Name: Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Aprende a cargar indicadores de calcio sintéticos conjugados con dextrano en terminales nerviosos de Drosophila. Esta técnica permite medir cambios rápidos de calcio durante la actividad neuronal con alta sensibilidad.

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<ol><li> Seleccione un plato disección limpia que no ha sido expuesto a los fijadores. </li><li> La disección de un errante 3 de instar larva de Drosophila en medio de Schneider Drosophila contiene Ca 2 + y L-glutamina, (no cortar los nervios o fibras de daño muscular Nos. 7, 6, 13 ó 12). </li><li> Seleccione un vaso de llenado de pipeta con una punta de 12 micras (diámetro interno). </li><li> Utilizando una jeringa y el tubo (para aplicar una presión negativa en la pipeta) asegurarse de que la punta de la pipeta no esté obstruido. </li><li> Seleccione un plástico fino relleno de filamentos que pueden ser insertados a lo largo de la pipeta de vidrio. </li><li> Dibuja ~ 1 cm de 5 mM de dextrano conjugado Ca 2 +-indicador en el filamento de plástico. </li><li> Cortar todos los nervios del segmento. </li><li> Apoyo a la pipeta en una rampa que permitirá a la punta de la pipeta de acercarse a la línea media ventral de la larva disecada. </li><li> Dibujar el extremo del corte de un nervio al segmento N º 4, sin presionar el nervio, en el extremo de la pipeta (incluyen una pequeña cantidad de medio de Schneider). </li><li> Retire el tubo e introducir el filamento de plástico en la pipeta hasta el final del filamento está a 50 micras del extremo cortado del nervio (evitar el contacto con el nervio). </li><li> Expulsar suficiente Ca 2 +-indicador en la terminación nerviosa para aumentar el volumen de medio de los Schneider en un 33% (concentración final debe ser &lt;2 mm). Importante - Este debe ser completado dentro de 5 minutos de cortar el nervio. </li><li> Colocar la preparación en la oscuridad a temperatura ambiente mientras se carga el nervio. </li><li> Después de 40 minutos, retire el Ca 2 +-indicador con el filamento. </li><li> Dejar la pipeta en el lugar y llenarlo completamente con un nuevo medio de Schneider, ya que se puede utilizar para aplicar pulsos de estimulación del nervio. </li><li> Deje que el Ca 2 +-indicador que se equilibre en el nervio por lo menos durante 60 minutos, pero no más de 4 horas, antes de comenzar el Ca 2 +-imagen. </li><li> Enjuague la preparación con un nuevo medio de Schneider cada 30 minutos mientras se está equilibrando. </li><li> 20 minutos antes de cambiar de imagen medio de Schneider con hemolinfa-Como solución N º 6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003). </li><li> L-ácido glutámico o glutamato se puede agregar a HL6 solución a 7 mm para desensibilizar los receptores de glutamato postsinápticos para evitar que los nervios provocado la contracción muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>debe contener L-glutamina y calcio</td></tr><tr><td>sal monosódica de ácido L-glutámico hidratada</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

cargando drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

El calcio juega muchos papeles en el sistema nervioso, pero ninguno tan impresionante que, como el detonante de la liberación de neurotransmisores, y ninguno más profundo que el mensajero fundamental para la plasticidad sináptica que apoya el aprendizaje y la memoria. Para aclarar aún más los fundamentos moleculares de Ca 2 +-dependiente de los mecanismos sinápticos, un modelo de sistema se requiere que sea genéticamente maleable y accesible fisiológicamente. Drosophila melanogaster ofrece este modelo. En este sistema, genéticamente codificados indicadores fluorescentes están disponibles para detectar cambios de Ca 2 + en las terminaciones nerviosas. Sin embargo, estos indicadores han limitado la sensibilidad a Ca 2 + y, a menudo muestran una respuesta no lineal. De índices sintéticos fluorescentes son más adecuados para la medición de la rapidez de Ca 2 + cambios asociados con la actividad nerviosa. Aquí se demuestra una técnica para la carga de dextrano conjugado sintético Ca 2 + indicadores en las terminaciones nerviosas en vivo en larvas de Drosophila. Se hace especial hincapié en aquellos aspectos del protocolo más crítico para el éxito de la técnica, tales como la forma de evitar descargas de electricidad estática a lo largo de los nervios aislados, mantener la salud de la preparación durante los períodos de carga extendida, y asegurar la supervivencia de los axones, proporcionando Ca 2 + para promover el sellado de las terminaciones del axón cortado. De baja afinidad dextrano conjugado con Ca 2 +-indicadores, como la fluo-4 y Rhod, están disponibles, que muestran una alta relación señal-ruido, mientras que mínimamente interrumpir presináptica Ca 2 + dinámica. Dextrano-conjugación ayuda a prevenir la Ca 2 + indicadores que se están secuestradas en orgánulos como las mitocondrias. La técnica de carga se puede aplicar igualmente a las larvas, embriones y adultos.

