Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

El objetivo general de este procedimiento es medir la vida útil de los gusanos Elgan marinos que fueron tratados con medicamentos de interés. Esto se logra preparando primero OP 50, una cepa bacteriana, que se utiliza para alimentar a los gusanos. A continuación, se genera una población de gusanos sincronizada por edad y se siembra en placas de 96 pocillos junto con las bacterias de alimentación OP 50.

Durante los dos días siguientes, los gusanos crecen hasta la etapa larvaria L cuatro y se agrega el medicamento FUDR para prevenir la reproducción. Al día siguiente, los gusanos alcanzan la edad adulta y los medicamentos de interés se añaden a los pocillos individuales. A partir de este momento, el número de gusanos vivos y muertos se determina cada dos o tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto.

La observación se realiza con un microscopio invertido y se registra el número de gusanos vivos y muertos en cada sesión. Hola, soy Greg Solis. Estoy en el Laboratorio de Petro en el Departamento de Fisiología Química del Instituto de Investigación Scripps.

Hoy te mostraré cómo sincronizar gusanos y distribuirlos en 96 placas de microtitulación de pared. La principal ventaja de esta técnica de sus métodos existentes es que permite la identificación rápida de moléculas que prolongan la vida útil y la elegancia del C. Así que comencemos.

Para preparar la alimentación de las bacterias para la elegancia C, comience el día menos siete inoculando cinco mililitros de TB que contengan 100 microgramos por mililitro y persina, y 0,1 microgramos por mililitro y terina B con una sola colonia OP 50 incube durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador bacteriano temprano a la mañana siguiente, diluya el cultivo nocturno de OP 51 en 2000 en 300 mililitros de TB que contenga 50 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar el cultivo en un agitador bacteriano durante ocho a 12 horas a 37 grados centígrados hasta que se alcance la saturación. No permita que el cultivo crezca más de 14 horas.

Transfiera el OP 50 a un tubo de centrifugación estéril preponderado Granule el OP 50 por centrifugación durante 10 minutos a 3.500 RPM o 2.200 veces G en una centrífuga de mesa. Desechemos el sobrenadante S, volvemos a suspender el pellet OP 50 y estrellamos nuestra agua y rep pellet por centrifugación. Repita esto, lave dos veces después de la segunda.

Lave con cuidado y retire a fondo toda el agua restante. Pese el tubo de centrifugación que contiene el pellet y reste el peso del tubo de centrifugación vacío para determinar el peso del pellet. A continuación, vuelva a suspender completamente el pellet en S Complete hasta una concentración de 100 miligramos por mililitro.

No deben quedar grumos. La concentración de 100 miligramos por mililitro OP 50 debe corresponder a dos veces 10 a las 10 bacterias por mililitro. Utilice el fotoespectrómetro para determinar el número de bacterias por mililitro si se conoce la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mililitro.

Si es necesario, ajuste la concentración de la solución de alimentación OP 50 a dos veces 10 a 10 bacterias por mililitro. Finalmente, almacene la solución OP 50 a cuatro grados centígrados hasta que se utilice para el cultivo de lombrices para generar una población de gusanos sincrónica con la edad. Comience a última hora de la tarde en el día menos seis con una placa NGM de cinco a 10 días de antigüedad en la que la población de gusanos consiste principalmente en larvas L uno hambrientas.

Esterilice una espátula de metal calentándola brevemente sobre un mechero bunsen. Deja que se enfríe. Luego use la espátula fría para cortar trozos de agar del plato que contiene los gusanos hambrientos.

Transfiera varios de estos trozos a un plato NGM fresco de 10 centímetros sembrado con OP 50. Incubar los gusanos durante aproximadamente 65 horas a 20 grados centígrados hasta que la mayoría de la población de gusanos esté formada por adultos graves. El tiempo que tardan los animales hambrientos en convertirse en adultos graves puede variar de una cepa a otra.

Después de la incubación, recoja los gusanos de la placa de 10 centímetros lavándolos de la placa con cinco a 10 mililitros de agua estéril. Transfiera la solución de agua de lombriz a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los gusanos centrifugando durante dos minutos en una centrífuga de mesa a 1, 200 RPM o 280 veces G. Deseche el supinato y agregue 10 mililitros de agua.

Repite el paso de lavado, retira el naante SUP y añade cinco mililitros de lejía recién preparada. La solución de hidróxido de sodio se incuba durante cinco minutos a RT hasta que los gusanos se abren. Asegúrate de hacer un vórtice suave cada minuto.

Monitoree el progreso de la reacción bajo el microscopio de disección tan pronto como todos los adultos se disuelvan. Añadir cinco mililitros de tampón M nine para neutralizar la reacción. Lavar los huevos tres veces con 10 mililitros de tampón M nueve centrifugando durante dos minutos a 2.500 RPM o 1.100 veces G.A continuación, lavar los huevos una vez con 10 mililitros de S completo centrifugando durante dos minutos a 2.500 RPM o 1.100 veces G.Retirar el snat.

Agregue 10 mililitros de S completo y transfiera la solución a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Agregue 30 mililitros de S completo a un volumen final de 40 mililitros. Agite suavemente el tubo durante la noche a temperatura ambiente en un mutador o dispositivo similar para sembrar las placas de los animales al día siguiente alrededor del mediodía.

