Name: Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprende a medir la duración de vida de Caenorhabditis elegans en placas de microtitulación de 96 pocillos. Este protocolo permite identificar compuestos que extienden la longevidad en este organismo modelo.

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Este protocolo fue desarrollado originalmente en el Fred Hutchinson Cancer Research Center en Seattle por Xiaolan Ye y Petrascheck Michael en el Laboratorio de Linda Buck. La versión detallada ha sido preparado para hacer todo el procedimiento a disposición de la comunidad en general. Damos las gracias a Carol Taylor, LeBoeuf Sarah y Andy Tomacelli para la lectura crítica del protocolo. Este manuscrito es # 2866 de The Scripps Research Institute. El Laboratorio de Petrascheck es financiado por el programa IDA Novartis.

Resumen: El protocolo se divide en cuatro partes. Parte 1 se describe cómo preparar la alimentación de las bacterias. La Parte 2 describe cómo preparar la lombricultura. Parte 3 describe la forma de puntuación vida. Parte 4 se muestran algunos resultados representativos, y la Parte 5 se describe cómo preparar las soluciones necesarias. Experimentos de vida útil tomar varias semanas para completarse. Para cada paso de la semana del protocolo, el día y hora del día se incluye para facilitar la planificación. La etapa L4 (día 0) se utiliza como punto de referencia para todo el protocolo. 1. Preparación de bacterias Alimentación En esta sección se describe la preparación de las bacterias de alimentación. Los objetivos específicos E. coli cepa utilizada para alimentar a C.elegans se llama OP50. Antes de este protocolo, para evitar la contaminación cruzada de la lombricultura con otras bacterias, la cepa OP50 se ha hecho carbenicilina / resistentes a la ampicilina 21. Preparar el OP50 cuatro a cinco días de antelación. Todos los materiales que entran en contacto con OP50 debe ser estéril. Día 7: jueves (semana 1): Inocular 5 ml de la tuberculosis con 100 mg / ml ampicilina y 0,1 mg / ml de anfotericina B con una sola colonia OP50 e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador de bacterias. -6 Día: viernes (semana 1). Mañana 08:30. Inocular temprano para dar tiempo suficiente para que la cultura para alcanzar la saturación <ol><li> Diluir el cultivo de una noche de OP50 1:2000 en TB 300 ml contiene 50 mg / ml de ampicilina. Incubar el cultivo de bacterias en un agitador durante 8-12 horas a 37 º C hasta que se alcanza la saturación. No permita que la cultura crezca más de 14 horas. </li><li> Transferir el OP50 en un tubo estéril, centrifugación pre-ponderado. Se precipitan los OP50 por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm (2.200 xg) en una centrífuga de mesa. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet OP50 en agua estéril y volver a una pastilla por centrifugación. Repetir este lavado dos veces. </li><li> Tras el segundo lavado, retire con cuidado toda el agua restante. No se debe dejar el agua en el tubo. Pesar el tubo de centrifugación que contiene la pastilla y restar el peso del tubo de centrifugación vacío con el fin de determinar el peso de la pastilla. </li><li> Bien volver a suspender el pellet en S-completa a una concentración de 100 mg / mL. No se debe dejar grumos. </li><li> La concentración de 100 mg / mL OP50 debe corresponder a 2 x 10 10 bacterias / ml. El uso de un espectrómetro de fotos para determinar el número de bacterias por ml, si la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mL se conoce. Si es necesario, ajustar la concentración de la solución de alimentación OP50 a 2 x 10 10 bacterias / ml. </li><li> Guarde el OP50solution a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo del gusano. </li></ol> 2. Preparación de una cultura del gusano síncrona En esta sección se describe la preparación de la lombricultura. Su objetivo es generar una población en edad sincrónica de los gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador en el paso 5, debe ser estéril. Las placas se mantienen a 20 º C a menos que se indique lo contrario. -6 Día: viernes (semana 1), 4:00 pm: Traslado de los animales a un plato fresco <ol><li> Tome un plato días 50-10 NGM de edad en la que la mayoría de la población del gusano consiste en larvas L1 de hambre. </li><li> Esterilizar una espátula de metal por poco más de calor que un mechero de Bunsen. Deje que se enfríe. Use la espátula de refrigeración para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos de hambre. La transferencia de varios de estos trozos en una nueva placa de 10 cm NGM sembrado con OP50. Incubar durante aprox. 