Name: Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprende a perfilar lípidos polares en Arabidopsis thaliana mediante cromatografía en capa fina y cromatografía de gases. Este método robusto permite cuantificar ésteres metílicos de ácidos grasos con alta reproducibilidad.

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Este trabajo es apoyado por una beca de EE.UU. National Science Foundation de Christoph Benning.

1. La extracción de lípidos <ol><li> Comenzar la extracción de lípidos de la cosecha de 30 mg de 4 semanas de edad, hojas de Arabidopsis a partir de plantas cultivadas en agar solidificado medio o en el suelo y transferirlas a tubos de 1,5 ml de la reacción de polipropileno. Las hojas frescas se puede flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. </li><li> Añadir 300 l de extracción de solventes compuesto por metanol, cloroformo y ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada muestra. Agitar vigorosamente (con un agitador de pintura o similar) durante 5 minutos. </li><li> Añadir 150 ml de ácido fosfórico 0,2 M (H 3 PO 4), 1 M de cloruro de potasio (KCL) y agitar brevemente. </li><li> Se centrifuga a 13.000 xg a temperatura ambiente durante 1 minuto. Lípidos disueltos en la fase inferior de cloroformo se colocan sobre placas TLC. </li></ol> 2. Cromatografía en capa fina (TLC) 15 <ol><li> Para preparar las placas de TLC, se sumergen una placa de gel de sílice recubiertas 20cmx20cm TLC con la carga de la tira durante 30 segundos en 0,15 M de sulfato de amonio ((NH 4) 2 SO 4) solución, después de sumergir durante 30 segundos, secar la placa por lo menos 2 días un recipiente tapado. Durante la activación de la sublimación de amonio deja tras de ácido sulfúrico, que protona fosfatidilglicerol necesarios para su separación de glicerolípidos otros. </li><li> En el día de experimento, activar TLC placas de hornear en un horno a 120 ° C durante 2,5 horas. </li><li> Después del enfriamiento de las placas activa a temperatura ambiente, utilice un lápiz para dibujar una línea recta (1,5 cm del borde de la placa) a través de la placa en el origen del cromatograma. </li><li> En una campana extractora, lentamente entregar 3 x 20 l de extracto de lípidos en la fase inferior de cloroformo con una pipeta 20 ml con 200 l puntas amarillas de plástico bajo una corriente lenta de N 2. Para ello, un tubo de Tygon se conecta al regulador de la N 2 tanque. Mantenga el lugar de menos de 1 cm de diámetro. Cada placa tiene capacidad para 10 muestras (al posterior análisis de GLC está previsto). </li><li> Como los lípidos manchas completamente seca en la campana de humos, preparar el disolvente de desarrollo compuesto de acetona, tolueno, agua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si la humedad ambiental relativa del aire es alta, la separación podría ser afectada. En este caso el agua debe ser reducida para dar (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) para conseguir la separación deseada. </li><li> Verter 80 ml de disolvente en el desarrollo de un TLC sellar el desarrollo de la cámara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7.0, cm / cm / cm) y se coloca la placa en el tanque con el fin de la muestra hacia abajo. Sellar el tanque con la abrazadera. El disolvente ascenderá la placa y los lípidos se separarse. El tiempo de desarrollo es de aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Cuando el frente del disolvente se sitúe a 1 cm de la parte superior de la placa, retire con cuidado la placa de la cubeta y se seque por completo en la campana de humos durante 10 minutos aproximadamente. </li><li> Lípidos separados por TLC puede ser reversible manchado brevemente con yodo para el análisis cuantitativo o irreversiblemente teñidas con ácido sulfúrico o α-naftol. <ol><li> Sulfúrico carbonización ácido: Pulverizar la placa con el 50% de ácido