Name: Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a realizar imagen celular en vivo de cambios de forma celular en embriones de Drosophila melanogaster mediante microscopía confocal de fluorescencia. Este protocolo permite visualizar dinámicamente procesos como la cellularización.

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Queremos agradecer a Eric Wieschaus, que proporcionó el fundamento sobre el cual se desarrolló este protocolo. Nuestro trabajo es apoyado por un Departamento de Verna y Marrs McLean de Bioquímica y Biología Molecular de la puesta en marcha Premio, Baylor College of Medicine.

1. Ensamble Copas de recogida de embriones <ol><li> Corta el fondo de 100 ml de Tri-maíz vaso con una navaja, por lo que el borde lo más suave posible. Las copas son más fáciles de manejar si usted también recortar las tres esquinas fuera de la parte superior, aunque esto no es absolutamente necesario. </li><li> Corte un cuadrado de tela metálica (6 cm x 6 cm). En un plato caliente precalentada, en el interior de una campana de extracción de capas, la plaza de malla de alambre en la parte superior de una hoja de papel de aluminio de alta resistencia. Empuje el borde inferior de corte de la taza bien caliente sobre la malla. Espere unos segundos, y levantar la copa con la malla que ahora se atribuye. Si la hoja también se adhiere, al igual que se desprenda. </li><li> Enfriar la copa durante la noche. Retire el exceso de malla con unas tijeras, y la arena de los bordes afilados con papel de lija de grano fino. </li></ol> 2. Que Apple Placas de Agar Jugo <ol><li> En un matraz de 6L, combinar 100 g de agar Bacto BD y agua destilada 3L. Autoclave el agar durante 30 minutos en el ajuste de escape lento. </li><li> En un matraz de 2 litros con una barra de agitación, se combinan 100 g de sacarosa, jugo de manzana 1 litro, y 6 g de ácido p-hidroxibenzoico. Calentar la solución a ebullición mientras se agita en un plato caliente. No deje que hierva durante más de 2 minutos. Dejar que la mezcla de jugo de manzana que se enfríe, y luego añadir con barra de agitación con el agar. Mezclar bien. </li><li> Deje que la solución combinada a enfriar en un baño de agua a 60 ° C antes de verter en 60x15 mm placas de Petri. Por otra parte, una bomba peristáltica puede ser utilizado para dispensar el agar. Permita que las placas se enfríe a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Pila de contenedores Rubbermaid con una capa de toallas de papel húmedo y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> Notas: <ul><li> En el otoño o el invierno, puede ser necesario agregar un adicional de 100 ml de agua para el agar. </li><li> La marca de placas de Petri es importante! Sólo los platos BD Falcon encajar los vasos Tri-maíz. Información específica pedido se puede encontrar en la tabla de Materiales a continuación. </li></ul> 3. Añadir moscas GFP a las Copas de recogida de embriones <ol><li> Ampliar las poblaciones de las buenas prácticas agrarias de acuerdo a las necesidades de su colección mediante la creación de botellas de moscas alrededor de dos semanas antes de la imagen. Una botella de moscas es más que suficiente para llenar una taza de recogida de embriones con un mínimo de 50 hembras y los machos 30. Para ver los mejores ponedoras, las moscas deben ser nuevos eclosed (es decir, menos de 5 días después de la eclosión). </li><li> Haga una pasta de levadura por llenar una taza pequeña con partes iguales de levadura seca activa Estrella Roja y el agua destilada, y revuelva hasta que la levadura se disuelva. La pasta debe aproximarse a la consistencia de la mantequilla de maní húmedo. Más levadura o el agua se puede agregar a alterar la consistencia. Pasta de levadura puede ser utilizado por varios días, y se deben almacenar, cubierto, a 4 ° C. </li><li> Una vez que la pasta de levadura está listo, retirar las placas de jugo de manzana de 4 ° C en almacenamiento. Pasar la manzana jugo de placas con la pasta de levadura, y permitir que se caliente a 22-25 º C, lo que impulsará la puesta de huevos. </li><li> Doble un papel de filtro circular por la mitad, y luego nuevamente a la mitad. Recorte de 8-9 cm de diámetro, y hacer los pliegues de acordeón en el cuarto de círculo. Despliegue del círculo, invertirlo, y la inserta en un vaso de colección hasta que toque la malla. Asegúrese de que el trabajo es seguro en la taza para que no se caiga y aplaste a las moscas. El papel de filtro es opcional, pero nos