Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

El objetivo general de este procedimiento es medir la longevidad de gusanos nematodos marinos tratados con fármacos de interés. Esto se logra primero preparando OP 50, una cepa bacteriana, que se utiliza para alimentar a los gusanos. Luego, se genera una población de gusanos sincronizada por edad y se siembra en placas de 96 pocillos junto con la bacteria alimenticia OP 50.

Durante los próximos dos días, los gusanos crecen hasta la etapa larval L4 y se añade el fármaco FUDR para evitar la reproducción. Al día siguiente, los gusanos alcanzan la edad adulta y se añaden los fármacos de interés a los pocillos individuales. A partir de este momento, el número de gusanos vivos y muertos se determina cada dos o tres días hasta que todos los gusanos han muerto.

La observación se realiza utilizando un microscopio invertido y se registra el número de gusanos muertos y vivos en cada sesión. Hola, soy Greg Solis. Estoy en el Laboratorio Petro del Departamento de Fisiología Química del Instituto de Investigación Scripps.

Hoy les mostraré cómo sincronizar gusanos y distribuirlos en placas de microtitulación de 96 pocillos. La principal ventaja de esta técnica frente a sus métodos existentes es que permite la identificación rápida de moléculas que prolongan la longevidad en C. elegans. Así que comencemos.

Para preparar bacterias para alimentación de C. elegans, comience el día menos siete inocular cinco mililitros de TB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina y 0,1 microgramos por mililitro de tetraciclina B con una colonia individual de OP50, e incubar durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador bacteriano. A la mañana siguiente, diluya el cultivo nocturno de OP50 en 2000 en 300 mililitros de TB que contenga 50 microgramos por mililitro de ampicilina. Incube el cultivo en un agitador bacteriano durante ocho a doce horas a 37 grados Celsius hasta alcanzar la saturación. No permita que el cultivo crezca más de 14 horas.

Transfiera el OP 50 a un tubo de centrifugación estéril previamente pesado. Pelote el OP 50 mediante centrifugación durante 10 minutos a 3.500 RPM o 2.200 × g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante S, resuspenda el pellet de OP 50 en agua destilada y vuelva a pelotar por centrifugación. Repita este lavado dos veces después del segundo.

Lave cuidadosamente y elimine por completo todo el agua restante. Pese el tubo de centrifugación que contiene el sedimento y reste el peso del tubo de centrifugación vacío para determinar el peso del sedimento. A continuación, resuspenda completamente el sedimento en S Complete hasta una concentración de 100 miligramos por mililitro.

No deben quedar grumos. La concentración de 100 miligramos por mililitro de OP 50 debe corresponder a dos veces 10 a la 10 bacterias por mililitro. Utilice el espectrofotómetro para determinar el número de bacterias por mililitro si se conoce la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mililitro.

Si es necesario, ajuste la concentración de la solución alimenticia OP50 a dos veces 10 a la 10 bacterias por mililitro. Finalmente, almacene la solución OP50 a cuatro grados Celsius hasta que se utilice para el cultivo de gusanos, con el fin de generar una población de gusanos sincronizada por edad. Comience a última hora de la tarde del día menos seis con una placa NGM de cinco a 10 días de antigüedad en la que la población de gusanos consista principalmente en larvas L1 desnutridas.

Esterilice una espátula metálica calentándola brevemente sobre un mechero Bunsen. Déjela enfriar. Luego, utilice la espátula fría para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos en ayunas.

Transfiera varios de estos fragmentos a una placa fresca de NGM de 10 centímetros sembrada con OP50. Incube los gusanos durante aproximadamente 65 horas a 20 grados Celsius hasta que la mayoría de la población de gusanos consista en adultos graves. El tiempo que tardan los animales L1 en ayunas en desarrollarse hasta adultos graves puede variar según la cepa.

Después de la incubación, recolecte los gusanos de la placa de 10 centímetros lavándolos de la placa con cinco a 10 mililitros de agua estéril. Transfiera la solución de gusanos y agua a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los gusanos centrifugando durante dos minutos en una centrífuga de mesa a 1.200 RPM o 280 veces G. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de agua.

Repita el paso de lavado, retire el sobrenadante SUP y agregue cinco mililitros de hipoclorito recién preparado. Incube con solución de hidróxido de sodio durante cinco minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abran. Asegúrese de hacer vórtex suavemente cada minuto.

Monitoree el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico tan pronto como todos los adultos se disuelvan. Añada cinco mililitros de tampón M nueve para neutralizar la reacción. Lave los huevos tres veces con 10 mililitros de tampón M nueve centrifugando durante dos minutos a 2 500 RPM o 1 100 ×g. Luego lave los huevos una vez con 10 mililitros de S completo centrifugando durante dos minutos a 2 500 RPM o 1 100 ×g. Retire el sobrenadante.

Añada 10 mililitros de S completo y transfiera la solución a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Añada 30 mililitros de S completo para obtener un volumen final de 40 mililitros. Agite suavemente el tubo durante la noche a temperatura ambiente en un agitador o dispositivo similar para sembrar las placas de animales al día siguiente alrededor del mediodía.