sulfúrico en agua en una botella rociadora de vidrio en la campana extractora de humos y hornee a 120 ° C durante 15 minutos (Figura 2). </li><li> α-naftol la tinción de glicolípidos: Pulverizar la placa con el 2,4% (w / v) α-naftol en el 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) de etanol y hornee a 120 ° C durante 3-5 minutos hasta que las bandas glicolípido se tiñen de color rosa o púrpura (Figura 2B). El tratamiento excesivo dará lugar a la carbonización de todos los lípidos debido a la presencia de ácido sulfúrico en el reactivo. </li><li> Tinción de yodo: en una campana de extracción, se coloca la placa en un tanque cerrado TLC con cristales de yodo (en una bandeja en la parte inferior que conduce a la saturación de la atmósfera con vapor de yodo hasta que los lípidos son visibles). No exponga la placa de yodo mucho tiempo como el yodo covalente puede modificar los ácidos grasos poliinsaturados (Figura 2C). Por otra parte, para evitar la oxidación de los lípidos, sólo los carriles estándar intercalados con los carriles de la muestra debe ser manchada con una lana de vidrio conectado pipeta Pasteur con cristales de yodo a través del cual N 2 es soplado sobre carriles individuales estándar. </li></ol></li></ol> 3. Acil éster metílico (FAME) Reacción 16 <ol><li> Eliminar la sílice rodean identificado puntos de lípidos de la placa de TLC con una cuchilla de afeitar. Raspe la sílice que contienen lípidos y transferir el polvo de sílice usando un embudo en un tubo de vidrio con tapón de rosca de teflón (PTFE) a ambos lados. </li><li> Añadir 1 ml 1 N de ácido clorhídrico (HCl) en metanol anhidro a cada muestra por pipeta. </li><li> Añadir 100 ml de 50 mg mL -1 pentadecanoico ácido (15:00) con una pipeta 200 l de cada muestra como patrón interno con una pipeta 200 l con 200 l punta de plástico amarillo. Mantenga un tubo con sólo ácido pentadecenoic metanólica de HCl como un control. Cerrar los tubos de vidrio herméticamente con tapas recubierto de teflón. </li><li> Incubar gltubos de culo en un baño de agua de 80 ° C durante 25 minutos. Los tubos deben ser sellados para que el disolvente no se evapora. </li><li> Después de los tubos se hayan enfriado, añada 1 ml de cloruro de sodio al 0,9% seguido de un ml de hexano y agitar vigorosamente. Centrifugar las muestras a 1000xg durante 3 minutos. </li><li> En la campana extractora de humos, retire la capa de hexano / superior de la muestra con pipeta Pasteur y colocarla en un tubo de vidrio nuevo 13x100 mm. </li><li> Evaporar hexano bajo una corriente lenta de N 2 sin secar por completo. </li><li> Disolver el resultado acil methylesters s en 60 l de hexano. Transferencia de las muestras en viales muestreador automático y tapa. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C para el corto plazo y -20 º C durante unos días. </li></ol> 4. Cromatografía de gas líquido (GLC) 10 <ol><li> Antes de comenzar GLC, asegúrese de que el hidrógeno helio, y los cilindros de aire se llenan. </li><li> Hexano suficiente hay que añadir a la reserva de disolvente y el contenedor de residuos debe estar vacío. Para la separación de grasas methylesters acilo, adjuntar una DB-23 columna de la máquina. </li><li> Viales lugar en el inyector automático. Inicie el software ChemStation en la CGL en el sistema informático. </li><li> Ajuste la temperatura de entrada a 250 ° C con una tasa de flujo de helio a 48.6 mL min-1 y la presión a 21,93 psi. La relación de separación es de 30,0: 1. </li><li> La temperatura del horno se establece inicialmente a 140 ° C durante 2 minutos y elevó a 160 ° C a una velocidad de 25 ° C min -1. A continuación, ajuste la temperatura aumentará de 160 ° C a 250 ° C a una velocidad de 8 ° C min -1 y mantener a 250 º C durante 4 minutos seguido de una disminución a 140 ° C a una velocidad de 38 ° C min - 1. Una carrera dura aproximadamente 21 minutos. </li><li> La temperatura del detector de ionización de llama es de 270 ° C con un caudal de hidrógeno de 30.0 mL min-1, la tasa de flujo de aire a 400 mL min-1 y la tasa de flujo de helio a 30.0 mL min-1. </li><li> Introduce el número de viales y nombre de la muestra en la tabla de secuencia de ejecución. Ajuste el inyector de 10 l para inyectar 2 l de la muestra por vial. </li><li> Cuando el instrumento está listo, inicie la secuencia de ejecución. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Ejemplos de tinción irreversible del TLC separados por los lípidos de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad se muestra en la Figura 2. Los lípidos de ácido sulfúrico manchada (Figura 2A) están carbonizados y aparecen como manchas de color marrón. α-naftol se prefiere a la mancha glicolípidos como MGDG, DGDG, SQDG glicolípidos etc teñidas con α-naftol llevar un color rosa-púrpura, mientras que otros lípidos polares mancha amarilla (Figura 2B). La tinción de yodo es reversible y lípidos da un color amarillento que va a desaparecer en un corto tiempo se evapora el yodo (Figura 2C). Lípidos brevemente manchados de yodo puede ser objeto de análisis por GLC a pesar de lípidos sin manchas son preferibles a reducir la descomposición de los lípidos. Si se hace correctamente, las señales distintivas que representan a diferentes grasos éster metílico de acilo se podrá realizar GLC (Figura 3). Éster metílico de acilo graso con cadena de carbono más cortas y menos enlaces dobles tienen menor tiempo de retención con el DB-23 de la columna. Acil perfiles de éster metílico es una herramienta sensible para identificar mutantes con la composición de lípidos alterados. En la Figura 4, el MGDG18: 3 proporción de ácidos grasos molar se encuentra disminuida en el mutante tgd4-1 en comparación con el tipo salvaje de 18 años. Dividiendo los moles de éster metílico de acil grasos de los lípidos de clase uno con los moles de todas las clases de lípidos, la relación molar de cada uno de los lípidos se calculan. Por ejemplo, para calcular la proporción molar de MGDG: (MGDG)% mol = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (total)] x 100% Las proporciones resultantes molar de cada clase de lípidos, tanto la de tipo salvaje y el mutante se puede comparar. Por ejemplo, el mutante tgd4-1 ha aumentado las cantidades relativas de MGDG y PG, pero disminuyeron las cantidades de DGDG y PE (Figura 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del análisis de los lípidos polares con plántulas de Arabidopsis. Lípidos totales se extraen de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad, y separados por TLC. Los lípidos separados puede ser raspado de la placa de TLC para la transesterificación seguida de análisis por GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separación de los lípidos en las placas de TLC. Extractos de lípidos de 35 mg (peso fresco) plántulas de tipo silvestre están separados por TLC y teñidas por el ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) o el vapor de yodo (C). Tres repeticiones se muestran en cada método de tinción. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, la fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análisis por GLC de Methylesters ácidos grasos (FAME) derivado de MGDG del tipo salvaje. FAME se separan en una columna de 30 m capilar y detectados por ionización de llama. Pentadecanoico ácido (15:00) se utiliza como estándar interno. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Perfil de ácidos grasos de MGDG en el tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Los ácidos grasos se presentan como el número de carbonos seguido por el número de dobles enlaces. Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Composición de los lípidos polares del tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran con barras de error.

