Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas
29 de noviembre de 2010
Una introducción a la tecnología, el protocolo y el manejo de los vasos Corning HyperStack y accesorios utilizados para el alto rendimiento de la cultura de células adherentes. El protocolo se mostrará cómo utilizar los vasos sistema cerrado para la recolección de células cada vez más de los productos actuales de la placa de apilado.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso correcto del sistema cerrado de los biorreactores apilados Corning Hypers. Esto se logra primero inoculando y llenando los biorreactores con medio mediante el método de alimentación por gravedad. A continuación, la suspensión celular se aísla en cada una de las capas y las células se incuban.
Tras la incubación, se elimina el medio gastado. El paso final del procedimiento consiste en recolectar las células de los biorreactores tipo hyperstack. Finalmente, se obtienen los resultados de difusión de gases para mostrar la capacidad de las células de acceder al oxígeno durante el crecimiento hasta alcanzar la confluencia cuando se utiliza el sistema cerrado tipo hyperstack.
La principal ventaja del vaso Hypers Stack con material permeable al gas es que proporciona una mayor área de superficie para el crecimiento celular. Al eliminar el espacio de cabeza en el vaso, mi colega p pardo demostrará ahora un protocolo de sistema cerrado para el uso del vaso Hypers Stack. El vaso Hypers Stack está compuesto por un stat, que es el compartimento individual de cultivo celular formado por la placa superior y la película permeable al gas.
Las células se cultivan dentro de este compartimento. El colector de líquidos conecta cada una de las capas entre sí dentro de un módulo. Los módulos están conectados mediante tubos para formar vasos en múltiplos de 12 capas.
El múltiple permite al usuario realizar una sola manipulación de fluido en todo el recipiente. El múltiple de aire también conecta las capas stat entre sí, pero se utiliza para desplazar el aire del recipiente cuando se añaden líquidos y contiene una línea de llenado para usar durante el llenado entre cada una. La capa stat es un espacio abierto de aire denominado espacio traqueal, que permite el intercambio de gases a través de la película permeable a los gases de cada capa.
El tubo de manipulación de líquidos se conecta al manifold de líquidos y es un componente personalizable utilizado para realizar todas las manipulaciones de fluidos en sistema cerrado, liberando el exceso de aire mientras se mantiene la esterilidad. Se utiliza el tubo de ventilación. El tubo de ventilación se conecta al manifold de aire y contiene un filtro de aire.
Conectado al tubo de manipulación de líquidos se encuentra el tubo de lavado y el filtro, que se utilizan para evacuar el fluido del tubo de manipulación de líquidos después de llenar el recipiente. También se utiliza en este protocolo el manipulador Corning Stack o CSM, que es un dispositivo de manejo que ayuda a colocar los recipientes en las posiciones correctas durante su uso. En esta demostración, se muestra el cultivo celular en sistema cerrado para un recipiente permeable al gas de 36 capas.
Utilizando un CSM, sin embargo, los detalles para realizar este procedimiento en un recipiente de 12 capas usando una cuña de llenado se encuentran en el protocolo escrito adjunto. Comience preparando 3,9 litros de medio en bolsa antes de inocular el tubo de medio. Humedezca la bolsa de suero con la bolsa de medio y mezcle bien para obtener la concentración deseada de suero.
Pinche aproximadamente 300 mililitros de medio en la bolsa utilizando pinzas grandes para bolsas. Esto asegurará que todas las células inoculadas se utilicen durante el llenado, y que no queden en la bolsa de medio. Coloque el medio en un soporte para bolsas para inocular el medio.
Llene una jeringa conectada a un tubo con la suspensión celular. Conecte la jeringa que contiene la suspensión celular a la bolsa de medio mediante soldadura de tubos. Tres sobre 16 pulgadas de tubo desde la jeringa hasta la bolsa.
Introduzca la suspensión celular en la bolsa de medio y mezcle bien. La bolsa de medio inoculada puede conectarse al tubo de manipulación de líquidos de tres octavos de pulgada del recipiente mediante soldadura de tubos o conectores multipropósito. Hoy utilizaremos soldadura de tubos.
Cierre las pinzas de los tubos de manipulación de líquidos y de seguimiento del recipiente. Coloque el recipiente de 36 capas en un CSM en la posición de carga. Enganche el tubo del filtro de ventilación en la pinza de sujeción del CSM.
