Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas
November 29th, 2010
Una introducción a la tecnología, el protocolo y el manejo de los vasos Corning HyperStack y accesorios utilizados para el alto rendimiento de la cultura de células adherentes. El protocolo se mostrará cómo utilizar los vasos sistema cerrado para la recolección de células cada vez más de los productos actuales de la placa de apilado.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso correcto del sistema cerrado de los recipientes apilados Corning Hypers. Esto se logra primero inoculando y llenando los recipientes con medios a través del método de alimentación por gravedad. A continuación, se aísla la suspensión celular en cada una de las capas y se incuban las células.
Después de la incubación, se retira el medio gastado. El paso final del procedimiento es recolectar las células de los recipientes de la pila de hipers. En última instancia, los resultados de la difusión de gas se obtienen para mostrar la capacidad de las células para acceder al oxígeno durante el crecimiento y la fluidez cuando se utiliza el sistema cerrado de pila de hipervelocidad.
La principal ventaja del recipiente de pila hypers con material permeable al gas es que proporciona una mayor área de superficie para el crecimiento celular. Al eliminar el espacio de cabeza en el recipiente, mi colega p pardo ahora demostrará un protocolo de sistema cerrado para usar el recipiente de pila hypers. El recipiente de pila hypers está compuesto por un stat, que es el compartimento de cultivo celular individual que se compone de la placa superior y una película permeable al gas.
Las células se cultivan dentro de este compartimento. El colector de líquido conecta cada una de las capas ette dentro de un módulo. Los módulos se conectan con tubos para formar recipientes en múltiplos de 12 capas.
El colector permite al usuario realizar una manipulación de fluido en todo el recipiente. El colector de aire también conecta las capas de estadísticas entre sí, pero se utiliza para desplazar el aire del recipiente cuando se producen adiciones de fluido y contiene una línea de llenado para su uso durante el llenado entre cada una. La capa de estat es un espacio al aire libre llamado espacio traqueal, que permite que se produzca el intercambio de gases a través de la película permeable al gas de cada capa.
El tubo de manejo de líquidos está conectado al colector de líquidos y es un componente personalizable que se utiliza para realizar todas las manipulaciones de fluidos del sistema cerrado para liberar el exceso de aire mientras se mantiene la esterilidad. Se utiliza el tubo de ventilación. El tubo de ventilación está conectado al colector de aire y contiene un filtro de aire.
Conectado a la tubería de manejo de líquidos se encuentra la tubería de persecución y el filtro, que se utilizan para evacuar el fluido de la tubería de manejo de líquidos después de llenar el recipiente. También se utiliza en este protocolo el manipulador Corning Stack o CSM, que es un dispositivo de manipulación para ayudar a colocar los recipientes en las posiciones correctas durante su uso. En esta demostración, se demuestra el cultivo celular de sistema cerrado para un recipiente permeable al gas de 36 capas.
Sin embargo, utilizando un CSM, los detalles para realizar este procedimiento en un recipiente de 12 capas utilizando una cuña de relleno se pueden encontrar en el protocolo escrito adjunto. Comience preparando 3,9 litros de medio embolsado antes de inocular el tubo de medio. Humedece la bolsa de suero en la bolsa de medios y mezcla bien para obtener la concentración de suero deseada.
Sujete aproximadamente 300 mililitros de medios en la bolsa con abrazaderas de bolsa grandes. Esto asegurará que todas las células inoculadas se utilicen durante el llenado y que no quede ninguna en la bolsa de medios. Coloque los medios en un soporte de bolsa para inocular los medios.
Llene una jeringa conectada al tubo con suspensión celular. Fije la jeringa que contiene la suspensión de celdas a la bolsa de medios mediante soldadura por tubo. Tres tubos de más de 16 pulgadas desde la jeringa hasta la bolsa.
Inyecte la suspensión de celdas en la bolsa de medios y mezcle bien. La bolsa de medios inoculados se puede conectar a la tubería de manejo de líquidos de tres más de ocho pulgadas del recipiente mediante soldadura de tubo o mediante conectores multipropósito. Hoy utilizaremos la soldadura de tubos.
Cierre las abrazaderas de los tubos de manipulación y persecución de líquidos del recipiente. Coloque el recipiente de 36 capas en A CSM en la posición de carga. Enganche el tubo del filtro de ventilación en la abrazadera de sujeción del CSM.
Apriete la tapa y mueva el CSM a la posición de llenado para colocar el filtro de aire en la posición más alta para evitar que se humedezca durante la operación de llenado. El ángulo de 10 grados también permite el equilibrio del líquido con las capas durante el llenado de aire limpio desde la línea de llenado. Colocando la bolsa de medios al mismo nivel que el recipiente, manteniendo cerrada la abrazadera del tubo de persecución.
Abra la abrazadera del tubo de manejo de líquidos y la abrazadera de la bolsa de medios para permitir que el fluido ingrese al recipiente. Usando el soporte de bolsa, levante la bolsa de medios para ayudar a que la suspensión de la célula fluya hacia el recipiente. Llene el recipiente hasta que todos los medios inoculados ingresen al recipiente.