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de la población de gusanos adultos se compone de gravidez. El tiempo necesario para que los animales muertos de hambre L1 se conviertan en adultos grávidas pueden variar de cepa a cepa. </li></ol> -3 Día: Lunes (2 semanas) 10:00 am: Establecer una población síncrono <ol start="3"><li> Recoger los gusanos de la placa de 10 cm, lávelos de la placa con 50-10 ml de agua estéril. Transferir la solución gusano / agua en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Lavar los gusanos mediante la centrifugación de 2 minutos en una centrífuga de mesa a 1200 rpm (280 xg). Desechar el sobrenadante y agregar 10 ml de agua. Repetir. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 5 ml de lejía recién preparada / solución de NaOH (2,5 cloro de uso doméstico ml, 1 ml NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abren. Asegúrese de vórtice suavemente cada minuto. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio de disección. </li><li> Tan pronto como todos los adultos se disuelven, añadir 5 ml de buffer M9 para neutralizar la reacción. </li><li> Lavar los huevos tres veces con 10 ml de buffer M9 mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavar los huevos una vez con 10 ml S-completa mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1.100 xg). </li><li> Eliminar el sobrenadante, agregar 10 ml de S-completa y transferir la solución a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir 30 ml de S-completa a un volumen final de 40 ml. Agite suavemente el tubo de la noche a temperatura ambiente en un nutator o dispositivo similar. </li></ol> Día -2: Martes (semana 2), 12:00 pm: La semilla de los animales en las placas <ol start="10"><li> Bajo el microscopio de disección, comprobar si los gusanos nacidos durante la noche. Determinar la concentración de los gusanos en la solución de S-completa, contando el número de gusanos en 10 gotas l usando un microscopio de disección. Contar con al menos 10 gotas de cada muestra. </li><li> Vuelva a suspender los gusanos a una concentración de 80 a 100 lombrices / mL en el S-completo. Añadir carbenicilina (stock 100 mg / mL) a una concentración final de 50 mcg / ml y anfotericina B (stock 250 mg / mL) a una concentración final de 0,1 mg / ml. Agitar en un nutator. Si la preparación de grandes cantidades de gusanos, use un frasco de 600 ml Nunclon con la tapa del filtro. </li><li> A las 2:30 pm agregar el OP50 preparados en la parte 1 a una concentración final de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 9 bacterias / mL). Devolver el OP50 a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 120 l de la solución worm/OP50 en cada pocillo de una placa y 96. Use placas de 96 pocillos con fondo transparente. Asegúrese de mantener a los gusanos en la suspensión, mientras que la pipeta. </li><li> Sellar la placa con un sellador de cinta para evitar la contaminación y la evaporación. Agitar la placa en un agitador de microplacas durante 2 min y se incuba durante 2 días a 20 ° C hasta que los animales llegan a la etapa L4. </li></ol> Día 0: jueves (2 semanas) antes del mediodía: Esterilizar los animales mediante la adición de fluorodesoxiuridina (FUDR) <ol start="15"><li> Para esterilizar a los animales añadir 30 l de una solución madre 0,6 mM FUDR a cada pocillo. En este paso el volumen final en cada pocillo a 150 l, y reduce la concentración final de OP50 de 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 9 bacterias / mL). Sellar la placa con cinta de selladores y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Si el OP50 se añadió a las 2:30 en el día -2, es importante que el FUDR se añade antes del mediodía. Volver placas a los 20 ° C incubadora </li></ol> Día 1: viernes (semana 2): Agregar a la cultura de las drogas <ol start="16"><li> A las 9:00 am la mayoría de los animales deberán ser grávidas y contienen varios huevos cada una. Añadir las drogas cuyo efecto sobre el ciclo de vida se va a probar en la concentración deseada. Si la disolución de la droga en las concentraciones de DMSO final de DMSO no debe ser superior a 0,6%, como las concentraciones de DMSO 0,6% más alto que acortan la vida útil C.elegans. Después de la adición de las drogas, sellar las placas con cinta selladora y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Volver placas a los 20 ° C incubadora </li><li> Adición de las drogas en ocasiones puede matar a algunos animales por plato, especialmente si se utiliza un solvente que el agua. El uso de un microscopio invertido para comprobar si hay animales muertos. Generalmente, no debe