Bajo un telescopio de disección, verifique si los gusanos eclosionaron durante la noche. Determine la concentración de gusanos en la solución completa S contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Usando un endoscopio de disección, cuente al menos 10 gotas para cada muestra. Resus.

Suspenda los gusanos a una concentración de 80 a 100 gusanos por mililitro. En medio S completo, agregue carbenicilina a una concentración final de 50 microgramos por mililitro y anfotericina B a una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agita un mutador.

Si prepara grandes cantidades de lombrices, use un matraz no clonado de 600 mililitros con una tapa de filtro A las 2:30 p.m. Agregue el OP 50 preparado en la primera parte hasta una concentración final de seis miligramos por mililitro. Vuelva a colocar el OP 50 a cuatro grados centígrados. Transfiera 120 microlitros de la solución de gusano OP 50 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con el fondo transparente.

Asegúrese de mantener los gusanos y la suspensión mientras pipetea, selle la placa con un sellador de cinta adhesiva para evitar la contaminación y la evaporación. Agitar la placa en un agitador de placas de microtitulación durante dos minutos e incubar durante dos días a 20 grados centígrados hasta que los animales alcancen la etapa L cuatro. A continuación, para esterilizar a los animales, añada 30 microlitros de una solución madre FUDR de 0,6 milimolares a cada pocillo.

Este paso eleva el volumen final de cada pocillo a 150 microlitros y reduce la concentración final de OP 50 de seis miligramos por mililitro a cinco miligramos por mililitro. Selle la placa con selladores de cinta adhesiva y agítela durante dos o tres minutos en un agitador de placas microt. Si el OP 50 se agregó a las dos 30 del día menos dos, es importante que el FUDR se agregue antes de las placas de retorno del mediodía a la incubadora de 20 grados Celsius a las 9:00 a.m. del día siguiente.

La mayoría de los animales deben ser graves y contener varios huevos. Cada uno añade los fármacos cuyo efecto sobre la vida útil se va a probar a la concentración deseada. Si se disuelven los medicamentos en DMSO, las concentraciones finales de DMSO no deben exceder el 0.6%, ya que las concentraciones de DMSO superiores al 0.6% acortan la vida útil del elgan después de la adición del medicamento.

Selle las placas con cinta selladora y agítelas durante dos o tres minutos en una placa de microtitulación. El agitador devuelve las placas a la incubadora a 20 grados centígrados. La adición de los medicamentos ocasionalmente puede matar a algunos animales por plato, especialmente si se usa un solvente que no sea agua.

Use un microscopio invertido para verificar si hay animales muertos. Por lo general, debe haber menos de 10 animales muertos por cada 96 placas del mundo Regrese las placas a la incubadora de 20 grados centígrados durante dos días para permitir que el oxígeno fresco ingrese al cultivo. Retire el sellador.

Espere un minuto y vuelva a sellar el plato. Agite el plato durante dos o tres minutos en un agitador de placas más apretado de microt, repita una vez por semana en el quinto día de vida adulto, agregue cinco microlitros de la solución OP 50 de 100 miligramos por mililitro que se preparó anteriormente a cada uno de los 96 pocillos para evitar la inanición. La vida útil de los gusanos se califica por su movimiento tres veces por semana desde el comienzo del experimento hasta que mueren.

Utilice un microscopio invertido con un objetivo de dos x o 2,5 x para observar gusanos en 96. Las placas de los pozos se colocan en el día cero al comienzo del experimento. Cuente el número total de lombrices en cada pozo.

Los pocillos sensores que contienen más de 18 animales del análisis, ya que los animales en estos pocillos no tendrán suficiente OP 50 y mostrarán efectos de restricción dietética en cada sesión de conteo. Registre la fecha y el número de animales que se desplazan como animales vivos. El movimiento y el líquido son mucho más fáciles que en medios sólidos y pueden ser inducidos por luces fuertes.

El uso de un aumento mayor puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles como los de la punta de la faringe. Tales movimientos sutiles son a menudo el único movimiento observado en animales muy viejos. Regrese las placas a la incubadora a 20 grados centígrados.

Repita las sesiones de conteo cada dos o tres días hasta que todos los animales estén muertos. Se trata de un diseño de una hoja de Excel para registrar los datos de vida útil de cada pozo. Se coordina en la cepa de la placa, la concentración del fármaco y el número total de animales vivos en el día cero se registra al comienzo del experimento.

Registre la fecha y el número de animales vivos y muertos tres veces por semana para seguir la supervivencia de las distintas poblaciones en cada pozo. Esta figura muestra los resultados de la elegancia del mar, la esperanza de vida, las curvas registradas a 20 grados centígrados y 25 grados centígrados. El ensayo de vida útil basado en microtítulos reproduce con precisión los cambios de vida dependientes de la temperatura.

De manera similar, como se muestra aquí, el ensayo de placa de microtitulación reproduce los cambios en la esperanza de vida de los mutantes que se informó que tienen una esperanza de vida que difiere de la de los animales salvajes de tipo N dos. Esta figura muestra cómo las dosis crecientes de mirtazapina afectan la vida media de la elegancia marina. Los datos obtenidos por el ensayo de placa de microtitulación son lo suficientemente cuantitativos como para determinar las relaciones dosis-respuesta Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para examinar grandes bibliotecas químicas en busca de moléculas que prolonguen la vida útil y vean la elegancia.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.