da un ambiente acogedor para el apareamiento, y mantiene la humedad en la copa. </li><li> Etiqueta de una taza con el nombre de archivo y fecha. Transferencia de las moscas de la botella a la copa de recolección agitando suavemente la botella invertida sobre el vaso, y cubrir inmediatamente la taza con un plato preparado de jugo de manzana. Fije la placa de la copa con una banda elástica. Set vasos laterales de malla en una zona con luz directa. Asegúrese de que ninguna sombra caiga sobre la taza, como las moscas no estaba bien en la oscuridad. </li><li> Cambiar la placa de jugo de manzana, según sea necesario. Dos horas de las colecciones, a temperatura ambiente, funciona bien para cellularization imágenes. </li></ol> 4. Preparar una cámara de montaje <ol><li> Para preparar una cámara de montaje para los embriones, cortar un trozo de cinta de doble cara 2.3 cm de largo y colocarlo en una diapositiva, alineando el eje longitudinal de la cinta y diapositivas. Corte un segundo 2-3 cm de largo trozo de cinta de doble cara y una capa en la parte superior de la otra pieza de la cinta, asegurándose de que los bordes estén alineados. </li><li> Usando una hoja de afeitar, hacer dos cortes de aproximadamente 3 mm en el centro de la cinta y perpendicular al eje longitudinal de la diapositiva. Retire la cinta entre los cortes para hacer un canal. Pipeta una gota de aceite de halocarbonos 27 en el canal. Este canal es donde los embriones se montarán. </li></ol> Notas: <ul><li> Sólo el de ½ pulgada Scotch cinta de doble cara es el espesor de la derecha para dar cabida a los embriones. </li><li> Halocarbonos 27 El petróleo es permeable al oxígeno, por lo que permite el intercambio de oxígeno, mientras que la prevención de la deshidratación del embrión. Debido a su índice de refracción, halocarbonos 27 El petróleo es también ideal para celebrare imágenes de los embriones. </li></ul> 5. Los embriones Dechorionate <ol><li> Para recoger y embriones dechorionate, vierta suficiente el 50% de cloro en la placa de agar de jugo de manzana para sumergir completamente toda la superficie. Utilizando un microscopio de disección, como el V8 Zeiss Discovery con luz transmitida, esté pendiente de los embriones a la liberación de su corion. Tan pronto como el corion se afloja y se libera a partir de unos pocos embriones (30-60 segundos), se vierte la lejía y los embriones en un colador de la célula. </li><li> Lavado de los embriones en el filtro de forma inmediata y enérgicamente con el agua destilada de una botella con atomizador. DAB colador sobre toallas de papel. Si alguna de color rosa que se ve en la toalla después de pequeños toques, y seguir lavando los embriones con el agua. </li><li> Utilice una brocha húmeda para la transferencia de embriones 10-50 a una placa de jugo de manzana limpia (sin pasta de levadura). Evacuación de la agua con el borde roto de una toalla de papel y cubrir inmediatamente los embriones con una pequeña cantidad de aceite de halocarbonos 27. </li></ol> Notas: <ul><li> No utilice lejía Clorox. En su lugar, utilice una marca como A-1 Bleach Comercial de Austin, que es &lt;6% de hipoclorito de sodio. </li><li> El exceso de blanqueo o lavado insuficiente dará lugar a embriones con puré cellularization irregular. </li></ul> 6. Etapa y el Monte embriones <ol><li> Usando el microscopio de disección con luz transmitida, siga las pautas morfológicas de Bownes 20 a la etapa de embriones en el plato. Con unas pinzas, la transferencia de 5 mitosis ciclo de 11 o 12 embriones, que corresponde a Bownes la etapa 4, el canal de la cámara de montaje. Organizar los embriones en una línea, con la cara de las partes dorsal y ventral y lateral visible hacia abajo. Los embriones son fácilmente accesibles en esta orientación en el petróleo por sí solo. No embriones se amontonan ya que privar a sus vecinos de oxígeno una vez que la hoja de la cubierta se aplica a continuación. (Deje aproximadamente la mitad de una longitud de embriones entre ellos). </li><li> Ponga un extremo de una cubierta de 25x25 mm de deslizamiento de la cinta de doble cara en un lado del canal. La caída de la hoja de cubierta que cubra el canal. Si el aire está atrapado debajo, aplique una pequeña cantidad de aceite de halocarbonos 27 en el borde de la hoja de la cubierta. La acción capilar se tire el aceite en el canal para que expulse el aire. </li></ol> Notas: <ul><li> Otro recurso excelente para los embriones de etapa es el siguiente: Campos-Ortega, JA