ser inferior a 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Volver placas a los 20 ° C incubadora. </li></ol> Día 4: Lunes (3 semanas): selladores de Cambio <ol start="18"><li> Para permitir que el oxígeno fresco entre la cultura de quitar el sellador, espere un minuto y vuelva a sellar la placa. Agitar la placa durante 2-3 minutos en un agitador de microplacas. Repetir una vez a la semana. </li></ol> Día 5: Martes (semana 3): Añadir nuevas OP50 para evitar el hambre <ol start="19"><li> Añadir 5 l de los 100 mg / mL OP50 solución que se preparó en una parte a cada uno de los 96 pozos para evitar el hambre. </li></ol> 3. La puntuación de vida. En esta sección se describe cómo la supervivencia de la población de lombrices sincronizado de la Parte 2 se controla hasta que los animales murieron. Para observar a los animales en el 96 y placas, el uso de un microscopio invertido con un objetivo de 2x o 2.5x. Registro de datos de supervivencia de tres veces a la semana, lunes, miércoles y viernes. Usar el movimiento para determinar si los animales están vivos o muertos. Una luz intensa, especialmente por la luz azul, induce a los animales a moverse. No retire los animales muertos de la prueba. De vez en cuando, los animales que no se movió y se determinó el número de muertos en la anterior podría pasar más adelante. <ol><li> En el día 0, al inicio del experimento contar el número total de gusanos en cada pozo. Censor pozos que contienen más de 18 animales a partir del análisis de los animales en estos pozos no tienen suficiente OP50 y mostrará los efectos de la restricción dietética. </li><li> Con el fin de aumentar la probabilidad de que los animales se mueven, sacudir la placa de 96 pocillos en un agitador de microplacas durante 2 min. antes del conteo. </li><li> En cada fecha de registro de conteo de sesiones y número de animales quese mueven como animales vivos. Movimiento en el líquido es mucho más fácil que en medio sólido y puede ser inducida por luz intensa. El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los de la punta de la faringe. Estos movimientos sutiles son a menudo el movimiento sólo se observa en los animales muy viejos. </li><li> Volver placas a los 20 ° C incubadora </li><li> Repita el paso 2-4 cada dos o tres días hasta que todos los animales están muertos. </li></ol> 4. Los resultados representativos. En esta sección se muestra un ejemplo de cómo llevar un registro de los datos de esperanza de vida generada por este análisis y algunos resultados representativos. La figura 1A muestra un ejemplo de cómo registrar los datos de esperanza de vida durante este ensayo. Una hoja de Excel se utiliza para realizar un seguimiento de la supervivencia de las poblaciones en cada pozo. Para cada pozo es de coordenadas en la placa, la tensión, las drogas, la concentración de la droga y el número total de animales vivos en el día 0 (X0) se registra en el inicio del experimento. Fecha de registro, así como el número de animales muertos que viven y tres veces por semana para seguir a la supervivencia de las distintas poblaciones en cada pozo. Para graficar los resultados, calcular la fracción de animales vivos por cada día y la trama como una función del tiempo en días. P-valores deben ser calculados usando paquetes estadísticos como STATA o software similar. El medio de vida de C. elegans es dependiente de la temperatura. Figura 1B muestra que los cambios dependen de la temperatura en la longevidad se reproducen con precisión por la esperanza de vida basado en microtitulación ensayo 22. Del mismo modo, el ensayo de placa de microtitulación reproduce los cambios en la vida de los mutantes informó que tienen esperanzas de vida diferentes a los animales salvajes de tipo N2 23-24 25 (fig. 1C). El ensayo también puede utilizarse para hacer declaraciones más cuantitativo. En la media de Fig1D vida se representa como una función de la concentración mirtazepina 7. Cada punto representa la media de esperanza de vida de la población 7-12, cada uno vive de una manera diferente también. A pesar de que el número de animales por pozo es relativamente baja (5-15 animales) y la variación a pozo es relativamente pequeño, como puede verse en las barras de error. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La placa de microtitulación basado vida ensayo reproduce con precisión los cambios en la esperanza de vida en la literatura. (A) los datos de la muestra recogida en una hoja de cálculo Excel. En cada fecha de la sesión de conteo, las coordenadas del bien y el número de animales vivos y los muertos se registró. Al comienzo del experimento, el número total de animales en cada pozo se determinó. (B) Curva de supervivencia de tipo salvaje (N2) animales criados a 20 ° C y 25 ° C. (C) Las curvas de supervivencia de las cepas con mutaciones que afectan a la vida. Las cuatro cepas se analizaron en paralelo a 20 ° C. (D) de la curva dosis-respuesta mirtazepina N2 animales tratados. La media de esperanza de vida se representa como una función de la concentración mirtazepina. Las barras de error indican el SEM de 8 pozos por condición. 5. Los materiales. M9 buffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g de NaCl </li><li> 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate buffer de pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Añadir agua desionizada hasta 900 ml </li><li> Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Traza una solución de metal <ul><li> 1,86 g de Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,20 g MnCl2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g de CuSO4 </li><li> 1000 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave y almacenar en la oscuridad. </li></ul> S-basal medio, 1.000 ml <ul><li> 5,9 g de NaCl </li><li> 50 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 6,0 </li><li> 1000 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave </li><li> Deje enfriar la solución y luego agregar 1 ml de colesterol 5 mg / mL (disuelto en Et-OH). </li></ul> 1M citrato de potasio, 1.000 ml <ul><li> 268,8 g de citrato tripotásico </li><li> 26.3 monohidrato de ácido cítrico </li><li> Añadir 900 ml de agua desionizada </li><li> Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-medio completo, 1.000 ml <ul><li> 977 ml S-basal </li><li> 10 ml de potasio 1M citrato pH 6 (estéril) </li><li> 10 ml de traza de metales solución (estéril) </li><li> 3 ml de CaCl2 1M (estéril) </li><li> 3 ml de 1M MgSO4 (estéril) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 g de NaCl </li><li> 2.5g Pepton(A partir de la caseína, digerido pancreático) </li><li> Agar 17g </li><li> Añadir agua desionizada hasta 975 ml y una barra de agitación </li><li> Autoclave </li><li> Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: <ul><li> 0,5 ml de 1 M de CaCl2 (estéril) </li><li> 1 ml de colesterol 5 mg / ml en etanol </li><li> 1 ml de 1M MgSO4 (estéril) </li><li> 25 ml de tampón Potassiumphosphate, pH 6,0 (estéril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12 g de triptona Bacto </li><li> 24 g de extracto de levadura </li><li> 4 ml de glicerol </li><li> Añadir 900 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave </li><li> Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: <ul><li> Añadir 100 ml de 0,17 KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM fluorodesoxiuridina (FUDR, Sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Se disuelven en 670 mL estéril S-completa, hacer 10 o 45 ml alícuotas ml. </li><li> Almacenar a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / carbenicilina ml, 10 ml <ul><li> 1 g carbenicilina </li><li> 10 ml de agua desionizada estéril </li><li> Filtrado estéril y alícuota </li><li> Almacenar a -20 ° C. </li><li> Usar a una concentración final de 50 mg / ml </li></ul> 250ug / ml de anfotericina B, 4 ml <ul><li> 1 mg de anfotericina B </li><li> 4 ml de Et-OH </li><li> Almacenar a -20 ° C </li><li> Usar a una concentración final de 0,1 mg / ml </li></ul>

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</ol>

El protocolo presentado permite la medición de la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. Como se muestra en los resultados de la sección representativa de forma fiable replica los resultados anteriores y proporciona información cuantitativa. El uso de este ensayo hemos logrado examinados más de 89.000 moléculas por su efecto sobre C.elegans vida. A los efectos de las drogas de detección, medición de vida útil en un formato de 96 pocillos de microtitulación tiene varias ventajas sobre la prueba clásica de los medios sólidos. Se reduce el trabajo necesario para la preparación de medios, la cantidad de espacio de incubación, y la cantidad de fármaco necesaria. El formato de 96 pozos y la instalación de microscopía permiten la automatización del ensayo completo de pruebas de detección de alto rendimiento. Durante el desarrollo de la prueba de varios valores para cada variable y combinaciones de los mismos fueron evaluados por sus efectos sobre C.elegans vida. Estas pruebas incluyen la concentración de diferentes OP50 que van desde 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), distinto número de gusanos por pozo de entre 7 y 45 (7, 10, 15, 22, 45 gusanos / y), los