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</ol>

TLC, junto con GLC proporciona una herramienta robusta y rápida para el análisis cuantitativo de los lípidos polares en las plantas. Pequeños cambios en la composición de los lípidos se pueden identificar, por lo tanto, este método ha sido utilizado para la detección a gran escala de los mutantes de alteración en los lípidos polares vías metabólicas 1,20. Este método también se usa ampliamente para las actividades de control de las enzimas que utilizan los lípidos polares como sustrato. 2,6,7 Además de las hojas, la composición de los lípidos de los tejidos vegetales tales como las raíces y las semillas o fracciones subcelulares como los cloroplastos y las mitocondrias también se puede determinar de la misma manera. El sistema de solventes (acetona, tolueno, agua) que se utiliza aquí está optimizado para la separación de glicolípidos y fosfolípidos en las plantas. Sin embargo, en tgd1, 2,3,4 mutantes y los cloroplastos aislados, TGDG corre junto con el PE, mientras que tetragalactosyldiacylglycerol funciona con PC. En este caso, un sistema disolvente de cloroformo, metanol, ácido acético y agua (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) se utiliza 13. A veces, una TLC bidimensional utilizando dos sistemas de solventes diferentes se realiza para separar aún más glicolípidos y fosfolípidos 19. Además, los tejidos de las plantas pueden estar directamente sometidos a la reacción FAME seguido por GLC para determinar el perfil de ácidos grasos totales, sin separación inicial de TLC 5. Junto a la demostrada TLC-GLC sistema, otro método utilizado para la creación de perfiles de lípidos se basa en la ionización directa de masas electrospray tandem espectrometría 17. En este método la separación cromatográfica inicial de lípidos en el extracto se omite. Sin embargo, este método requiere un equipo costoso y personal experimentado, que hace que sea menos útil para los análisis de rutina en el laboratorio o para la detección de mutantes.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl metanólico 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Diluir a 1N con metanol</td></tr><tr><td>Placas TLC Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Con absorbente previo</td></tr><tr><td>Cámara para TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos con tapa roscada</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Tapas roscadas</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>Disco de PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de GLC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Columna DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>Viales para GLC</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de viales para GLC</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Software Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de arabidopsis thaliana polar glycerolipid por cromatografía en capa fina (tlc), junto con cromatografía de gases (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Las células de las membranas biológicas separado del medio ambiente. De una sola célula de plantas y animales multicelulares, glicerolípidos, tales como la fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, membranas forman dos capas que actúan como los límites y las interfaces para el intercambio químico entre las células y su entorno. A diferencia de los animales, las células vegetales tienen un orgánulo especial para la fotosíntesis, los cloroplastos. El sistema de membranas de los cloroplastos intrincada contiene glicerolípidos única, es decir, glicolípidos que carecen de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Las funciones de estos lípidos están más allá de simplemente estructural. Estos glicolípidos y glicerolípidos otros fueron encontrados en las estructuras cristalinas del fotosistema I y II que indica la participación de glicerolípidos en la fotosíntesis 8,11. Durante la hambruna de fosfato, DGDG se transfirieron a membranas de extraplastidic para compensar la pérdida de los fosfolípidos de 9,12. Mucho de nuestro conocimiento de la biosíntesis y la función de estos lípidos se ha derivado de una combinación de estudios genéticos y bioquímicos con 14 Arabidopsis thaliana. Durante estos estudios, un procedimiento sencillo para el análisis de los lípidos polares ha sido esencial para la detección y el análisis de mutantes de lípidos y se describen en detalle. Un extracto lipídico de la hoja es primero separado por cromatografía en capa fina (TLC) y glicerolípidos se tiñen de forma reversible con vapor de yodo. Los lípidos son individuales raspado de la placa de TLC y se convierte en grasa methylesters acilo (FAME), que son analizados por cromatografía de gases acoplada con detección de ionización de llama (FID-GLC) (Figura 1). Este método ha demostrado ser una herramienta fiable para la detección de mutantes. Por ejemplo, el tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático a plastidio mutantes tráfico de lípidos fueron descubiertos sobre la base de la acumulación de una galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) y una disminución en la cantidad relativa de 18:3 (carbones: doble bonos) grupos acilo grasos en los lípidos de membrana 3,13,18,20. Este método también es aplicable para la determinación de actividades enzimáticas de las proteínas con los lípidos como sustrato 6.