y Hartenstein, V. (1985). El desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, de Berlín. Aunque este libro ya no está publicada, las copias se utilizan regularmente disponible en Amazon.com. </li><li> Utilice siempre el aceite de halocarbonos 27 con moderación. Esto hará que el montaje sea más fácil. También evitará que accidentalmente la exudación del aceite en el objetivo del microscopio en los pasos siguientes imágenes. </li></ul> 7. Los embriones de la imagen <ol><li> ¿Cómo se procede aquí, por supuesto, ser dictado por el cambio de forma de la célula que está la imagen, y la pregunta que se dirige. Para cualquier cambio de forma, coloque la cámara de montaje a ambos un microscopio vertical o invertida, encontrar embriones al trasluz, y luego cambiar a la imagen confocal para centrarse en una región de interés. Se adhieren a las mejores prácticas de microscopía confocal, tales como los discutidos en MicroscopyU de Nikon ( <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Extremar el rigor en la exposición de los embriones vivos para que la potencia del láser poco como sea posible, para evitar que photobleaching y fototoxicidad. </li><li> Para cellularization, que la imagen en un Zeiss 710 microscopio confocal de barrido láser, usando un C-Apochromat 40x/1.2 W objetivo Corr. Este microscopio se encuentra en una habitación con temperatura controlada, con temperaturas que oscilan entre 18-20 º C. Aunque el control de la temperatura no es absolutamente necesario, es mejor para el microscopio y hace que la imagen más consistente. Regularmente la imagen en un solo plano, cerca de la mitad del embrión, a seguir las invaginaciones membrana plasmática en la sección transversal (Figura 2). Para simplemente seguir la dinámica de la invaginación, 30-60 segundos de intervalo son suficientes para time-lapse, y los embriones deben soportar imágenes de&gt; 90 minutos sin signos evidentes de falta de oxígeno. </li><li> Tras la adquisición de las imágenes, que pueden ser analizadas utilizando cualquier número de paquetes de análisis de imagen, incluyendo software gratuito de los Institutos Nacionales de Salud, llamado ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). Los datos pueden ser presentados como películas (Movie 1), secuencias (Figura 2), o kymographs 21. </li></ol> Nota: <ul><li> La inmersión en agua C-Apochromat 40x/1.2 W Corr. objetivo es muy adecuado para la imagen cerca de la mitad de la sección de embriones debido a su gran apertura, lo que limita las aberraciones de imágenes de tejidos profundos en muestras acuosas, y ofrece una alta resolución y alta señal fluorescente. Además, este objetivotiene una distancia muy larga (220 mm). Sin embargo, otros objetivos de inmersión en agua o glicerina funcionará bien, sobre todo si el cambio de la forma celular de interés se pueden obtener imágenes cerca de la superficie del embrión. </li></ul> 8. Método alternativo: Montar con embriones "embrión-cola" <ol><li> A la imagen de un cambio de forma de la célula que no sea cellularization, puede ser necesario para montar los embriones en una orientación específica que no es fácil de mantener en el petróleo por sí solo. Para ello, utilice un método alternativo de montaje en el que se describe anteriormente. Comience por hacer "embrión-cola" mediante la combinación de 20 cm de cinta de doble cara, con 250 l de heptano en un vial de centelleo. Coloque el vial de centelleo en un nutator o plataforma giratoria, y la mezcla durante la noche. </li><li> Sumerja una punta de la pipeta amarilla en la cola del embrión, y luego traza la punta a lo largo de una diapositiva, dejando un rastro de pegamento. Mientras que el heptano se está evaporando, alinear sus etapas de embriones en la posición indicada en un bloque de agar. (Recuerde que la superficie de embriones para obtener imágenes debe estar mirando hacia el agar. Por ejemplo, para cambiar la forma de imágenes de células durante la formación del surco ventral, montaje de embriones con su lado ventral hacia el agar.) </li><li> Invertir en la diapositiva con el pegamento, y presione suavemente la pista de goma contra los embriones en el bloque de agar. Ahora invertimos la diapositiva otra vez. Los embriones serán atrapados en la orientación adecuada. Añadir dos capas de cinta de doble cara en ambos lados de los embriones, cúbralos con halocarbonos 27 de aceite, y colocar un cubreobjetos. Proceder a la imagen como se describe anteriormente. </li></ol> 