volúmenes de diferentes cultura que van desde 40 hasta 150 l por pocillo (40, 60, 80, 100, 120, 150 l), y los cambios en la composición del buffer. Si se alimenta con un OP50 carbenicilina resistente, ni carbenicilina, ni la anfotericina B en las concentraciones indicadas se han encontrado para afectar C.elegans vida. Agitación continua suave de las placas, como se recomienda a menudo en la cultura C.elegans líquido, se encontró prescindible para los pequeños volúmenes utilizados en este ensayo. Agitación suave sin embargo es necesario si microplacas con los pozos más grandes se van a utilizar. Los valores indicados en este protocolo han sido cuidadosamente seleccionados sobre la base de comparación estadística de las distintas condiciones de prueba. La característica más sorprendente de este ensayo es, probablemente, el hecho de que C. elegans se puede mantener en placas de 96 pozos que están selladas con cinta adhesiva. De lado a lado comparaciones no reveló ninguna diferencia en la esperanza de vida de los animales cultivados en placas de sellado, en placas de sellado con un sellador de plástico, o en placas selladas con selladores que permitan el intercambio de aire. En las tres condiciones, los animales desarrollaron muy homogénea de L1 a adultos grávidas en 65 horas y mostró esperanzas de vida muy similares. Animales criados de forma paralela en NGM desarrollado un poco más rápido, pero esta diferencia fue independiente de la presencia o ausencia de un sellador. El protocolo presentado se basa en bacterias vivas, pero puede ser adaptado para que las bacterias muertas. Sin embargo, en un ensayo de líquido una bacteria sobrevivir solo se pueden multiplicar rápidamente y volver a llenar la cultura. En nuestras manos, la única manera confiable para matar las bacterias en la medida en que puedan ser utilizados para el cultivo líquido es por el tratamiento prolongado de las bacterias con irradiación gamma. Un punto importante a considerar en la planificación de un experimento de vida es el poder de detección. Depende del tamaño del efecto, el efecto de la droga de interés deben ser probados en múltiples pozos. En un ensayo típico de 4 tratados con el fármaco y cuatro pozos de control, que corresponde aproximadamente a 40-50 animales cada uno, debería ser suficiente para detectar un aumento del 30% en el período de vida en más del 95% de los experimentos. Aumenta del 14% sólo se detectan en el 60% de los casos y por lo tanto requieren más pozos replicar. La riqueza de los datos de esperanza de vida generada por este ensayo puede ser utilizado para desarrollar experimentos o cepa específica de los modelos de Gompertz paramétrico 1. Estos modelos Gompertz son útiles para determinar la potencia de detección y para estimar el número de falsos positivos y negativos a gran escala de pantallas. Hemos verificado las predicciones de estos modelos en experimentos ciegos y los utilizó para estimar el número de falsos negativos en las pantallas de gran tamaño (resultados no publicados). En resumen, podemos anticipar que el ensayo presentado será de gran utilidad para identificar pequeñas moléculas que prolongar la vida de C. elegans y estudiar los mecanismos subyacentes.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>También llamada Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>El FUDR se inactiva por calor, descongele en agua fría</td></tr><tr><td>Mianserina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Utilice como control positivo a una concentración final de 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Ciproheptadina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Control positivo alternativo a 10 &amp;#x03BC;M de concentración final</td></tr><tr><td>Cinta selladora</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>De poliéster, no estéril</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>No tratada, transparente, empaquetada individualmente, de poliestireno, estéril</td></tr><tr><td>Matraz Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>usado para volúmenes grandes</td></tr></tbody></table>

medición caenorhabditis elegans duración de la vida en 96 placas de microtitulación bueno