Ajuste la tapa y mueva el CSM a la posición de llenado para colocar el filtro de aire en la posición más alta, a fin de prevenir su humectación durante la operación de llenado. El ángulo de 10 grados también permite la equilibración del líquido con las capas durante el llenado, eliminando el aire de la línea de llenado. Colocando la bolsa de medio al mismo nivel que el recipiente y manteniendo la pinza del tubo de arrastre cerrada.
Abrir la abrazadera del tubo de manipulación de líquidos y la abrazadera de la bolsa de medio para permitir que el fluido ingrese al recipiente. Utilizando el soporte para bolsas, elevar la bolsa de medio para ayudar al flujo de la suspensión celular hacia el recipiente. Llenar el recipiente hasta que todo el medio inoculado entre en él.
La parte superior de la bolsa de medio aún debe contener 300 mililitros de medio. Retire la pinza de la bolsa de medio para continuar llenando el recipiente cuando el líquido se acerque al colector de aire superior. Reduzca la velocidad de llenado bajando la bolsa de medio para evitar un llenado excesivo.
Lleve lentamente el nivel del líquido hasta la línea de llenado y agrupe el tubo de manipulación de líquidos. Coloque el recipiente en la posición de aislamiento en el CSM, colocando ambos conjuntos de colectores en la posición más alta. Baje la bolsa de medio por debajo de la altura del recipiente.
Manteniendo el filtro de arrastre en posición vertical, abra la pinza del tubo de arrastre. Esto vaciará o devolverá el medio presente en el tubo de manipulación de líquidos hacia la bolsa de medio. Una vez que el tubo esté vacío, cierre la pinza del tubo de la bolsa de medio.
Manteniendo el filtro del tubo de arrastre en posición vertical. Abra la pinza del tubo de manejo de líquidos del recipiente para permitir que el líquido restante entre y se equilibre en el recipiente. Espere de uno a dos minutos para que esto ocurra.
A continuación, gire el recipiente en el MCE de modo que los colectores queden a la izquierda. Baje el recipiente a la posición de carga en el MCE. Cierre las abrazaderas en los tubos de arrastre y de manipulación de líquidos.
La bolsa de medio puede retirarse ahora del recipiente, o puede permanecer conectada para su uso posterior en el procedimiento de cosecha. Para almacenar la bolsa de medio conectada, enrolle la bolsa y colóquela debajo de las bandas de sujeción en la bandeja de almacenamiento del recipiente. Finalmente, traslade el recipiente al incubador. Al transportar el recipiente, tenga cuidado de evitar que cualquier líquido ingrese al filtro de ventilación de aire.
Esto se logra inclinando ligeramente el extremo del colector hacia arriba. Para comenzar el procedimiento de recolección, una el tubo, la solución de asociación de células y las bolsas de neutralización para formar el conjunto de bolsa de recolección; asegúrese de que todas las pinzas del tubo estén cerradas. Retire el recipiente del incubador y colóquelo en el CSM en la posición de carga.
Suelte la bolsa del medio de debajo de las bandas de retención y cuelguela en el soporte. A continuación, apriete la tapa para asegurar el recipiente. Enganche el tubo de ventilación en la abrazadera de sujeción y mueva el CSM a la posición de llenado.
Asegurándose de que la bolsa de medio esté colgando más baja que el recipiente en el soporte para bolsas. Abra la pinza del tubo de la bolsa de medio y del tubo de manejo de líquidos del recipiente para permitir que el medio fluya hacia la bolsa conectada. Una vez que el recipiente esté aproximadamente tres cuartos vacío, cambie la configuración de CSM a la posición final de vaciado.
Cuando el recipiente y la tubería de manipulación de líquidos estén vacíos, levante la tubería para hacer avanzar el medio más allá del pinzamiento en la tubería de la bolsa de medio gastado. Luego cierre tanto el pinzamiento en la tubería de manipulación de líquidos como el pinzamiento en la tubería de la bolsa de medio gastado. Sustituya la bolsa de medio gastado por el conjunto de la bolsa de recolección mediante soldadura de tubos.