9. Los resultados representativos: Si los embriones son saludables y la imagen es óptima, entonces cellularization debe tomar 50-60 minutos, y la membrana plasmática invaginaciones que la entrada de cerca de 40 micrones. Sin embargo, si los embriones son más de blanqueada, el oxígeno privados o dañados por fototoxicidad, a continuación, invaginación o se retrasará, particularmente en el área observada. Este deterioro de la salud del embrión a menudo resulta en alteraciones del desarrollo, y la falta de eclosión de larvas. Así, por una rigurosa prueba de ensayo para la salud del embrión después de la filmación, mantener las diapositivas en una cámara húmeda y mirar para incubar al día siguiente. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Flujo de trabajo de recogida de embriones a las imágenes. El flujo de trabajo del protocolo se pueden dividir en cuatro fases principales. En la primera fase, todos los materiales y componentes están preparados, y luego vuela la taza de recolección de embriones, jugo de manzana placa de agar y las buenas prácticas agrarias se unen para crear el ambiente de embriones de huevos. En la segunda fase, los huevos y los embriones que se colocan en las placas de agar de jugo de manzana se recogen. En la tercera fase, los embriones se retira de la placa, puesta en escena y trasladado a la sala de montaje. En la cuarta fase, los embriones son expuestas en un montaje de un microscopio confocal. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Datos representativos de time-lapse de cellularization. Embriones se montan con dorsal (D) y ventral (V) partes claramente visible, y se crean imágenes de cerca de su centro para seguir la membrana plasmática invaginaciones en la sección transversal. El embrión se muestra aquí expresa GFP-miosina-2 sonda de 6, que se concentra en las puntas de las invaginaciones membrana plasmática. Por lo tanto, el seguimiento el ingreso de este frente con el tiempo da la velocidad a la que la membrana plasmática se invagina. El punto en el tiempo 0:00 minutos corresponde a la aparición de cellularization. Poco después de que el punto de minutos de tiempo de 56:00, la gastrulación comienza en la parte ventral del embrión. Bar es de 40 micras. Movie 1. Película representante de time-lapse de cellularization. Esta película corresponde a la Figura 2. Para grabar todo el proceso de cellularization, imágenes comenzó en el ciclo mitótico antes de 13, la captura de regresión pseudocleavage surco, y continuó hasta los movimientos de gastrulación se ve en la cara ventral del embrión. Las imágenes se recogieron a intervalos de un minuto. Las intensidades se incrementaron después de la adquisición para que sea más fácil ver los movimientos de gastrulación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Haga clic aquí para película</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Evento de desarrollo y tiempo * </td><td> Cambios en las células relacionadas con la forma </td><td> Un enlace a la enfermedad o la salud humana </td><td> Referencias recientes con imágenes en vivo </td></tr><tr><td> Pseudo-división surco formación (4, 90 minutos pf) </td><td> Citocinesis </td><td> Poliploidía y la progresión del cáncer 1 </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 Cao et al., 2010 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5, 130 pf minutos) </td><td> Citocinesis </td><td> Poliploidía y la progresión del cáncer 1 </td><td> Cao et al., 2008 10 Sokac y Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> La formación de surcos ventrales; invaginación del mesodermo (6, 180 minutos pf) </td><td> Apical constricción; transición epitelio-mesenquimal </td><td> Metástasis del cáncer 2 </td><td> Fox y Peifer, 2007 12 Martin et al., 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband extensión (7, 195 pf minutos) </td><td> Extensión convergente </td><td> Defectos del tubo neural 3 </td><td> Bertet et al., 2004 14 Blankenship et al., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11, 320 pf minutos) </td><td> La formación del tubo epitelial y la ramificación </td><td> Angiogénesis 4 </td><td> Caussinus et al., 2008 16 Gervais y Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Cierre dorsal (14, 620 minutos pf) </td><td> Constricción apical </td><td> Cicatrización de la herida 5 </td><td> Gorfinkiel et al., 2009 18 Solon et al., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Ejemplos de la Tabla 1. Cambios de forma de