Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

El objetivo general del procedimiento es estudiar el aprendizaje y la memoria en adultos de Drosophila melanogaster, primero para determinar si las moscas presentan déficits locomotores. Se evalúan en el ensayo de geotaxis negativa. Luego se verifica el comportamiento fototáctico positivo colocando las moscas en un laberinto en T y registrando la latencia para moverse hacia la cámara iluminada preferida.

Las moscas con fototaxis positiva se condicionan luego para asociar la cámara iluminada con el sabor amargo de la quinina. Finalmente, se evalúa en qué medida las moscas asocian el estímulo aversivo con la cámara iluminada, lo que proporciona una medida del aprendizaje y la memoria. Ola, bienvenido al laboratorio X.

Hoy les demostraremos dos ensayos conductuales comúnmente utilizados para estudiar la neurodegeneración en drosophila. Primero, les mostraremos el ensayo de supresión de la fototaxis aversiva, demostrado por Wil Fredo Sala, un estudiante de pregrado en nuestro laboratorio, y por mí mismo, el cual será seguido por el ensayo de geotaxis negativa demostrado por Kaiwan, un estudiante de posgrado en nuestro laboratorio. Mantenga las moscas en un medio estándar de agar, melaza, maíz y levadura a 25 grados Celsius en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

En el día de la oclusión, clasifique las moscas vírgenes en grupos de 20. Las moscas vírgenes se identifican por su color claro y una mancha verde oscura localizada en la parte inferior del abdomen. Las moscas deben transferirse a un vial fresco cada tres días, y deben usarse moscas hermanas para minimizar las diferencias derivadas de los fondos genéticos.

Deben probarse de 10 a 20 grupos por genotipo o tratamiento en un estudio de geotaxis. Para comenzar, separen las moscas hembras y machos en grupos de 10. Estas moscas deben probarse por separado.

Dado que el comportamiento está significativamente influenciado por el género, espere al menos una hora después de la anestesia antes de continuar, para asegurar que la actividad locomotora no esté afectada. Una vez que las moscas estén perfectamente preparadas, alinee las aberturas de dos viales vacíos de poliestireno uniendo sus extremos verticalmente sobre el vial inferior.

Mida ocho centímetros desde la base y trace un círculo alrededor de la circunferencia. Ahora que el aparato ha sido ensamblado, transfiera un grupo de 10 moscas al vial inferior. Vuelva a unir inmediatamente los viales y aclimatice las moscas durante un minuto antes de realizar la prueba.

Después de que las moscas se hayan asentado, golpee suavemente el vial para hacerlas bajar al fondo y mida la cantidad de moscas que trepan por encima de la marca de ocho centímetros en 10 segundos. El número de moscas por grupo que superan esta marca se registra como un porcentaje del total de moscas. Repita este procedimiento 10 veces por grupo, permitiendo que las moscas descanse un minuto entre cada ensayo.

Seis horas antes de un ensayo de PS, separen moscas hembras en viales de poliestireno que contienen papel de filtro humedecido con agua. Este paso asegura que las moscas estén en ayunas y más sensibles al sabor desagradable. En este ensayo, una solución de quinina sirve como estímulo aversivo.

Prepare una solución de trabajo de un micromolar a partir de un stock de 0,1 molar. El laberinto en T consiste en una columna central con una trampilla y dos cámaras laterales, una cámara oscura y una cámara iluminada. En la marca de dos milímetros, use una sierra manual para cortar el extremo cerrado de dos tubos plásticos de centrífuga de 15 mililitros, coloque adaptadores de conexión en cada extremo y selle la conexión con paraform.

Envuelva un tubo con papel de aluminio para servir como cámara oscura. Arme las ATM atornillando las cámaras iluminada y oscura en cada lado de la columna central. Con la puerta de trampa en el centro cerrada, complete el montaje conectando una fuente de luz directamente al adaptador de la cámara iluminada. Antes de realizar el ensayo, transfiera cada mosca de un grupo de 10 a un tubo cónico vacío de 15 mililitros y tápelo ligeramente para evitar escapadas.

A continuación, desenrosque la cámara oscura de las ATM. Transfiera una sola mosca al tubo e inmediatamente vuelva a insertarlo en el laberinto. Apague las luces de la habitación y encienda una lámpara roja.

Deje que la mosca se aclimate en la cámara oscura durante 30 segundos y luego encienda lentamente la fuente de luz que ilumina la cámara iluminada. Una vez encendida, abra la trampilla que separa las dos cámaras. Si la mosca camina hacia la cámara iluminada dentro de los 10 segundos, se considera positivamente fototáctica y está lista para ser entrenada.

La falta de respuesta de esta manera indica un problema en el sistema visual y requiere la exclusión del ensayo. Una vez confirmada la fototaxis positiva, golpee suavemente para devolver la mosca a la cámara oscura, cierre la puerta trampa y apague la luz durante un período de descanso de 32 segundos. Prepare el estímulo aversivo colocando el papel de filtro en la cámara iluminada y agregando con pipeta un mililitro de solución de quinina sobre el papel de filtro.

Asegúrese de que todo el papel de filtro esté completamente húmedo con los estímulos aversivos. Para comenzar el condicionamiento, abra lentamente la puerta trampa y encienda la luz. Permita que la mosca camine hacia la cámara iluminada con olor a quinina.

Después de un minuto, golpee suavemente para devolver a la mosca a la cámara oscura. Repita este procedimiento nueve veces para un total de 10 ensayos de condicionamiento. Normalmente, las moscas de tipo salvaje evitan la cámara iluminada tras tres a cinco ensayos de entrenamiento, inmediatamente después del entrenamiento.

Realice cinco ensayos de prueba. Si la mosca entrenada no entra caminando en la luz de la cámara dentro de los 10 segundos, se registra como aprobado. Se registra y designa la tasa de aprobados en cinco ensayos consecutivos.

PC cero. Tras el entrenamiento y las grabaciones iniciales de PC cero, cada mosca se devuelve a su frasco de alimento numerado original y se mantiene apartada durante seis horas. Seis horas después del entrenamiento, realice cinco ensayos adicionales tal como se demostró anteriormente; esta tasa de éxito representa el PC seis y es una medida de la memoria a corto plazo.

En el ensayo de taxis geotáctico negativo, el número de moscas que cruzan la marca de ocho centímetros se convierte en un porcentaje y se presenta como la tasa de paso en el escalador. En más de 10 ensayos como se observa aquí a la derecha, moscas macho o hembra de 10 días de edad que sobreexpresan la proteína humana tau presentan déficits locomotores significativos en comparación con moscas de edad similar que sobreexpresan GFP, mostradas a la izquierda.

El rendimiento en el ensayo de supresión de la fototaxis aversiva se representa mediante la tasa promedio de éxito o el porcentaje de ensayos de evitación exitosos. En el total de ensayos, las moscas que sobreexpresan tau, mostradas aquí a la derecha, asociaron mal la luz con un sabor amargo en comparación con el grupo control a la izquierda, tanto inmediatamente después del entrenamiento como al realizarse la prueba seis horas después. Tras seguir este procedimiento, se pueden tomar muestras para análisis inmunohistoquímico con el fin de responder preguntas adicionales sobre diferencias morfológicas. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo estudiar el aprendizaje y la memoria en moscas amigos.

Y recuerde, se trata siempre de usted.