Las mediciones electrofisiológicas de un sistema olfativo Polilla
29 de marzo de 2011
Sistemas olfativos de insectos proporcionan oportunidades únicas para el registro de olor inducida por las respuestas en las formas de electroantennograms (EAG) y las grabaciones individuales sensillum (SSR), que se resumen las respuestas de todas las neuronas del receptor odorante (ORNs), ubicado en la antena y de los alojados en individuales sensilla, respectivamente.
El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la facilidad de registrar respuestas olfativas del sistema nervioso de los insectos. Esto se logra inmovilizando una mariposa viva y conectando electrodos a la antena o a una neurona individual para registrar las respuestas inducidas por los odorantes. Como primer paso, se introduce un electrodo de vidrio lleno de solución salina en el ojo como electrodo de tierra; como segundo paso, cualquiera de las mariposas inmovilizadas se inserta en un electrodo de vidrio lleno de solución salina, lo que permite registrar respuestas eléctricas en forma de un electroanteniograma para grabar respuestas de una sola unidad a partir de una neurona receptora olfativa.
El electrodo de registro se introduce en la base de un sol. A continuación, la señal de la antena se amplifica y se envía a un convertidor analógico-digital para grabar y almacenar las señales. Se obtienen resultados que muestran respuestas inducidas por el odorante y dependientes de la dosis, basadas en la señal eléctrica registrada en forma de señal EAG o de potencial de acción.
Desarrollamos un nuevo método para registrar el enterograma de la polilla viva restringida de naranja Naval. La principal ventaja de esta técnica es que la preparación dura mucho tiempo, y la misma polilla puede utilizarse múltiples veces para registrar múltiples respuestas, y también puede usarse para registrar respuestas de una sola unidad a partir de un sensor individual de la antena. Nos centramos en la naranja Naval porque es una planta agrícola importante en California.
Sin embargo, este método puede utilizarse para otros insectos epídoteros, no solo para abordar preguntas fundamentales sobre la función antigua, sino también para el desarrollo de nuevos atrayentes. Este estudio del sistema olfativo de la polilla utiliza la oruga de la naranja naval. Ullo Ella.
La colonia de insectos se mantiene con una dieta a base de salvado de trigo en cámaras ambientales a aproximadamente 28 grados Celsius, aproximadamente 75% de humedad relativa y bajo un régimen fotoperiódico de 16 a 8 horas de luz a oscuridad. Prepare recipientes para las polillas recién emergidas colocando hasta 10 capas de toallas de papel empapadas en agua dentro de una caja de plástico. Recolecte y determine el sexo de las polillas emergentes diariamente, luego transfiéralas a la caja de plástico. Cubra la caja con una tapa perforada para permitir la circulación de aire y así prepararla para las grabaciones electrofisiológicas.
Primero, prepare un soporte para la polilla cortando la punta de un pipeta de 200 microlitros para que tenga un diámetro de aproximadamente dos milímetros. Para EAG o SSR, seleccione una polilla que tenga entre dos y cuatro días posteriores a la emergencia. Introduzca la polilla en la pipeta desde el extremo opuesto a la punta utilizando un trozo de papel de filtro humedecido, e impulse suavemente la polilla hacia la punta de la pipeta.
Continúe empujando la polilla hasta que las antenas y parte de la cabeza sobresalgan de la punta; inmovilice la cabeza expuesta cubriéndola con arcilla no secante, dejando expuesta una pequeña parte de un ojo y las dos antenas. Coloque la preparación de la polilla sobre la plataforma del micromanipulador del electrograma, entre los dos porta-electrodos, utilizando electrodos de vidrio con diámetros de punta menores a una micra. Rellene los electrodos con ringer de centum limb.
Observando a través del microscopio, impale el área expuesta del ojo con un electrodo. Este sirve como electrodo de referencia. El siguiente paso consiste en colocar electrodos de registro sobre las antenas.
La antena del macho de la polilla naranja del aguacate es multisegmentada, y cada segmento está adornado con un gran número de estructuras similares a pelos. La ilia, el recuadro, es una micrografía electrónica de barrido que muestra detalles de la ilia para facilitar la grabación desde las antenas. Corte uno o dos segmentos terminales distales.
A continuación, inserte ambas antenas en el electrodo de registro. Alternativamente, para grabaciones de un solo sensilio, inserte el electrodo de registro en la base de un sensilio. Los potenciales de acción provenientes del sensilio se amplifican mediante un preamplificador de alta impedancia y se envían a un convertidor digital-analógico inteligente USB para ser analizados posteriormente con el software autos spike.
El siguiente paso consiste en preparar el estímulo químico utilizando ZZ 1113 HEXA deca Now, que es un componente principal de la mezcla de feromonas femeninas del gusano de la naranja naval. Diluya el compuesto con hexano para obtener diluciones DIC. Cargue 10 microlitros de una solución de estímulo en un papel de filtro Watman. Evapore el disolvente mediante agitación suave durante 10 segundos.
Bajo una campana extractora, coloque la tira en una jeringa de polipropileno de cinco mililitros, hexano solo, y una jeringa vacía sirve como control para la preparación. El EAG o SSR se mantiene en una corriente de aire humidificada suministrada por el controlador de estímulo sintáctico a 20 mililitros por segundo. Conecte la jeringa que contiene el estímulo químico al controlador de corriente de aire.
Registre dos segundos de señales eléctricas basales. Luego, agregue un pulso de estímulo de cuatro mililitros por segundo a la corriente de aire durante 500 milisegundos. Continúe registrando las señales eléctricas durante ocho segundos más.