la célula imágenes en embriones de la mosca de vida * El número de la etapa Bownes y el tiempo de post-fertilización (pf), cuando cada evento de inicio, se muestran de acuerdo con Campos-Ortega, 1985. <table border="1"><tbody><tr><td> Mosca de valores </td><td> Las etiquetas </td><td> Referencia original </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> La membrana plasmática </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> La membrana plasmática </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venus </td><td> La membrana plasmática </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (sqh-GFP) </td><td> Miosina-2 </td><td> Royou et al., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-cadherina-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Célula-célula cruces </td><td> Oda et al., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-actina </td><td> Kiehart et al., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrofina-Venus (Utro-Venus) </td><td> F-actina </td><td> Sokac et al., Resultados no publicados </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Útiles acciones para el cambio de imagen la forma celular en embriones de mosca

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<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

El protocolo se describe en este documento permitirá a la imagen en vivo, confocal de una serie de cambios en la forma de células en el embrión de la mosca en desarrollo. Las poblaciones de las buenas prácticas agrarias para la imagen puede ser preparado por un laboratorio individual (Tabla 2), pero muchas de esas poblaciones también están a disposición del público de los centros, tales como Bloomington Drosophila Stock Center en la Universidad de Indiana ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flys...

<table><tbody><tr><td>Láminas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Botellas con gotero (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Peras para pipetas pequeñas, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo con tapas</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Probetas Tri-Corn, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri BD Falcon 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular BD Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta amarillas</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Malla de acero inoxidable, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio de 5&amp;#190; pulgadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro P4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Ligas elásticas</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva doble cara Scotch, &amp;frac12; pulgada</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Pinceles para pintar Robert Simmons Expression E85 redondo n.º 2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5, de alta precisión, inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Ácido p-hidroxibenzoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Levadura seca activa Red Star</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Toallas de papel, dobladas en C</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foil de aluminio pesado</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejía</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jugo de manzana al 100 %</td><td>Ocean Spray o Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

El desarrollo de Drosophila melanogaster embrión sufre una serie de cambios en la forma de células que son muy susceptibles de imagen confocal en vivo. Cambios en las células de la mosca de la forma son análogos a los de organismos superiores, y conducen la morfogénesis de tejidos. Por lo tanto, en muchos casos, su estudio tiene implicaciones directas para la comprensión de enfermedades humanas (Tabla 1) 1-5. En la escala sub-celular, cambios en la forma celular son el producto de actividades que van desde la expresión de genes de transducción de señales, la polaridad celular, la remodelación del citoesqueleto y el tráfico de la membrana. Por lo tanto, el embrión de Drosophila no sólo proporciona el contexto para evaluar cambios en las células la forma como se relacionan con la morfogénesis de tejidos, sino que también ofrece un entorno totalmente fisiológica para estudiar las actividades sub-celular que las células de forma. El protocolo aquí descrito está destinado a la imagen de un cambio de células forma específica