Subcutánea infección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)
9 de febrero de 2011
La piel murina y el modelo de infección de los tejidos blandos se utiliza para evaluar la función de la virulencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y la respuesta inmune de acogida. Aquí, presentamos un modelo de infección subcutánea de la piel y la infección de tejidos blandos.
El objetivo general del siguiente experimento es examinar la supervivencia y diseminación del staphylococcus aureus resistente a la meticilina o MA, así como los niveles de quimioquinas y citoquinas en los sitios de infección. Esto se logra eliminando el vello de la espalda de los ratones para permitir un área clara de observación. Como segundo paso.
El MRSA en suspensión se administrará a los ratones por vía subcutánea tres días después de la infección; las patologías de la infección y los recuentos bacterianos pueden evaluarse mediante la determinación del número de unidades formadoras de colonias a partir de homogenatos tisulares en placas de agar. Hola, ¿cómo estás? Mi nombre es De Lordon.
Soy investigadora postdoctoral. Hola, mi nombre es Mariel Sánchez. Soy estudiante de doctorado y yo soy Andrea Huda.
Soy investigador asociado, formamos parte del laboratorio de George Lee en el departamento de pediatría del Centro Médico Cedars-Sinai. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo médico, como la modelización de infecciones graves, incluyendo miositis, polimiositis y fascitis necrosante. Aunque este método puede proporcionar información sobre infecciones graves de emergencia, también puede aplicarse a otros sistemas, como el estreptococo del grupo A y otros organismos.
Además, podemos estudiar la función y la patogénesis de otros organismos que causan miositis y polimiositis. En general, las personas nuevas en este procedimiento pueden tener dificultades porque uno de los miembros del personal de las áreas de regulación global es altamente mutable. Si no se toman precauciones, los datos recopilados pueden presentar variaciones significativas, lo que resultará en dificultades para interpretarlos.
Comencemos. En una instalación de nivel de seguridad biológica dos, prepare una placa de agar sangre de oveja en base TSA y un asa estéril utilizando un bloque congelado. Transfiera la cepa de cultivo Mercer desde el almacenamiento a menos 80 grados Celsius.
Luego, utilizando el asa estéril, desprenda un pequeño trozo de hielo del cultivo patrón y colóquelo en la placa. Después de obtener un pequeño fragmento del cultivo patrón Mercer, transfiera inmediatamente el cultivo patrón de vuelta al congelador para evitar su descongelación, ya que los ciclos repetidos de congelación y descongelación dañarán el cultivo patrón. Utilice el asa para rayar el agar, facilitando así el crecimiento de colonias individuales de Mercer.
Incubar la placa a 37 grados Celsius durante la noche sin suplemento de CO2. Al día siguiente, preparar y etiquetar una nueva placa de sangre con huevo, una placa de TSA y un tubo de 15 mililitros con tapa de rosca que contenga tres mililitros de THB.
Recupere la placa M SSA cultivada durante la noche y examine el fenotipo hemolítico de las colonias. Utilizando un asa estéril, seleccione una colonia cuyo fenotipo sea consistente con el de colonias experimentales previas. Inocule el THB con la colonia seleccionada utilizando el mismo asa para la siembra por estrías.
Incubar la placa con la solución THB a 37 grados Celsius durante la noche con agitación a 220 rotaciones por minuto. Estas bacterias se utilizarán para inocular el cultivo destinado a la infección subcutánea de los ratones en pasos posteriores. Colocar también la placa de agar sangre en el incubador.
La placa se utilizará a la mañana siguiente para confirmar que el fenotipo hemolítico de las bacterias en la solución THB coincide con el de la colonia seleccionada originalmente. Si el fenotipo de hemólisis no es consistente con el del clon original, no inicie el experimento. Transfiera el ratón a una plataforma y retire el vello de su espalda.