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Esperanza de vida es un proceso biológico regulado por varias vías genéticas. Una de las estrategias para investigar la biología del envejecimiento es el estudio de los animales, que contienen mutaciones en los componentes de la edad de regulación vías. Si estas mutaciones perturbar la función de la vía la edad reglamentaria y por lo tanto, alteran la vida de todo el organismo, que proporcionan importantes conocimientos mecánicos 1-3. Otra estrategia para investigar la regulación de la vida es el uso de pequeñas moléculas para perturbar la edad regulación vías. Hasta la fecha, un número de moléculas se sabe que extender la vida útil de varios organismos modelo y se utilizan como herramientas para estudiar la biología del envejecimiento 16.4. El número de moléculas identificadas hasta el momento es pequeña comparada con la genética &quot;herramientas&quot; que está disponible para estudiar la biología del envejecimiento. Caenorhabditis elegans es uno de los modelos de principio que se utiliza para estudiar el envejecimiento debido a su excelente genética y de corta vida útil de tres semanas. Más recientemente, C. elegans se ha convertido en un organismo modelo para las pantallas de fenotipo de drogas basado en 5,7,16-20 debido a su pequeño tamaño y su capacidad de crecer en placas de microtitulación. Aquí presentamos un ensayo para medir la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. El ensayo fue desarrollado y utilizado con éxito a la pantalla de las grandes bibliotecas de moléculas que se extienden C.elegans vida 7. La fiabilidad del ensayo fue evaluado en varias pruebas: en primer lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los animales de tipo salvaje crecido a diferentes temperaturas, en segundo lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los mutantes alterados con esperanzas de vida, en tercer lugar, mediante la medición de los cambios en la esperanza de vida en respuesta a diferentes concentraciones de los antidepresivos mirtazepina. Mirtazepina ha sido demostrado prolongar la vida en C.elegans 7. Los resultados de estas pruebas muestran que el ensayo es capaz de replicar los hallazgos previos de otros ensayos y cuantitativos. El formato de microtitulación también hace que este ensayo vida compatible con los sistemas automatizados de manejo de líquidos y permite la integración en plataformas automatizadas.

En este protocolo se presenta un método para medir<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Vida en 96 placas microtiter así.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

La longevidad es un proceso biológico regulado por diversas vías genéticas. Una estrategia para investigar la biología del envejecimiento consiste en estudiar animales que presentan...

El objetivo general de este procedimiento es medir la longevidad de gusanos nematodos marinos tratados con fármacos de interés. Esto se logra primero preparando OP 50, una cepa bacteriana, que se utiliza para alimentar a los gusanos. Luego, se genera una población de gusanos sincronizada por edad y se siembra en placas de 96 pocillos junto con la bacteria alimenticia OP 50.Durante los próximos dos días, los gusanos crecen hasta la etapa larval L4 y se añade el fármaco FUDR para evitar la reproducción. Al día siguiente, los gusanos alcanzan la edad adulta y se añaden los fármacos de interés a los pocillos individuales. A partir de este momento, el número de gusanos vivos y muertos se determina cada dos o tres días hasta que todos los gusanos han muerto.La observación se realiza utilizando un microscopio invertido y se registra el número de gusanos muertos y vivos en cada sesión. Hola, soy Greg Solis. Estoy en el Laboratorio Petro del Departamento de Fisiología Química del Instituto de Investigación Scripps.Hoy les mostraré cómo sincronizar gusanos y distribuirlos en placas de microtitulación de 96 pocillos. La principal ventaja de esta técnica frente a sus métodos existentes es que permite la identificación rápida de moléculas que prolongan la longevidad en C. elegans. Así que comencemos.Para preparar bacterias para alimentación de C. elegans, comience el día menos siete inocular cinco mililitros de TB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina y 0,1 microgramos por mililitro de tetraciclina B con una colonia individual de OP50, e incubar durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador bacteriano. A la mañana siguiente, diluya el cultivo nocturno de OP50 en 2000 en 300 mililitros de TB que contenga 50 microgramos por mililitro de ampicilina. Incube el cultivo en un agitador bacteriano durante ocho a doce horas a 37 grados Celsius hasta alcanzar la saturación. No permita que el cultivo crezca más de 14 horas.Transfiera el OP 50 a un tubo de centrifugación estéril previamente pesado. Pelote el OP 50 mediante centrifugación durante 10 minutos a 3.500 RPM o 2.200 × g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante S, resuspenda el pellet de OP 50 en agua destilada y vuelva a pelotar