Bajo un microscopio estereoscópico, verifique si los gusanos eclosionaron durante la noche. Determine la concentración de gusanos en la solución S completa contando el número de gusanos en gotas de 10 microlitros. Utilizando un microscopio estereoscópico, cuente al menos 10 gotas para cada muestra.Resus.

Suspenda los gusanos a una concentración de 80 a 100 gusanos por mililitro. En medio S completo, agregue carbenicilina hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro y anfotericina B hasta una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agite en un agitador.

Si se preparan cantidades mayores de gusanos, utilice un matraz no clon de 600 mililitros con tapón filtrante. A las 2:30 PM, agregue el OP 50 preparado en la parte uno hasta una concentración final de seis miligramos por mililitro. Devuelva el OP 50 a cuatro grados Celsius. Transfiera 120 microlitros de la solución de gusanos con OP 50 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo transparente.

Asegúrese de mantener los gusanos y la suspensión mientras pipetea; selle la placa utilizando un sellador adhesivo para evitar contaminación y evaporación. Agite la placa en un agitador para placas microtituladoras durante dos minutos e incube durante dos días a 20 grados Celsius hasta que los animales alcancen la etapa L4. A continuación, para esterilizar los animales, agregue 30 microlitros de una solución stock de FUDR 0,6 milimolar a cada pocillo.

Este paso lleva el volumen final en cada pocillo a 150 microlitros y reduce la concentración final de OP 50 de seis miligramos por mililitro a cinco miligramos por mililitro. Selle la placa utilizando selladores adhesivos y agítela durante dos a tres minutos en un agitador para microplacas. Si el OP 50 se agregó a las 2:30 del día menos dos, es importante que el FUDR se agregue antes del mediodía y que las placas se devuelvan al incubador a 20 grados Celsius para las 9:00 AM del día siguiente.

La mayoría de los animales deben estar graves y contener varios huevos. Añadir a cada uno los fármacos cuyo efecto sobre la longevidad se desea probar, en la concentración deseada. Si se disuelven los fármacos en DMSO, la concentración final de DMSO no debe superar el 0,6%, ya que concentraciones de DMSO superiores al 0,6% acortan la longevidad de *C. elegans* tras la adición del fármaco.

Selle las placas con un sellador adhesivo y agítelas durante dos o tres minutos en un agitador para placas microtituladoras. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius. La adición de fármacos puede matar ocasionalmente algunos animales por placa, especialmente si se utiliza un disolvente distinto al agua.

Utilice un microscopio invertido para verificar la presencia de animales muertos. Por lo general, debería haber menos de 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius durante dos días para permitir que entre oxígeno fresco en el cultivo. Retire el sellador.

Espere un minuto y selle nuevamente la placa. Agite la placa durante dos o tres minutos en un agitador de placas microtiter, repita una vez cada semana en el día cinco de la vida adulta; agregue cinco microlitros de la solución OP50 de 100 miligramos por mililitro preparada anteriormente a cada uno de los 96 pocillos para prevenir el ayuno. Los gusanos se evalúan por su longevidad según su movimiento tres veces por semana desde el inicio del experimento hasta su muerte.

Utilice un microscopio invertido con un objetivo de 2 x o 2,5 x para observar los gusanos en placas de 96 pozos el día cero, al inicio del experimento. Cuente el número total de gusanos en cada pozo.

Los pocillos del sensor que contengan más de 18 animales a partir del análisis presentarán escasez de OP 50 y mostrarán efectos de restricción dietética en cada sesión de conteo. Registre la fecha y el número de animales que se mueven como animales vivos. El movimiento y el líquido son mucho más fáciles que en medios sólidos y pueden inducirse mediante luces intensas.

El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los que ocurren en la punta de la faringe. Tales movimientos sutiles a menudo son los únicos observados en animales muy viejos. Devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius.

Repita las sesiones de conteo cada dos o tres días hasta que todos los animales mueran. Este es un diseño de una hoja de Excel para registrar los datos de longevidad de cada pocillo. En ella se anota la cepa en la placa, la concentración del fármaco, y el número total de animales vivos en el día cero, que se registra al inicio del experimento.

Registre la fecha, así como el número de animales vivos y muertos, tres veces por semana para seguir la supervivencia de las diversas poblaciones en cada pocillo. Esta figura muestra los resultados de *C. elegans*, curvas de longevidad registradas a 20 grados Celsius y 25 grados Celsius. El ensayo de longevidad basado en microplacas reproduce con precisión los cambios dependientes de la temperatura en la longevidad.

De manera similar, tal como se muestra aquí, el ensayo en placa de microtitulación reproduce los cambios en la longevidad de mutantes que se ha informado tienen una duración de vida diferente a la del tipo salvaje N2. Esta figura muestra cómo dosis crecientes de mirtazapina afectan la longevidad media de *C. elegans*. Los datos obtenidos mediante el ensayo en placa de microtitulación son lo suficientemente cuantitativos como para determinar relaciones de respuesta a la dosis. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para tamizar grandes bibliotecas químicas en busca de moléculas que prolonguen la longevidad en *C. elegans*.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.