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Las membranas biológicas separan las células del entorno. Desde una sola célula hasta las plantas y los animales multicelulares, los glicerolípidos, tales como...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la composición de lípidos polares en plántulas de arabidopsis. Esto se logra primero extrayendo los lípidos de las plántulas. Luego, los lípidos polares se separan mediante cromatografía en capa fina.A continuación, se aíslan delgadas capas de puntos lipídicos específicos de la placa y se convierten en ésteres metílicos de ácidos grasos mediante transesterificación. El paso final del procedimiento consiste en cuantificar la composición de los ésteres metílicos de ácidos grasos mediante cromatografía de gases-líquidos. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la relación molar y el perfil de ácidos grasos de cada lípido polar en el tipo salvaje y en el mutante.Hola, mi nombre es Christophe Benning. Muchos de ustedes nos han preguntado cómo realizar un análisis cuantitativo de lípidos polares. Utilizamos un método muy sencillo y robusto que nos ha funcionado bien durante el cribado a gran escala de mutantes en la planta modelo opsis o en los motores RG kilómetro.Otros métodos excelentes, como el perfilado de lípidos basado en espectrometría de masas, requieren equipos costosos y mucha experiencia y capacitación. Utilizamos un procedimiento en dos etapas que implica una cromatografía en capa fina sencilla combinada con la cuantificación de ésteres metílicos de ácidos grasos tras el aislamiento de mutantes. Por lo general, se requiere un análisis más cuantitativo.Esto se realiza mediante el aislamiento de lípidos de membrana a partir de la placa de capa delgada y la preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos, los cuales se cuantifican mediante cromatografía de gases acoplada a líquidos. El método es altamente reproducible y los resultados son comparables con técnicas más complejas basadas en espectrometría de masas, demostrando que el procedimiento será realizado por Zen Wang, estudiante de posgrado de mi laboratorio. Comience la extracción de lípidos cosechando 30 miligramos de hojas de Arabidopsis de cuatro semanas de edad provenientes de plantas cultivadas en medio sólidoificado con agar o en suelo. Transfiera las hojas a tubos de reacción de propileno de 1,5 mililitros.Añada 300 microlitros de disolvente de extracción compuesto por metanol, cloroformo y ácido fórmico a cada muestra. Agite las muestras vigorosamente durante cinco minutos. A continuación, añada 150 microlitros de ácido fosfórico 0,2 molar, cloruro de potasio 1 molar y vortex.Centrifugar brevemente la muestra a 13.000 × g durante un minuto. A temperatura ambiente, los lípidos disueltos en la fase inferior de cloroformo se aplicarán sobre placas de cromatografía en capa fina. Para preparar las placas de TLC, sumergir una placa de TLC de 20 por 20 centímetros recubierta con gel de sílice y tira de carga en una solución de sulfato de amonio 0,15 M.Después de sumergir durante 30 segundos, seque la placa durante al menos dos días en un recipiente cubierto. Durante la activación, la sublimación del amonio deja ácido sulfúrico, que protona el fosfato y el glicerol, necesario para su separación de otros lípidos de glicerol. El día del experimento, active las placas de CCF calentándolas en un horno a 120 grados Celsius durante dos horas y media.Después de enfriar las placas activadas a temperatura ambiente, utilice un lápiz para trazar una línea recta a través de la placa en el origen del cromatograma. En una campana extractora, se utiliza un tubo tigón conectado al regulador del tanque de nitrógeno para proporcionar un flujo de gas nitrógeno; lentamente, aplique tres veces 20 microlitros del extracto lipídico de la fase cloroformica inferior sobre la placa usando una pipeta de 20 microlitros con una punta plástica amarilla de 200 microlitros bajo un flujo lento de gas nitrógeno. Se utiliza una pipeta