La parte superior de la bolsa de medios aún debe contener 300 mililitros de medios. Retire la abrazadera de la bolsa de medios para continuar llenando el recipiente a medida que el líquido se acerca al colector de aire superior. Reduzca la velocidad de llenado bajando la bolsa de medios para evitar el llenado excesivo.
Lleve lentamente el nivel del líquido a la línea de llenado y agrupe el tubo de manejo de líquidos. Lleve el recipiente en el CSM a la posición de aislamiento colocando ambos conjuntos de colectores en la posición más alta. Baje la bolsa de medios por debajo de la altura del recipiente.
Con el filtro de persecución en posición vertical, abra la abrazadera del tubo de persecución. Esto vaciará o perseguirá los medios en el tubo de manejo de líquidos de regreso a la bolsa de medios. Una vez que el tubo esté vacío, cierre la abrazadera del tubo de la bolsa de medios.
Mantener el filtro de tubo de persecución en posición vertical. Abra la abrazadera en el tubo de manejo de líquidos del recipiente para permitir que cualquier líquido restante ingrese y se equilibre en el recipiente. Espere uno o dos minutos para que esto ocurra.
A continuación, gire el recipiente en el CSM de modo que los colectores queden a la izquierda. Baje el recipiente a la posición de carga en el CSM. Cierre las abrazaderas de los tubos de persecución y de manipulación de líquidos.
La bolsa de medios ahora puede retirarse del recipiente o puede permanecer unida para su uso posterior en el procedimiento de cosecha. Para almacenar la bolsa de medios adjunta, enrolle la bolsa de medios y colóquela debajo de las bandas de retención en la bandeja de almacenamiento del recipiente. Finalmente, mueva el recipiente a la incubadora Cuando transporte el recipiente, tenga cuidado de evitar que ningún líquido ingrese al filtro de ventilación de aire.
Esto se logra inclinando el extremo del colector ligeramente hacia arriba. Para comenzar el procedimiento de cosecha tubo, suelde la solución de asociación de celdas y enfríe las bolsas juntas Para formar el conjunto de la bolsa de cosecha, asegúrese de que todas las abrazaderas de los tubos estén cerradas. Retire el recipiente de la incubadora y colóquelo en el CSM en la posición de carga.
Suelte la bolsa de medios de debajo de las bandas de retención y cuélguela en la bolsa. A continuación, apriete la tapa para asegurar el recipiente. Enganche el tubo de ventilación en la abrazadera de retención y mueva el CSM a la posición de llenado.
Asegúrese de que la bolsa de medios en el soporte de la bolsa cuelgue más abajo que el recipiente. Abra la abrazadera del tubo de la bolsa de medios y el tubo de manejo de líquidos del recipiente para permitir que los medios fluyan hacia la bolsa adjunta. Una vez que el recipiente esté vacío en tres cuartos, cambie la configuración del CSM a la posición final de vacío.
Cuando el recipiente y el tubo de manipulación de líquidos estén vacíos, levante el tubo para perseguir el medio más allá de la abrazadera en el tubo de la bolsa de medios gastado. A continuación, cierre la abrazadera del tubo de manipulación de líquidos y la abrazadera del tubo de la bolsa de medios gastados. Reemplace la bolsa de medios gastada con el conjunto de la bolsa de recolección mediante soldadura de tubos.
Eleve la altura del conjunto de bolsa de disociación de la celda por encima de la altura del recipiente utilizando el soporte de bolsa. Coloque el CSM en la posición de relleno. Abra la abrazadera del tubo de solución de disociación celular y la abrazadera del ensamblaje de la bolsa de cosecha y transfiera la solución al recipiente.
Cuando se complete la transferencia, cierre las abrazaderas del tubo de manejo de líquidos y el tubo de solución de disociación celular. A continuación, lleve el CSM a la posición de carga mientras mantiene abierta la palanca de posicionamiento horizontal. Balancee suavemente el recipiente de lado a lado con la rueda, distribuyendo la solución sobre las capas celulares.
Ocasionalmente, el recipiente puede regresar a la posición de llenado durante el balanceo para mantener una distribución uniforme de la solución. Una vez que la solución se haya distribuido adecuadamente, suelte la palanca del CSM para bloquearla en la posición de llenado. Deje el recipiente en esta posición durante el tiempo de disociación requerido para las células.
Utilice la turbidez como guía para determinar el desprendimiento de células. Una vez desmontado, mueva el CSM a la posición de carga. Abra la abrazadera de la bolsa de enfriamiento y la abrazadera del tubo de manejo de líquidos para permitir que el medio de enfriamiento ingrese al recipiente.
Cierre la abrazadera del tubo de manipulación de líquidos. Una vez completada la transferencia, regrese el CSM a la posición de carga y sostenga la palanca de posicionamiento horizontal para balancear el recipiente de lado a lado. Usando el soporte de bolsas, baje la posición del conjunto de bolsas de cosecha por debajo del nivel del recipiente.