Deje al menos un minuto entre cada estimulación. Esta figura muestra una respuesta sólida dependiente de la dosis en las antenas de una mariposa macho inmovilizada. Estimulada con el componente de feromona femenina, CZ 1113 hexaco.
La respuesta al hexano. El control del vehículo se muestra mediante la línea azul sucesivamente. Dosis mayores del feromona generan grabaciones electrográficas sucesivamente más grandes.
Esta figura muestra los registros extracelulares de unidad individual desde un tric andum en respuesta a la estimulación por el componente de feromona femenina. Estos registros muestran una respuesta excitatoria dependiente de la dosis. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un par de horas si se hace correctamente.
Al utilizar este método, asegúrese de evitar la contaminación y use productos químicos lo más puros posible.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo demuestra el proceso de registro de respuestas olfativas del sistema nervioso de insectos, utilizando específicamente polillas. La metodología consiste en inmovilizar una polilla viva y emplear electrodos para capturar las respuestas inducidas por odorantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Sistemas olfativos
Antecedentes
- Los insectos poseen sistemas olfativos complejos.
- Los electroantenoogramas (EAG) y las grabaciones de sensilos individuales (SSR) son técnicas fundamentales.
- Estos métodos permiten el estudio de las neuronas receptoras de odorantes (ORNs).
- Comprender la olfacción en insectos puede proporcionar información sobre el procesamiento sensorial.
Objetivo del estudio
- Ilustrar la facilidad de registrar respuestas olfativas en insectos.
- Mostrar el uso de electrodos para capturar señales eléctricas.
- Analizar respuestas dependientes de la dosis a diversos odorantes.
Métodos Utilizados
- Restrinja una polilla viva para el experimento.
- Utilice electrodos de vidrio llenos de solución salina para la grabación.
- Inserte un electrodo en el ojo para conectar a tierra.
- Amplifique las señales de las antenas y conviértalas para su análisis.
Resultados principales
- Grabaciones exitosas de respuestas eléctricas de las neuronas olfativas.
- Se demostraron respuestas dependientes de la dosis a los odorantes.
- Se registraron señales en forma de respuestas EAG y picos de actividad.
Conclusiones
- La metodología es efectiva para estudiar las respuestas olfativas.
- Los resultados contribuyen a comprender el procesamiento olfativo en insectos.
- Investigaciones futuras pueden ampliar estos hallazgos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las mediciones electrofisiológicas de los sistemas olfativos de insectos permiten la detección de alta fidelidad de las respuestas neuronales inducidas por odorantes, lo que apoya la validación de objetivos en el manejo de plagas y el descubrimiento de agroquímicos. Este enfoque proporciona lecturas cuantitativas y dependientes de la dosis que facilitan la reducción de riesgos mecanicistas en las vías sensoriales y una mayor confianza predictiva en el cribado de compuestos líderes. Este método mejora la continuidad traslacional al vincular la interacción con el objetivo molecular con salidas funcionales de comportamiento en especies relevantes para la agricultura.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las neuronas receptoras de odorantes para validar los objetivos moleculares implicados en la señalización quimiosensorial.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al confirmar la interacción con el objetivo mediante lecturas electrofisiológicas directas.
- Valor predictivo: Las respuestas dependientes de la dosis permiten evaluar la relación estructura-actividad y la priorización de compuestos prometedores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas olfativos validados para la selección reproducible y de alta sensibilidad de bibliotecas de odorantes.
- Resultado cuantitativo: Genera señales de electroanteniograma (EAG) y grabación de sensilos individuales (SSR) como puntos finales medibles para la evaluación de compuestos.
- Escalabilidad: Permite el uso repetido de preparaciones individuales, apoyando campañas de cribado longitudinales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Sistema relevante para la enfermedad: Utiliza la polilla de la naranja, una plaga agrícola clave, para modelar comportamientos impulsados por el quimiosentido que son relevantes para la eficacia en campo.
- Alineación de biomarcadores traslacionales: Relaciona las respuestas electrofisiológicas con resultados conductuales como atracción o repelencia.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya decisiones de avance o interrupción basadas en la validación funcional de dianas sensoriales en contextos ecológicamente relevantes.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar una validación funcional de los blancos olfativos antes del cribado de compuestos y la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de los receptores de odorantes y la aclaración de vías en la quimiosensibilidad de insectos.
- Selección: Proporciona resultados electrofisiológicos estandarizados y reproducibles para la selección de bibliotecas de compuestos frente a sistemas sensoriales nativos.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de las relaciones dosis-respuesta para apoyar la identificación de compuestos prometedores y la clasificación de su potencia.
- Investigación Traducional: Conecta la actividad neuronal con fenotipos conductuales, apoyando la validación preclínica de estrategias de control de plagas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección cruzada de proyectos de semioquímicos y modificadores del comportamiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una perspectiva mecanicista sobre la detección de odorantes, reduciendo la ambigüedad en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Asegura la estandarización del ensayo y la durabilidad del preparado, permitiendo grabaciones de varios días y múltiples condiciones a partir de especímenes individuales.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en la selección de objetivos, reduciendo la eliminación tardía en el desarrollo de agroquímicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en datos de compuestos según sus respuestas sensoriales funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, microcirugía y manejo de insectos.
- Depende de amplificadores de alta impedancia, convertidores analógico-digitales y sistemas de entrega de estímulos.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de estímulos y evaporación de disolventes para evitar variables de confusión.
- La adaptación entre especies requiere ajustes en la colocación de los electrodos y en los parámetros del estímulo según la morfología de las antenas.
- Las limitaciones prácticas incluyen la estabilidad de la preparación a lo largo del tiempo y la susceptibilidad al ruido ambiental durante la grabación.
