Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

Hola, me llamo Greg McLeod. Mi laboratorio estudia la regulación del calcio en terminales nerviosos y su impacto en la neurotransmisión. Hacemos esto en Oph Melanogaster.

La mosca del vinagre es un modelo atractivo para los neurocientíficos debido a su manipulabilidad genética y su sistema nervioso sencillo y accesible. En este sistema nervioso, existen indicadores fluorescentes genéticamente codificados disponibles para detectar cambios de calcio en las terminaciones nerviosas. Sin embargo, estos indicadores tienen una sensibilidad limitada al calcio y a menudo muestran una respuesta no lineal.

Los indicadores sintéticos son más adecuados para medir los cambios rápidos de calcio asociados con la actividad nerviosa. Demostraremos una técnica para cargar indicadores sintéticos de calcio conjugados con dextrina en terminales nerviosos vivos en oph lava. La conjugación con dextrina ayuda a evitar que los indicadores de calcio sean secuestrados en orgánulos como las mitocondrias.

La técnica de carga se puede aplicar por igual a larvas, embriones y adultos. Diseccionaremos una larva en un baño pequeño de laca azul sobre un portaobjetos de vidrio. La cera dental azul sostendrá un vidrio que sirve como lecho de carga.

Tome una larva de tercer estadio de la lava estelar desde el lateral de un vial no congestionado. Coloque la larva en varias gotas de solución de Schneider fría y sujétela a través de la cabeza y la cola, con la línea media dorsal hacia arriba. Utilice un par de tijeras microscópicas afiladas para hacer un corte.

Un pequeño corte entre la tra aquí, lo suficientemente grande como para permitir que la hoja inferior de las tijeras penetre. Corte a través de la cutícula a lo largo de la línea media dorsal entre la traia hasta llegar a la cabeza. Gire la larva 180 grados y extienda el corte hasta llegar a la cola.

Es importante no permitir que la hoja inferior penetre demasiado profundamente en las vísceras, sino en la larva, ya que esto dañaría los músculos y nervios que se desea examinar. La mayor parte de las vísceras sobresaldrán a través de la incisión; corte aquí el cordón cercano a la cola, y corte también la tráquea subyacente hasta llegar a la cabeza. Repita el procedimiento en el otro lado.

Retire la mayor parte de las vísceras cortándolas y eliminándolas del baño. Tómese un momento para dejar las tijeras y tomar un segundo par de pinzas. Sujete el borde cortado de la cutícula y fíjela hacia un lado.

Repita para el otro lado. Avance cuatro segmentos hacia la cabeza para repetir el procedimiento. Recorte. Cualquier víscera restante en esta etapa. Asegúrese de que no se haya dañado ningún músculo 7, 6, 13 o 12 en ninguno de los segmentos.

Si alguno ha resultado dañado, diseque otra larva, ya que este daño inevitablemente provoca contracciones geniculadas que dificultarán cualquier imagen posterior. En los siguientes pasos, los hemisferios cerebrales, el ganglio ventral y los nervios segmentarios serán visibles. Introduciremos el extremo seccionado bajo presión en el nervio segmentario dentro de una cama de FOP de vidrio y utilizaremos un filamento de relleno plástico para aplicar un indicador de calcio al extremo expuesto del nervio.

Pero primero, demostraremos cómo hacer el filamento de relleno y el efecto de relleno para fabricar el filamento de relleno. Se aplicará una técnica de tracción en dos etapas a un defecto amarillo, calentándolo lentamente hasta la mitad de su longitud hasta que el plástico se vuelva blando y transparente. Detenga el calentamiento en este punto y tire inmediatamente del extremo para estirarlo y formar un filamento delgado.

Eso tiene un diámetro de aproximadamente medio milímetro. Corte el filamento a una longitud de 50 milímetros. Ahora coloque el filamento bajo un microscopio de disección y fije el corte.

Termine con una pequeña porción y tire del otro extremo para extraer un filamento fino de un centímetro de longitud. Este debe cortarse con una cuchilla nueva sobre papel de filtro para evitar que se aplaste y se emboten los bordes, lo que permitirá preparar adecuadamente el relleno. Comience con un capilar de pared delgada sin ningún filamento.

Trácelo hasta formar una punta fina y cónica en un micropipeteador. Lleve esta preparación a un microscopio de disección y marque la porción cónica con un trozo de papel de lija. Empuje la punta distal al corte alejándola del lado marcado, de modo que la punta se rompa de forma cuadrada.

El diámetro interno de la rotura debe ser mayor que el diámetro externo. En el extremo del filamento de relleno, utilice una microantorcha para calentar y encoger la rotura dentro del vidrio del efecto hasta alcanzar un diámetro interno de aproximadamente 12 micrones. Utilice un mechero Bunsen para pulir el extremo romo del efecto.

Se puede aplicar una presión negativa al extremo romo del efecto utilizando un tubo celta ajustado acoplado a un tubo de polilínea rígido y una jeringa. El mismo tubo y la misma jeringa se utilizarán para aspirar y expulsar el indicador de calcio del filamento. El indicador de calcio debe disolverse en agua destilada hasta una concentración de cinco milimolar.

Divida esta solución en alícuotas de cinco microlitros. Caliente estas en peces a cuatro grados. No congele estos cuartos para mantenerlos sin congelar hasta que sean necesarios.