El calcio es un mensajero en todas partes en el sistema nervioso, esencial para desencadenar la liberación de neurotransmisores y los cambios en la fuerza sináptica. Aquí se demuestra una técnica para la carga de Ca 2 +-los indicadores en las terminaciones nerviosas de Drosophila. También demuestran la fabricación de los aparatos necesarios y hacer hincapié en los puntos críticos para el éxito de la técnica.

Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

El calcio desempeña múltiples funciones en el sistema nervioso, pero ninguna es más impresionante que la de actuar como el disparador de la liberación de neurotransmisores, y ninguna más profunda que la de...

Hola, me llamo Greg McLeod. Mi laboratorio estudia la regulación del calcio en terminales nerviosos y su impacto en la neurotransmisión. Hacemos esto en Oph Melanogaster.La mosca del vinagre es un modelo atractivo para los neurocientíficos debido a su manipulabilidad genética y su sistema nervioso sencillo y accesible. En este sistema nervioso, existen indicadores fluorescentes genéticamente codificados disponibles para detectar cambios de calcio en las terminaciones nerviosas. Sin embargo, estos indicadores tienen una sensibilidad limitada al calcio y a menudo muestran una respuesta no lineal.Los indicadores sintéticos son más adecuados para medir los cambios rápidos de calcio asociados con la actividad nerviosa. Demostraremos una técnica para cargar indicadores sintéticos de calcio conjugados con dextrina en terminales nerviosos vivos en oph lava. La conjugación con dextrina ayuda a evitar que los indicadores de calcio sean secuestrados en orgánulos como las mitocondrias.La técnica de carga se puede aplicar por igual a larvas, embriones y adultos. Diseccionaremos una larva en un baño pequeño de laca azul sobre un portaobjetos de vidrio. La cera dental azul sostendrá un vidrio que

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

Este video describe las imágenes de calcio in vivo en neuronas de Drosophila usando GCaMP. El clip de protocolo presentado muestra cómo registrar los cambios en la fluorescencia de GCaMP de las neuronas del cuerpo del hongo durante un experimento de acondicionamiento olfativo.

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

En este video, las fibras nerviosas de las larvas de Drosophila se sumergen en un tinte FM, que se une a los lípidos de la membrana celular. El microelectrodo de succión y los pulsos eléctricos estimulan el proceso de endocitosis, incorporando el colorante FM en las vesículas endocíticas recién formadas. Este método, que visualiza las etapas presinápticas de la neurotransmisión, es útil para estudiar la función sináptica y la liberación de neurotransmisores.

Carga y descarga de colorantes FM mediada por microelectrodos en células nerviosas de larvas de Drosophila

Este video muestra un protocolo para estudiar el reciclaje de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila que expresan canalrodopsina utilizando un colorante fluorescente. La luz azul activa las canalrodopsinas, causando la entrada de calcio y la exocitosis de las vesículas sinápticas. El tinte se integra en las membranas neuronales y se internaliza durante la endocitosis, lo que da lugar a una mayor fluorescencia. Una mayor estimulación de la luz azul induce...

Análisis del reciclaje de vesículas sinápticas y la absorción de colorantes fluorescentes en larvas de Drosophila

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Fuente: Ishimoto, H. et. al., Imágenes de calcio ex vivo para visualizar las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este video muestra las imágenes de calcio para estudiarDrosophila respuestas cerebrales a los neuropéptidos. Las neuronas que expresan un indicador de calcio fluorescente revelan la dinámica del calcio intracelular y las respuestas funcionales a las moléculas de señalización.

Imágenes de calcio ex vivo para estudiar las respuestas cerebrales de Drosophila a los neuropéptidos

Las patas delanteras y la probóscide de Drosophila contienen un rico repertorio de neuronas sensoriales gustativas. Aquí, presentamos un método que utiliza imágenes de calcio para medir las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales en la pata delantera y la probóscide de moscas vivas tras la aplicación exógena de una feromona gustativa.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Aquí, describimos un método para cargar un colorante sensible al calcio a través del tocón del nervio de la rana en las terminaciones nerviosas. También presentamos un protocolo para el registro y el análisis rápido de los transitorios de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas.

Carga de un tinte de calcio en las terminaciones nerviosas de las ranas a través del tocón nervioso: Registro de transitorios de calcio en la unión neuromuscular de la rana

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Este protocolo evalúa la actividad sináptica funcional entre parejas neuronales definidas in vivo en el sistema nervioso central de las larvas de Drosophila melanogaster utilizando herramientas codificadas genéticamente. CsLa estimulación optogenética mediada por Chrimson de neuronas sensoriales presinápticas cIVda induce la fotoconversión dependiente de calcio de CaMPARI en interneuronas possinápticas de la Cuenca-4.

Caracterización funcional de parejas pre- y postsinápticas individuales en el sistema nervioso central larvario de Drosophila usando CaMPARI

Aprende a cargar indicadores de calcio sintéticos conjugados con dextrano en terminales nerviosos de Drosophila. Esta técnica permite medir cambios rápidos de calcio durante la actividad neuronal con alta sensibilidad.

Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

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