Ajuste el CSM a la posición vacía. Abra la abrazadera del tubo de manejo de líquidos del recipiente y transfiera la solución de celda nuevamente a la bolsa de enfriamiento. Regrese el CSM a la posición de carga y desconecte el conjunto de la bolsa de cosecha del recipiente con un sellador de tubos.
Ahora la solución celular está lista para su procesamiento en sistemas tradicionales de crecimiento celular. Con Headspace, el oxígeno en los medios se agota en un promedio del 50% durante tres días. En cultivo, esta figura muestra la disminución de miligramos por litro de oxígeno a nivel de las células a lo largo del tiempo en el mismo sistema de crecimiento, el gradiente de oxígeno a través de una altura del medio de tres milímetros es casi un 50% mayor en la unión del medio al espacio de cabeza que en la capa celular.
Se muestra el porcentaje de oxígeno en el espacio traqueal de la pila de hipers durante el crecimiento celular. La figura muestra que durante 96 horas, el porcentaje de oxígeno entre las capas que suministra cada fondo de película permeable al gas permanece constante. Esto demuestra la capacidad de las células para acceder al oxígeno durante el crecimiento hasta la cofluidez.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llenar y cosechar el recipiente apilable Corning Hypers en el sistema cerrado.
Visión general
Este artículo presenta los Corning HYPERStack Vessels y sus accesorios, diseñados para cultivos celulares adherentes de alto rendimiento. El protocolo demuestra el uso del sistema cerrado de estos recipientes para mejorar la eficiencia de recolección de células.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Tecnología de cultivo celular
- Recolección de células adherentes
- Protocolos de sistema cerrado
Antecedentes
- Los Corning HYPERStack Vessels proporcionan una mayor superficie para el crecimiento celular.
- Los materiales gaso-permeables permiten un intercambio eficiente de gases durante el cultivo celular.
- El diseño de sistema cerrado minimiza los riesgos de contaminación.
- El uso de un colector de líquidos simplifica las manipulaciones de fluidos.
Propósito del estudio
- Demostrar el uso correcto de los Corning HYPERStack Vessels.
- Mostrar cómo inocular y llenar los recipientes de manera efectiva.
- Delinear los pasos para la recolección de células de los recipientes.
Métodos utilizados
- Inoculación de medio con suspensión celular.
- Método de alimentación por gravedad para llenar los recipientes.
- Uso de un manipulador Corning Stack para manejar los recipientes.
- Soldadura de tubos para conectar el medio y manejar la tubería.
Principales resultados
- Llenado e inoculación exitosos de los HYPERStack Vessels.
- Intercambio eficiente de gases observado durante el crecimiento celular.
- Mejora en la recolección de células demostrada a través del sistema cerrado.
- El protocolo permite una fácil manipulación y mantenimiento de la esterilidad.
Conclusiones
- Los Corning HYPERStack Vessels son efectivos para el cultivo celular de alto rendimiento.
- Los protocolos de sistema cerrado mejoran significativamente la eficiencia de recolección de células.
- Los materiales gaso-permeables son ventajosos para el crecimiento celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables scalable adherent cell expansion for target validation assays requiring high cell numbers.
- Operational Value: Reduces media and reagent consumption per cell yield through minimized headspace and efficient gas exchange.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible adherent cell layers for consistent assay readouts in drug screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes cell seeding density across layers via liquid manifold distribution, improving assay-to-assay variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports generation of clinical-grade adherent cells for preclinical efficacy and safety testing under closed conditions.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from research-scale to GMP-compatible processes using identical vessel architecture.
Pipeline & Workflow Integration
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing in adherent cell models at scales relevant to target engagement studies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cell outputs for assay standardization in hit-to-lead progression.
- Analytics: Supports oxygen and metabolite monitoring via gas permeable film to assess culture health and metabolic activity.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity during scale-up, critical for translational consistency in cell-based therapies.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across multiple cell lines and processes, reducing capital expenditure per campaign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive culture performance through stable gas exchange and reduced gradient effects compared to traditional stacked plates.
- Operational Value: Closed fluid paths minimize operator intervention, lowering contamination risk and labor intensity.
- Strategic Value: Higher yield per run improves batch consistency and reduces cost of goods in biologics manufacturing.
- Portfolio Impact: Enables risk-advanced allocation of adherent cell resources across multiple projects from a single platform.
Implementation Considerations
- Training in aseptic tubing welding and manifold handling for closed system integrity.
- Integration with standard incubators and biosafety cabinets using Corning Stack Manipulator for vessel positioning.
- Validation of gas diffusion rates to match metabolic demands of specific adherent cell lines.
- Adaptation of harvesting protocols (enzymatic or mechanical) to vessel geometry and layer accessibility.
- Monitoring of liquid handling tubing pressure and flow rates to prevent shear stress during scale-up.