por centrifugación. Repita este lavado dos veces después del segundo.Lave cuidadosamente y elimine por completo todo el agua restante. Pese el tubo de centrifugación que contiene el sedimento y reste el peso del tubo de centrifugación vacío para determinar el peso del sedimento. A continuación, resuspenda completamente el sedimento en S Complete hasta una concentración de 100 miligramos por mililitro.No deben quedar grumos. La concentración de 100 miligramos por mililitro de OP 50 debe corresponder a dos veces 10 a la 10 bacterias por mililitro. Utilice el espectrofotómetro para determinar el número de bacterias por mililitro si se conoce la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mililitro.Si es necesario, ajuste la concentración de la solución alimenticia OP50 a dos veces 10 a la 10 bacterias por mililitro. Finalmente, almacene la solución OP50 a cuatro grados Celsius hasta que se utilice para el cultivo de gusanos, con el fin de generar una población de gusanos sincronizada por edad. Comience a última hora de la tarde del día menos seis con una placa NGM de cinco a 10 días de antigüedad en la que la población de gusanos consista principalmente en larvas L1 desnutridas.Esterilice una espátula metálica calentándola brevemente sobre un mechero Bunsen. Déjela enfriar. Luego, utilice la espátula fría para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos en ayunas.Transfiera varios de estos fragmentos a una placa fresca de NGM de 10 centímetros sembrada con OP50. Incube los gusanos durante aproximadamente 65 horas a 20 grados Celsius hasta que la mayoría de la población de gusanos consista en adultos graves. El tiempo que tardan los animales L1 en ayunas en desarrollarse hasta adultos graves puede variar según la cepa.Después de la incubación, recolecte los gusanos de la placa de 10 centímetros lavándolos de la placa con cinco a 10 mililitros de agua estéril. Transfiera la solución de gusanos y agua a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los gusanos centrifugando durante dos minutos en una centrífuga de mesa a 1.200 RPM o 280 veces G. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de agua.Repita el paso de lavado, retire el sobrenadante SUP y agregue cinco mililitros de hipoclorito recién preparado. Incube con solución de hidróxido de sodio durante cinco minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abran. Asegúrese de hacer vórtex suavemente cada minuto.Monitoree el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico tan pronto como todos los adultos se disuelvan. Añada cinco mililitros de tampón M nueve para neutralizar la reacción. Lave los huevos tres veces con 10 mililitros de tampón M nueve centrifugando durante dos minutos a 2 500 RPM o 1 100 ×g. Luego lave los huevos una vez con 10 mililitros de S completo centrifugando durante dos minutos a 2 500 RPM o 1 100 ×g. Retire el sobrenadante.Añada 10 mililitros de S completo y transfiera la solución a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Añada 30 mililitros de S completo para obtener un volumen final de 40 mililitros. Agite suavemente el tubo durante la noche a temperatura ambiente en un agitador o dispositivo similar para sembrar las placas de animales al día siguiente alrededor del mediodía.Bajo un microscopio estereoscópico, verifique si los gusanos eclosionaron durante la noche. Determine la concentración de gusanos en la solución S completa contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Utilizando un microscopio estereoscópico, cuente al menos 10 gotas para cada muestra.Resus.Suspenda los gusanos a una concentración de 80 a 100 gusanos por mililitro. En medio S completo, agregue carbenicilina hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro y anfotericina B hasta una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agite en un agitador. Si se preparan cantidades mayores de gusanos, utilice un matraz no clon de 600 mililitros con tapón filtrante. A las 2:30 PM, agregue el OP 50 preparado en la parte uno hasta una concentración final de seis miligramos por mililitro. Devuelva el OP 50 a cuatro grados Celsius. Transfiera 120 microlitros de la solución de gusanos con OP 50 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo transparente.Asegúrese de mantener los gusanos y la suspensión mientras pipetea; selle la placa utilizando un sellador adhesivo para evitar contaminación y evaporación. Agite la placa en un agitador para placas microtituladoras durante dos minutos e incube durante dos días a 20 grados Celsius hasta que los animales alcancen la etapa L4. A continuación, para esterilizar los animales, agregue 