Eleve la altura del conjunto de la bolsa de disociación celular por encima de la altura del recipiente utilizando el soporte para bolsas. Coloque el CSM en la posición de llenado. Abra la pinza del tubo de la solución de disociación celular y la pinza del conjunto de la bolsa de recolección, y transfiera la solución al recipiente.
Cuando la transferencia esté completa, cierre las pinzas del tubo de manipulación de líquidos y del tubo de solución de disociación celular. A continuación, mueva el CSM a la posición de carga manteniendo la palanca de posicionamiento horizontal abierta. Mueva suavemente el recipiente de un lado a otro utilizando la rueda, distribuyendo así la solución sobre las capas celulares.
El recipiente puede volver ocasionalmente a la posición de llenado durante el balanceo para mantener una distribución uniforme de la solución. Una vez que la solución se haya distribuido adecuadamente, suelte la palanca del CSM para fijarla en la posición de llenado. Deje el recipiente en esta posición durante el tiempo de disociación requerido para las células.
Utilice la turbidez como guía para determinar la desprendimiento celular. Una vez desprendidas, mueva el CSM a la posición de carga. Abra la pinza de la bolsa de enfriamiento y la pinza del tubo de manejo de líquidos para permitir que el medio de enfriamiento ingrese al recipiente.
Cierre la pinza del tubo de manipulación de líquidos. Una vez completada la transferencia, regrese el CSM a la posición de carga y sostenga la palanca de posicionamiento horizontal para mover el recipiente de un lado a otro. Utilizando el soporte para bolsas, baje la posición del conjunto de la bolsa de recolección por debajo del nivel del recipiente.
Ajuste el CSM a la posición vacía. Abra la abrazadera del tubo de manipulación de líquidos del recipiente y transfiera la solución celular nuevamente al bolsa de enfriamiento. Regrese el CSM a la posición de carga y desconecte el conjunto de la bolsa de cosecha del recipiente utilizando un sellador de tubos.
Ahora la solución celular está lista para su procesamiento en sistemas tradicionales de crecimiento celular. Con el espacio de cabeza, el oxígeno en el medio se agota en un promedio del 50 % durante tres días. En cultivo, esta figura muestra la disminución en miligramos por litro de oxígeno a nivel de las células a lo largo del tiempo en el mismo sistema de crecimiento; el gradiente de oxígeno a través de una altura de medio de tres milímetros es casi un 50 % mayor en la unión entre el medio y el espacio de cabeza que en la capa celular.
Se muestra el porcentaje de oxígeno en el espacio traqueal del apilamiento hipers durante el crecimiento celular. La figura muestra que durante 96 horas, el porcentaje de oxígeno entre las capas, que abastece cada fondo de película permeable a los gases, permanece constante. Esto demuestra la capacidad de las células para acceder al oxígeno durante el crecimiento hasta alcanzar la confluencia.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llenar y cosechar el recipiente Corning Hypers stack en el sistema cerrado.
Resumen
Este artículo presenta los recipientes Corning HYPERStack y sus accesorios, diseñados para el cultivo de células adherentes con alto rendimiento. El protocolo demuestra el uso de estos recipientes en un sistema cerrado para mejorar la eficiencia de la recolección de células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Tecnología de cultivo celular
- Recolección de células adherentes
- Protocolos de sistema cerrado
Antecedentes
- Los recipientes Corning HYPERStack proporcionan un área de superficie aumentada para el crecimiento celular.
- Los materiales permeables a los gases permiten un intercambio gaseoso eficiente durante el cultivo celular.
- El diseño de sistema cerrado minimiza los riesgos de contaminación.
- El uso de un manifold líquido simplifica las manipulaciones de fluidos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el uso correcto de los recipientes Corning HYPERStack.
- Mostrar cómo inocular y llenar eficazmente los recipientes.
- Describir los pasos para la recolección de células a partir de los recipientes.
Métodos Utilizados
- Inoculación del medio con suspensión celular.
- Método de alimentación por gravedad para llenar los recipientes.
- Uso de un manipulador Corning Stack para manejar los recipientes.
- Soldadura de tubos para conectar el medio y los tubos de manejo.
Resultados principales
- Llenado e inoculación exitosos de los vasos HYPERStack.
- Intercambio gaseoso eficiente observado durante el crecimiento celular.
- Recolección celular mejorada demostrada mediante el sistema cerrado.
- El protocolo permite una manipulación sencilla y el mantenimiento de la esterilidad.