llamada cellularization. Cellularization es un proceso de crecimiento espectacular membrana plasmática, y en última instancia, convierte el embrión sincitial en el blastodermo celular. Es decir, en la interfase del ciclo mitótico 14, la membrana plasmática al mismo tiempo se invagina alrededor de cada uno de los núcleos de ~ 6000 cortical anclado para generar una hoja de primaria células epiteliales. En contra de las sugerencias anteriores, cellularization no está impulsado por la miosina-2 contractilidad 6, sino que está impulsada en gran parte por la exocitosis de la membrana interna de las tiendas 7. Por lo tanto, cellularization es un excelente sistema para estudiar el tráfico de membrana durante los cambios de forma de la célula que requieren invaginación de la membrana plasmática o de expansión, como la citocinesis o transversal de túbulos (T-túbulo) morfogénesis en el músculo. Tenga en cuenta que este protocolo se aplica fácilmente a las imágenes de otros cambios en las células forma en el embrión de la mosca, y sólo requiere de pequeñas adaptaciones como el cambio de la etapa de recolección de embriones, o el uso de &quot;pegamento embrión&quot; para montar el embrión de una orientación específica (Tabla 1) 19.8. En todos los casos, el flujo de trabajo es básicamente el mismo (Figura 1). Los métodos estándar para la clonación y la transgénesis Drosophila se utilizan para preparar acciones mosca de establo que expresan una proteína de interés, fusionado a la proteína verde fluorescente (GFP) o sus variantes, y las moscas son una fuente renovable de los embriones. Por otra parte, las proteínas fluorescentes / sondas se introducen directamente en embriones de la mosca a través de técnicas sencillas de micro-inyección de 9-10. Entonces, dependiendo del evento de desarrollo y cambio en las células de forma para obtener imágenes, los embriones y puesta en escena por la morfología de un microscopio de disección, y finalmente colocado y montado para time-lapse en un microscopio confocal.

El desarrollo temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se caracteriza por una serie de cambios en la forma de células que se presta a los enfoques de imagen. En este artículo se describen las herramientas básicas y los métodos necesarios para la imagen confocal en vivo de embriones de Drosophila, y se centrará en un cambio de forma de la célula llamado cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

El embrión en desarrollo de Drosophila melanogaster experimenta una serie de cambios en la forma celular que son muy adecuados para la obtención de imágenes confocales en vivo. La forma celular...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del cambio de forma celular en embriones vivos de drosófila. Esto se logra primero generando y ampliando cepas de moscas transgénicas que expresan sondas de proteínas marcadas con GFP. El segundo paso del procedimiento consiste en transferir estas moscas a copas de recolección de embriones.El tercer paso del procedimiento consiste en recolectar embriones. El cuarto paso es recubrir y montar el embrión. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la forma celular, como la dinámica celular mediante imágenes confocales de lapso de tiempo de los embriones montados.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la imagenología de tejidos fijos, es que se pueden capturar los aspectos dinámicos de los cambios en la forma celular en el contexto de embriones vivos. Aunque el método descrito aquí está adaptado específicamente a la esofagización, puede modificarse y aplicarse a otros cambios en la forma celular que acompañan al desarrollo temprano de la mosca, como la formación de la surco ventral, la extensión de la banda germinativa, la traqueogénesis y el cierre dorsal. Las personas nuevas en esta técnica suelen encontrar difícil manipular y montar los embriones bajo el microscopio estereoscópico.Mi asesora de posgrado, Anna Marie Soki, y yo demostraremos este procedimiento. Este procedimiento comienza creando un recipiente para recolectar embriones usando una cuchilla para cortar la base de un vaso de precipitados tricónico de 100 mililitros, haciendo que el borde quede lo más suave posible. Recorte las tres esquinas de la parte superior para facilitar el manejo del recipiente.A continuación, corte un cuadrado de malla metálica de seis centímetros por seis centímetros trabajando en una campana extractora. Coloque un trozo de papel de aluminio