de 20 microlitros para mantener el punto con un diámetro menor a un centímetro.Cada placa puede contener hasta 10 muestras una vez que las manchas de lípidos se sequen completamente. En la campana extractora, prepare el disolvente de elución compuesto de acetona, tolueno y agua. Vierta 80 mililitros del disolvente de elución en una cámara sellable para elución en capa fina y coloque la placa dentro del tanque.Selle el tanque con el extremo de la muestra hacia abajo. Mediante el uso del clip, el disolvente ascenderá por la placa y los lípidos se separarán. El tiempo de revelado es de aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente.Cuando el frente del disolvente haya alcanzado un centímetro desde la parte superior de la placa, retire cuidadosamente la placa del tanque y séquela completamente en la campana extractora durante 10 minutos. Los lípidos separados mediante cromatografía en capa fina pueden teñirse temporalmente de forma reversible con yodo para análisis cuantitativo, o de forma irreversible con ácido sulfúrico o alfa naftol. Para teñir la placa de manera irreversible mediante carbonización con ácido sulfúrico.Rocíe la placa con ácido sulfúrico al 50% en agua utilizando un frasco rociador de vidrio en la campana extractora y coloque la placa en el horno a 120 grados Celsius durante 15 minutos. Alternativamente, para la tinción con alfa naftol para glicolípidos, rocíe la placa con alfa naftol al 2,4% peso sobre volumen en ácido sulfúrico al 10% volumen sobre volumen, etanol al 80% volumen sobre volumen. Hornee la placa a 120 grados Celsius durante tres a cinco minutos hasta que las manchas de glicolípidos se tiñan de color rosa o púrpura.Realice la tinción con yodo: en un campanario, prepare un tanque cerrado de cromatografía en capa delgada (CCD) con cristales de yodo en una bandeja en la parte inferior del tanque, lo que lleva a la saturación del ambiente con vapor de yodo. Coloque la placa de CCD en el tanque para exponerla al yodo hasta que los lípidos sean visibles. No exponga el yodo durante demasiado tiempo, ya que el yodo podría unirse covalentemente.Modifique los ácidos grasos poliinsaturados. Retire la sílice que rodea las manchas lipídicas identificadas en la placa de TLC con una cuchilla de afeitar y raspe la sílice que contiene los lípidos. Mediante un embudo, transfiera el polvo de sílice a un tubo de vidrio con tapón roscado de teflón.Añada un mililitro de ácido clorhídrico al uno por ciento en metanol anhidro a cada muestra mediante una pipeta de vidrio. Luego añada 100 microlitros de ácido pentadeceánico al 50 microgramos por mililitro a cada muestra como estándar interno, utilizando una pipeta de 200 microlitros por pipeteo con una punta plástica amarilla de 200 microlitros. Prepare también un tubo con solo ácido pentadecanoico en metanol con ácido clorhídrico como control.Cierre herméticamente los tubos de vidrio con tapas revestidas de teflón. Incube los tubos de vidrio en un baño de agua a 80 grados Celsius durante 25 minutos. Los tubos deben estar sellados para que el disolvente no se evapore después de que los tubos se enfríen.Añada un mililitro de cloruro de sodio al 0,9 % seguido de un mililitro de hexano, y luego agite vigorosamente en vórtex. Centrifugue las muestras a 1000 × g durante tres minutos. Tras la centrifugación, retire la capa superior de hexano de la muestra con una pipeta Pasteur en la campana extractora y colóquela en un nuevo tubo de vidrio de 13 por 100 milímetros. Evapore el hexano bajo una corriente lenta de nitrógeno sin secar completamente. Disuelva los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes en 60 microlitros de hexano. Transfiera las muestras a viales para autosampler y luego tápelos firmemente.Las muestras pueden almacenarse a cuatro grados Celsius a corto plazo y a veinte grados bajo cero durante unos días antes de comenzar la GLC. Asegúrese de que los tanques de helio, hidrógeno y aire estén llenos; se debe agregar suficiente hexano al depósito de disolvente y el