Conclusiones
- Los recipientes Corning HYPERStack son eficaces para cultivos celulares de alto rendimiento.
- Los protocolos de sistema cerrado mejoran significativamente la eficiencia de recolección de células.
- Los materiales permeables a los gases son ventajosos para el crecimiento celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cultivo de células adherentes en sistema cerrado utilizando recipientes permeables a los gases aborda los desafíos de escalabilidad en la fabricación de productos biológicos al aumentar el rendimiento por unidad de superficie, manteniendo al mismo tiempo la esterilidad. Este enfoque favorece la intensificación del proceso en la producción de terapias celulares y vacunas, donde los sistemas cerrados son fundamentales para cumplir con los requisitos regulatorios. La tecnología permite alcanzar mayores densidades celulares sin ampliar la superficie de la instalación, mejorando así la eficiencia del capital en el procesamiento aguas arriba.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la expansión escalable de células adherentes para ensayos de validación de dianas que requieren un elevado número de células.
- Valor operativo: Reduce el consumo de medio y reactivos por rendimiento celular mediante la minimización del espacio de cabeza y un intercambio gaseoso eficiente.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Proporciona capas de células adherentes reproducibles para obtener resultados de ensayos consistentes en campañas de cribado de fármacos.
- Valor operativo: Estandariza la densidad de siembra celular entre capas mediante la distribución a través de un manifold líquido, lo que mejora la variabilidad entre ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la generación de células adherentes de grado clínico para pruebas preclínicas de eficacia y seguridad bajo condiciones cerradas.
- Valor operativo: Facilita la transición sin interrupciones desde procesos a escala de investigación hasta procesos compatibles con las Buenas Prácticas de Manufactura utilizando la misma arquitectura de recipiente.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El sistema HYPERStack se integra en los flujos de trabajo de producción de células adherentes desde la expansión hasta la cosecha, apoyando el procesamiento continuo en las líneas de producción de vacunas y proteínas terapéuticas.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis en modelos de células adherentes a escalas relevantes para estudios de interacción con dianas.
- Cribado: Proporciona resultados celulares cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos en la evolución de impactos iniciales a compuestos líderes.
- Análisis: Permite el monitoreo de oxígeno y metabolitos mediante una película permeable a gases para evaluar la salud del cultivo y la actividad metabólica.
- Investigación Traducional: Mantiene la fidelidad fenotípica durante la ampliación, fundamental para la consistencia traslacional en terapias basadas en células.
- Reutilización Empresarial: El diseño modular permite su reutilización en múltiples líneas celulares y procesos, reduciendo el gasto de capital por campaña.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Rendimiento predictivo del cultivo mediante un intercambio gaseoso estable y efectos de gradiente reducidos en comparación con las placas apiladas tradicionales.
- Valor operativo: Los recorridos cerrados de fluidos minimizan la intervención del operador, reduciendo el riesgo de contaminación y la intensidad de mano de obra.
- Valor estratégico: Un mayor rendimiento por corrida mejora la consistencia del lote y reduce el costo de los productos en la fabricación de biológicos.
- Impacto en el portafolio: Permite la asignación con mayor gestión de riesgos de recursos de células adherentes en múltiples proyectos a partir de una sola plataforma.
Consideraciones de Implementación
- Capacitación en soldadura aséptica de tubos y manipulación de múltiples conexiones para garantizar la integridad del sistema cerrado.
- Integración con incubadoras estándar y cabinas de seguridad biológica mediante el manipulador de pilas Corning para la colocación de los recipientes.
- Validación de las tasas de difusión de gases para ajustarlas a las demandas metabólicas de líneas celulares adherentes específicas.
- Adaptación de los protocolos de recolección (enzimáticos o mecánicos) a la geometría del recipiente y a la accesibilidad de la capa celular.
- Monitoreo de la presión en los tubos de manejo de líquidos y de las tasas de flujo para prevenir el estrés por cizalladura durante la ampliación de escala.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:06
Title
1:06
HYPERStack Vessel Component Summary
2:44
Vessel Preparation
5:34
Isolation Procedure to Lock Liquid into the Layers
7:09
Harvest Protocol
10:37
Gas Diffusion Results through Gas Permeable Film used in the HYPERStack Vessels
11:31
Conclusion