resistente sobre una placa calefactora precalentada y coloque un cuadrado de malla metálica encima del papel de aluminio. Presione firmemente el borde inferior recortado del vaso contra la malla caliente.Espere unos segundos y levante la taza con la malla ahora adherida. Si el papel de aluminio también se pega, retírelo con cuidado. Deje la taza con la malla puesta durante la noche al día siguiente.Retire el exceso de malla con tijeras y lije cualquier borde afilado con papel de lija de grano fino. El siguiente paso es preparar una pasta de levadura, que promoverá la producción de embriones por las hembras. Llene una taza pequeña con partes aproximadamente iguales de levadura seca activa red star y agua destilada, y mezcle hasta que la levadura se disuelva.La pasta debe tener una consistencia similar a la de mantequilla de maní húmeda. Cuando la pasta de levadura esté lista, retire las placas de agar de jugo de manzana del almacenamiento a cuatro grados Celsius. La descripción de cómo preparar las placas de agar de jugo de manzana se encuentra en el manuscrito adjunto sobre estría.Coloque las placas con jugo de manzana y la pasta de levadura y espere al menos una hora a que las placas alcancen la temperatura ambiente. Doble un papel de filtro circular por la mitad. Luego, dóblelo por la mitad nuevamente.Recorte el papel a un diámetro de ocho a nueve centímetros. Haga dobleces de acordeón en el cuarto de círculo. Desdoble el círculo, inviértalo e insértelo en un vaso de recolección hasta que toque la malla.Asegúrese de que el papel esté bien sujeto en el vaso para que no caiga y aplaste a las moscas. Ahora es el momento de transferir las moscas. Tome un frasco de reserva de moscas que haya tenido dos semanas para reproducirse. Este frasco debería tener suficientes moscas para llenar un vaso de recolección de embriones con un mínimo de 50 hembras y 30 machos.Para obtener la mejor puesta, utilice moscas con menos de cinco días posteriores a la eclosión. Etiquete el vaso de recolección con el nombre de la cepa y la fecha. Invierta el frasco de moscas y agítelo suavemente sobre el vaso de recolección para transferir las moscas al vaso; inmediatamente cúbralo con una placa de jugo de manzana preparada.Sujete la placa al vaso con una banda de goma. Coloque el vaso con la malla hacia arriba a temperatura ambiente en un área con luz directa. Asegúrese de que no caigan sombras sobre el vaso, ya que las moscas no pondrán bien en la oscuridad. Después de dos horas, recoja los embriones reemplazando la placa de jugo de manzana con una placa nueva para nuestras colecciones a temperatura ambiente.Sirve adecuadamente para la obtención de imágenes celulares. A continuación, prepare una cámara de montaje para los embriones. Para ello, corte un trozo de cinta adhesiva doble cara de dos a tres centímetros de longitud y colóquelo sobre un portaobjetos, alineando los ejes largos de la cinta y del portaobjetos.Corte un segundo trozo de cinta adhesiva doble cara de dos a tres centímetros de largo y colóquelo encima del otro trozo de cinta, asegurándose de que sus bordes estén alineados. Utilizando una cuchilla de afeitar, haga dos cortes, separados aproximadamente tres milímetros en el centro de la cinta y perpendiculares al eje largo del portaobjetos. Retire la cinta entre los cortes para formar un canal. Deposite una gota de pipeta de aceite de halo carbono 27 en el canal.Este canal es donde se montarán los embriones. Cubra los embriones cubriendo la placa de jugo de manzana con lejía al 50 % durante 30 a 60 segundos. Recolecte los embriones en una celda, colador y lávelos vigorosamente con agua destilada de una botella de goteo.Seque el colador sobre toallas de papel. Utilice un pincel húmedo para transferir de 10 a 50 embriones recubiertos a una placa limpia con jugo de manzana que no contenga pasta de levadura. Retire el agua con el borde desgarrado de una toalla de papel y cubra inmediatamente los embriones con una pequeña cantidad de aceite de halo carbono 27.Coloque la placa de jugo de manzana bajo un microscopio estereoscópico utilizando luz transmitida. Determine la etapa de los embriones según las pautas morfológicas de bounds. Utilice pinzas para transferir cinco embriones del ciclo mitótico 11 o 12, correspondientes a la etapa cuatro de bound, al canal de la cámara de montaje.Coloque los embriones en una línea con los lados dorsal y ventral visibles y su lado lateral hacia abajo. Los embriones se pueden organizar