pinzas pequeñas. Elimine por absorción el PBS residual sobre un trozo de papel de tejuelo antes de colocarlo con la cara celular hacia abajo sobre un portaobjetos con medio de montaje más tappi.

Retire el medio de montaje en exceso del portaobjetos con papel de tejuelo y selle los bordes de las cubreobjetos. Con esmalte de uñas, las células ahora pueden visualizarse mediante microscopía confocal o de fluorescencia epiescopia. En este diagrama de flujo, el método hetero para el análisis de la localización específica de proteínas según el tipo celular se muestra en tres pasos básicos.

La transfección del plásmido que expresa una proteína marcada con un fluoróforo junto con la fusión celular mediante polietilenglicol 1000 y el análisis por microscopía de fluorescencia, como se observa en estas imágenes de fluorescencia epiescopia, muestra que los controles de autofusión de fibroblastos primarios del prepucio, que expresan la proteína VP3 del virus de la anemia del pollo marcada con GFP, presentan principalmente una localización citoplasmática de la proteína en la línea de carcinoma de pulmón de células no pequeñas H 1299. Los controles de autofusión con la misma proteína VP3 marcada con DS.RED muestran principalmente una localización nuclear. La fusión heterocariótica entre los fibroblastos primarios del prepucio y las células H 1299 conduce a la introducción de material celular transformado en los fibroblastos primarios y provoca un cambio en la localización de la proteína VP3 derivada de células primarias marcada con GFP hacia el núcleo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito dependerá en gran medida de las eficiencias de transfección en los tipos celulares específicos que se estén utilizando, así como de la optimización de las condiciones de fusión para estas células particulares. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como flip y frap para responder preguntas adicionales que impliquen el análisis en tiempo real de la dinámica de localización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar las localizaciones de proteínas específicas de un tipo celular mediante la introducción de proteínas marcadas con fluoróforos y la generación de fusiones celulares.