recipiente de desecho debe estar vacío para la separación de ésteres metílicos de ácidos grasos. Conecte una columna DB 23 al equipo.Coloque los viales en el muestreador automático. Inicie el software de la estación química para GLC en el sistema. Computadora. Establezca la temperatura de la entrada a 250 grados Celsius con un flujo de helio de 48,6 mililitros por minuto y una presión de 21,93 PSI.La relación de división es de 30 a uno. La temperatura del horno se establece inicialmente a 140 grados Celsius durante dos minutos y luego se eleva a 160 grados Celsius a una velocidad de 25 grados Celsius por minuto. A continuación, se ajusta la temperatura para que aumente de 160 grados Celsius a 250 grados Celsius a una velocidad de ocho grados Celsius por minuto, manteniéndose a 250 grados Celsius durante cuatro minutos, seguido de una disminución a 140 grados Celsius a una velocidad de 38 grados Celsius por minuto.Usando este perfil de temperatura, un análisis dura aproximadamente 21 minutos. La temperatura del detector de ionización de llama es de 270 grados Celsius, con un caudal de hidrógeno de 30 mililitros por minuto. Caudal de aire de 400 mililitros por minuto y caudal de helio de 30 mililitros por minuto.Introduzca el número de viales y los nombres de las muestras en la tabla de secuencia de corridas. Ajuste el inyector de 10 microlitros para inyectar dos microlitros de la muestra por vial. Cuando el instrumento esté listo, inicie la secuencia de corridas.Se muestran aquí ejemplos de la tinción de lípidos separados por TLC a partir de plántulas de Arabidopsis de cuatro semanas de edad. Los lípidos teñidos con ácido sulfúrico se carbonizan y aparecen como manchas marrones. Se prefiere alfa natal para teñir glicolípidos como M-G-D-G-D-G-D-G y SQ dg.Los glicolípidos teñidos con alfa natal presentan un color púrpura rosado, mientras que otros lípidos polares se tiñen de amarillo. La tinción con yodo es reversible y proporciona a los lípidos un color amarillento que desaparecerá en poco tiempo a medida que el yodo se evapore. Breve­mente, los lípidos teñidos con yodo pueden someterse a análisis por GLC, aunque es preferible utilizar lípidos sin teñir para reducir la degradación de los lípidos si el procedimiento se realiza con éxito.Se observarán señales distintivas que representan diferentes metil ésteres de ácidos grasos tras la GLC; los metil ésteres de ácidos grasos con cadenas de carbono más cortas y menos enlaces dobles tienen un tiempo de retención más corto. Utilizando la columna DB 23. El perfilado de metil ésteres de ácidos grasos es una herramienta sensible para identificar mutantes con composición lipídica alterada.La proporción molar de ácidos grasos de MGDG 18 se reduce en el mutante TGD cuatro guion uno en comparación con el tipo salvaje, dividiendo los moles de éster metílico de ácido graso de una clase lipídica entre los moles de éster metílico de ácido graso de todas las clases lipídicas. Se calculan las proporciones molares de cada lipido, y las proporciones molares resultantes de cada clase lipídica, tanto del tipo salvaje como del mutante, pueden compararse aquí. Es evidente que el mutante TGD cuatro guion uno presenta cantidades relativas aumentadas de MGDG y pg, pero cantidades reducidas de D-G-D-G-N-P-E. La cromatografía en capa fina permite examinar muchas muestras en paralelo y posibilita un examen visual de las diferencias principales en los perfiles lipídicos.Además, al observar una TLC, esencialmente está examinando muchas enzimas y genes necesarios para la síntesis de los lípidos y, por lo tanto, para el perfil de lípidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la composición de lípidos polares mediante TOC y GOC. Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.

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Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC) (Video) | JoVE Journal

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

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