Ahora, aspire uno a dos centímetros del indicador de calcio hacia el filamento y estará listo para proceder al paso más crítico de esta técnica de carga. Tome las tijeras y la pinza y corte individualmente los nervios del segmento más anterior, cerca de los ganglios ventrales. La masa de nervios del segmento AOR más anterior desde la parte ventral.

Corte cualquier residuo. Coloque el filamento de relleno sobre la rampa de cera dental con la punta en el centro de la larva. Fije el tubo escolar y la jeringa.

Aspire algo de solución de Schneider en una punta perfecta. Ahora aspire el extremo del nervio dentro de la punta. El ajuste debe ser firme pero no demasiado apretado.

Debe bloquear cualquier entrada adicional de los Schneiders al área que se desea proteger. En general, retire el tubo esclerótico y la jeringa y conéctelos al filamento F. Toque el costado del filamento a los Schneiders en el baño para descargar cualquier electricidad estática e inserte inmediatamente el efecto gomoso del filamento dentro de los 50 micrones en el corte del nervio sin tocarlo realmente.

Expulse lentamente el indicador de calcio para aumentar el volumen del medio Schneider en aproximadamente un tercio. Esto dará como resultado una concentración final del indicador de calcio de poco menos de dos milimolar. Incube la preparación en un lugar oscuro y húmedo a temperatura ambiente durante unos 40 minutos. Me gustaría hacer dos puntos importantes aquí.

Primero, debe haber una solución fisiológica en la punta para diluir el indicador de calcio, ya que el indicador de calcio se solubilizó únicamente en agua. La solución fisiológica debe contener calcio en una concentración de varios milimolares, ya que el sellado de axones es un proceso dependiente del calcio, y el sellado de axones es esencial para preservar la salud de las terminales nerviosas.

El segundo punto es que no debe transcurrir más de cinco minutos entre el corte de los nervios y la aplicación del colorante en el extremo seccionado del nervio. Después de cinco minutos, los extremos proximales de los axones excluirán los indicadores de calcio conjugados con dextrina con pesos moleculares de 10.000. Cumplir con este límite de tiempo requerirá algo de práctica.

No intente retrasar el techo axonal reduciendo los niveles de calcio, ya que esto solo comprometerá la futura función fisiológica del nervio dañado. Después de la incubación de 40 minutos, coloque la preparación en Schneiders y toque con la punta del filamento de llenado el costado del baño, luego vuelva a insertarla para eliminar la mayor parte de la solución del indicador de calcio de la punta y del iniciador. Nuevamente, utilizando el filamento, aspire Schneiders fresco del baño y llene completamente el lecho con Schneiders.

No debe haber burbujas en el lecho, ya que la solución de Schneider servirá como uno de los conductores aislados del baño mientras el nervio estimulado por el vaso de petri, coloque nuevamente la preparación en un lugar oscuro durante al menos 60 minutos, pero no más de cuatro horas, e intercambie las RINs en Schneider fresco cada 30 minutos durante la incubación. El indicador de calcio es transportado hacia abajo. El axón se concentra en el terminal nervioso 20 minutos antes de que desee examinar la preparación. Enjuáguela con solución HL6.

Mantenga el nivel deseado de calcio cuando el nivel de calcio esté por encima de aproximadamente 0,4 milimolar con glutamato o ácido L-glutámico en HL 6-7 milimolar para detener la contracción muscular evocada por el nervio. La solución de Schneider no es adecuada para la imagen de calcio, ya que ya contiene niveles elevados de glutamato y calcio. Deberá ajustar estos niveles.

Tate también está presente, lo que permite que la carga y la obtención de imágenes autofluorescentes de Schneider se realicen en HL seis, siempre que el calcio esté presente en al menos 2 millones durante la carga. Al preparar el montaje en un microscopio compuesto para la obtención de imágenes, asegúrese nuevamente de descargar toda la electricidad estática. Luego, toque tanto la solución en el baño como el objetivo con un par de pinzas.

Si el objetivo es un objetivo de inmersión, baje su co al baño, luego conecte momentáneamente la base a tierra de forma inteligente, o coloque uno en el baño e introduzca el otro hacia abajo llenando el lecho con pulsos de corriente continua de menos de tres voltios y una duración de 300 microsegundos, lo cual provocará de forma confiable un potencial de acción en el nervio. Aquí observamos dos conjuntos de terminales nerviosas en la hendidura entre los músculos seis y siete que se han hecho visibles mediante la expresión citosólica de GFP. También han sido rellenadas anterógradamente con el indicador de calcio Rod Dextrina, que presenta espectros de excitación y emisión diferentes a los del GFP.

Este campo de visión aún contiene los terminales nerviosos, pero Rod Rin tiene baja afinidad por el calcio y es casi invisible mientras el nervio está en reposo. Sin embargo, responde ampliamente al calcio que entra en los terminales durante potenciales de acción individuales o breves trenes de estímulos de dos segundos. Como se muestra aquí en el análisis de fluorescencia de las series cercanas de 80 hercios recién presentadas, las respuestas en los terminales de tipo uno S suelen ser mayores que las de los terminales de tipo uno B.

Indicadores de calcio de baja afinidad como rodexdrina y flu. Una rodexdrina mostró una respuesta casi lineal a las frecuencias de estimulación nerviosa en estos terminales, en un rango de 10 a 80 hercios. El ejemplo mostrado aquí proviene de un terminal nervioso en el músculo número cuatro, cargado con Rodexdrina.