Si el animal es excesivamente agresivo, puede ser necesaria la sedación con isoflurano. Aplique aproximadamente cinco milímetros cúbicos de crema depilatoria, como NA, en la zona afeitada. NA puede comprarse en la farmacia local.
Asegúrese de adquirir la crema depilatoria que contiene aceite de bebé, ya que el producto sin aceite de bebé será demasiado estimulante para los ratones. Deje que la crema actúe sobre la superficie de la piel durante aproximadamente un minuto; mientras la crema depilatoria está actuando, humedezca algunas toallas de papel con agua doblemente destilada después de un minuto. Utilice las toallas de papel húmedas para limpiar el área afeitada.
Asegúrese de que la piel esté libre de la crema depilatoria. Precaliente 10 mililitros de THB en un tubo de tapón roscado de 50 mililitros a 37 grados Celsius en un incubador bacteriano durante cuatro a 10 horas. Transfiera 20 microlitros de la cultura bacteriana de crecimiento nocturno al THB precalentado. Esto diluirá la cultura nocturna.
Una suspensión de uno a 500. Coloque el tubo a 37 grados Celsius en un incubador con agitación a 220 rotaciones por minuto durante aproximadamente dos horas y media a tres horas después del período de incubación. Use más THB para diluir aún más la suspensión bacteriana a uno a 10 y mida la suspensión con un espectrofotómetro.
Con absorbancia a 514 nanómetros. Incubar nuevamente la suspensión a 37 grados Celsius con agitación a 220 rotaciones por minuto hasta que la suspensión diluida 1:10 alcance 0,25. Para recoger el M er, centrifugar el tubo de 50 mililitros a 3.225 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, desechar el sobrenadante y resuspender.
Suspenda la paleta bacteriana en 10 mililitros de DPBS y lave nuevamente las bacterias repitiendo el paso de centrifugación para este modelo de infección severa. Re suspenda el sedimento bacteriano en aproximadamente un mililitro de DPBS, obteniendo aproximadamente 1 × 10¹⁰ unidades formadoras de colonias por mililitro. Prepare placas de sangre de oveja A-R-T-S-A, diluya seriamente las bacterias de 10¹ a 10⁸ veces en DPBS e inocule en las placas.
Coloque gotas de 10 microlitros de la suspensión bacteriana diluida en serie sobre una placa de agar sangre en tres repeticiones. Incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche. Después de incubar las placas durante 16 a 18 horas, observe y registre el fenotipo de hemólisis del inóculo.
Cuente las unidades formadoras de colonias en las placas. La inóculación de la infección se calculará en función del número de unidades formadoras de colonias en las placas.
Prepare una jeringa con 100 microlitros de la suspensión bacteriana en DPBS preparada anteriormente. Antes de la inyección, los ratones deben sedarse para que su frecuencia respiratoria sea de aproximadamente una vez por segundo. A efectos de demostración, en este video se muestra un ratón sacrificado.
Después de la inyección, inyecte el M ser en un flanco. Devuelva el ratón a su jaula. Observe a los animales durante tres a cinco horas después de la inyección para asegurarse de que el ratón esté vivo antes de devolverlo a la sala de animales.
Monitoree diariamente las lesiones en el dorso de los animales después de que estos hayan sido sacrificados. Mida y registre el tamaño y estado de las lesiones en la piel. Tanto las áreas de lesión de la piel como de los músculos se cuantifican multiplicando la longitud y la anchura de la lesión en milímetros.
Las lesiones de forma irregular deben dividirse en fragmentos más pequeños y simétricos, y cada fragmento debe medirse mediante el mismo método. Prepare tubos microcéntrifugos de 1,5 mililitros con 100 microlitros de DPBS para la recolección del tejido. Haga un pequeño corte en la piel con una hoja de afeitar estéril y extirpe la lesión con un par de tijeras estériles.