30 microlitros de una solución stock de FUDR 0,6 milimolar a cada pocillo.Este paso lleva el volumen final en cada pocillo a 150 microlitros y reduce la concentración final de OP 50 de seis miligramos por mililitro a cinco miligramos por mililitro. Selle la placa utilizando selladores adhesivos y agítela durante dos a tres minutos en un agitador para microplacas. Si el OP 50 se agregó a las 2:30 del día menos dos, es importante que el FUDR se agregue antes del mediodía y que las placas se devuelvan al incubador a 20 grados Celsius para las 9:00 AM del día siguiente.La mayoría de los animales deben estar graves y contener varios huevos. Añadir a cada uno los fármacos cuyo efecto sobre la longevidad se desea probar, en la concentración deseada. Si se disuelven los fármacos en DMSO, la concentración final de DMSO no debe superar el 0,6%, ya que concentraciones de DMSO superiores al 0,6% acortan la longevidad de *C. elegans* tras la adición del fármaco.Selle las placas con un sellador adhesivo y agítelas durante dos o tres minutos en un agitador para placas microtituladoras. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius. La adición de fármacos puede matar ocasionalmente algunos animales por placa, especialmente si se utiliza un disolvente distinto al agua.Utilice un microscopio invertido para verificar la presencia de animales muertos. Por lo general, debería haber menos de 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius durante dos días para permitir que entre oxígeno fresco en el cultivo. Retire el sellador.Espere un minuto y selle nuevamente la placa. Agite la placa durante dos o tres minutos en un agitador de placas microtiter, repita una vez cada semana en el día cinco de la vida adulta; agregue cinco microlitros de la solución OP50 de 100 miligramos por mililitro preparada anteriormente a cada uno de los 96 pocillos para prevenir el ayuno. Los gusanos se evalúan por su longevidad según su movimiento tres veces por semana desde el inicio del experimento hasta su muerte.Utilice un microscopio invertido con un objetivo de 2 x o 2,5 x para observar los gusanos en placas de 96 pozos el día cero, al inicio del experimento. Cuente el número total de gusanos en cada pozo.Los pocillos del sensor que contengan más de 18 animales a partir del análisis presentarán escasez de OP 50 y mostrarán efectos de restricción dietética en cada sesión de conteo. Registre la fecha y el número de animales que se mueven como animales vivos. El movimiento y el líquido son mucho más fáciles que en medios sólidos y pueden inducirse mediante luces intensas.El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los que ocurren en la punta de la faringe. Tales movimientos sutiles a menudo son los únicos observados en animales muy viejos. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius.Repita las sesiones de conteo cada dos o tres días hasta que todos los animales mueran. Este es un diseño de una hoja de Excel para registrar los datos de longevidad de cada pocillo. En ella se anota la cepa en la placa, la concentración del fármaco, y el número total de animales vivos en el día cero, que se registra al inicio del experimento.Registre la fecha, así como el número de animales vivos y muertos, tres veces por semana para seguir la supervivencia de las diversas poblaciones en cada pocillo. Esta figura muestra los resultados de *C. elegans*, curvas de longevidad registradas a 20 grados Celsius y 25 grados Celsius. El ensayo de longevidad basado en microplacas reproduce con precisión los cambios dependientes de la temperatura en la longevidad.De manera similar, tal como se muestra aquí, el ensayo en placa de microtitulación reproduce los cambios en la longevidad de mutantes que se ha informado tienen una duración de vida diferente a la del tipo salvaje N2. Esta figura muestra cómo dosis crecientes de mirtazapina afectan la longevidad media de *C. elegans*. Los datos obtenidos mediante el ensayo en placa de microtitulación son lo suficientemente cuantitativos como para determinar relaciones de respuesta a la dosis. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para tamizar grandes bibliotecas químicas en busca de moléculas que prolonguen la longevidad en *C. elegans*.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

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Biología

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Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

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Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

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