fácilmente en esta orientación únicamente en aceite. Para evitar que los embriones estén demasiado juntos, deje al menos la mitad de la longitud de un embrión entre ellos.Coloque un borde de una cubreobjetivo de 25 por 25 milímetros sobre la cinta de doble cara en un lado del canal, alineando un borde de la cubreobjetivo con un borde de la cinta. Baje la cubreobjetivo para cubrir el canal. Si queda aire atrapado debajo de la cubreobjetivo, aplique una pequeña cantidad de aceite en el borde de la cubreobjetivo.La acción capilar hará que el aceite penetre en el canal y expulse el aire. Coloque la cámara de montaje en el microscopio confocal y localice los embriones mediante luz transmitida. A continuación, cambie a la imagen confocal para enfocar una región de interés para la imagen celular en un solo plano cercano al centro del embrión.Para seguir la dinámica de la invaginación, utilice intervalos de 30 a 62 para la imagen de lapso de tiempo. Después de adquirir las imágenes, analícelas utilizando un paquete de análisis de imágenes, como el paquete gratuito de NIH llamado ImageJ. Los datos luego pueden presentarse como películas, secuencias o gráficos CH. Para obtener imágenes de un cambio de forma celular distinto a lo celular, puede ser necesario montar embriones en una orientación específica que no se mantenga fácilmente solo con aceite.Para ello, utilice un método alternativo de montaje al descrito anteriormente. Comience preparando un pegamento para embriones mezclando 20 centímetros de cinta adhesiva de doble cara con 250 microlitros de heptano en un vial de reacción. Coloque este vial de reacción sobre un agitador o plataforma rotatoria y mezcle durante la noche.Al día siguiente, sumerja la punta amarilla de la pipeta en el adhesivo para embriones y luego deslice la punta a lo largo de un portaobjetos dejando un rastro de adhesivo mientras el heptano del adhesivo para embriones se evapora. Alinee los embriones estadiados sobre un bloque de agar de manera que la superficie del embrión que se desea observar quede orientada hacia el agar. Por ejemplo, para observar cambios en la forma celular.Durante la formación de la hilera, coloque los embriones con su lado ventral hacia el agar. Invierta la portaobjetos con el adhesivo para embriones y presione suavemente la línea de adhesivo contra los embriones en el bloque de agar. A continuación, invierta nuevamente la portaobjetos.La mayoría de los embriones deben quedar adheridos al portaobjetos en la orientación adecuada. A continuación, agregue dos capas de cinta adhesiva doble faz a ambos lados de los embriones. Cúbralos con aceite de carbono halo 27 y coloque un cubreobjetos. Los embriones ya están listos para la obtención de imágenes. Estas fotos muestran imágenes de lapso de tiempo de embriones celulares montados con los lados dorsal y ventral claramente visibles y capturadas cerca de su parte media. Para seguir la membrana plasmática en sección transversal, el embrión mostrado aquí expresa una sonda GFP de miosina dos, que se concentra en los extremos de las invaginaciones de la membrana plasmática. El seguimiento del avance de este frente a lo largo del tiempo proporciona la tasa a la cual la membrana plasmática se invagina; el punto temporal de cero minutos corresponde al inicio celular, poco después de que, en el punto temporal de 56 minutos, comience la gastrulación en el lado ventral del embrión.Esta película de lapsos temporales de células iniciadas en el ciclo mitótico anterior, 13, captura la pseudoescisión, la regresión del surco y continúa hasta que se observan movimientos gastrointestinales en el lado ventral del embrión. Una vez dominadas, la montaje e imagen se pueden realizar en 60 a 90 minutos si se realizan correctamente. Por supuesto, la recolección de embriones requiere tiempo adicional y debe coordinarse con el montaje y la adquisición de imágenes.Al realizar este procedimiento, es fundamental hacer todo lo posible para mantener una buena salud del embrión. Por ejemplo, no sobrecargar los embriones con lejía y limitar su exposición al láser durante la adquisición de imágenes tras seguir este procedimiento. Pueden emplearse técnicas de imagen más sofisticadas, como el blanqueo fotónico y el conmutado fotónico, para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuáles son las dinámicas del citoesqueleto y de la membrana que acompañan un cambio específico de la forma celular?

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