Al extirpar la lesión, asegúrese de que también se extirpe aproximadamente de dos a cinco milímetros de piel sana que rodea la zona. Coloque la lesión en los tubos de recolección de tejido para analizar las lesiones musculares. Retire cuidadosamente la piel para medir el tamaño y registrar el estado de la lesión en el tejido muscular.
Recolecte el bazo y los riñones. Coloque estos tejidos en sus propios tubos de recolección individuales. Homogenice los tejidos agitando con una jeringa de un mililitro durante aproximadamente 30 segundos.
Añada 900 microlitros de DPBS a cada tubo. Prepare las placas THA y vortexee las muestras de tejido homogeneizadas durante cinco minutos. Diluya la muestra en serie.
Las suspensiones se diluyen entre uno y diez elevado a la seis veces. En placas de 96 pocillos, distribuya 10 microlitros de cada suspensión diluida en serie sobre los pocillos. Incube las placas en un incubador bacteriano a 37 grados Celsius durante la noche.
A la mañana siguiente, cuente las unidades formadoras de colonias en las placas y calcule el número de unidades formadoras de colonias según los factores de dilución. Si la infección se realiza correctamente, se observará una ampolla en la superficie de la piel inmediatamente después de la inyección subcutánea. Si no se observa ninguna ampolla, es posible que la inyección sea demasiado profunda, lo cual podría afectar el resultado de la infección.
El tamaño de la lesión y la supervivencia bacteriana pueden evaluarse en varios momentos posteriores a la infección mediante MSA. Las siguientes lesiones cutáneas se examinaron el día tres posterior a la infección y son ejemplos de una lesión en un ratón CD uno infectado en un flanco con una vez 10 a la siete unidades formadoras de colonias. Las lesiones musculares se encuentran típicamente en el tejido debajo de las lesiones cutáneas.
A continuación se muestran ejemplos de lesiones musculares superficiales coincidentes con las lesiones cutáneas previamente mostradas en las fotografías. Estas son lesiones musculares observadas al tercer día posterior a la infección en un ratón infectado con una vez 10 a la siete unidades formadoras de colonias. El área de la lesión se determina como la longitud multiplicada por el ancho de la lesión, medida en milímetros, y puede ser evaluada para determinar el daño tisular de la piel.
El número de unidades formadoras de colonias de las bacterias localizadas en el sitio de infección puede cuantificarse en lesiones extirpadas. El recuento de unidades formadoras de colonias puede indicar si un factor de virulencia proporciona al MSA una ventaja de supervivencia. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar las precauciones estándar de seguridad debido al uso de agujas y microbios altamente patógenos tras seguir este procedimiento.
Por último, en el modelo de absceso se utiliza un inóculo 1.000 veces menor en comparación con nuestro modelo, y puede emplearse para responder preguntas adicionales, como ¿cuáles son los factores S que promueven la infección persistente por RSA? No olvide que trabajar con jeringas llenas de un Mars A puede ser extremadamente peligroso, y que es fundamental tomar precauciones, como desechar la jeringa directamente en un recipiente para objetos punzocortantes, a fin de evitar punciones accidentales con la aguja. Además, para este experimento, es importante seguir los protocolos estándar de BS O2 para asegurar la desinfección adecuada del área de trabajo.
Así que eso es todo. Gracias por vernos. Hola. Hola, adiós.
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Resumen
Este estudio utiliza un modelo de infección de la piel y tejidos blandos en ratón para evaluar la virulencia de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y las respuestas inmunológicas del huésped. El modelo permite examinar la supervivencia y diseminación bacterianas, así como analizar los niveles de quimioquinas y citoquinas en los sitios de infección.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Inmunología
- Enfermedades infecciosas
Antecedentes
- El MRSA es un patógeno importante responsable de infecciones de la piel y de los tejidos blandos.
- Comprender las interacciones entre el huésped y el patógeno es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- El modelo murino proporciona información sobre la respuesta inmunitaria frente a las infecciones por MRSA.
- Estudios previos han destacado la importancia de las citoquinas y quimioquinas en la infección.
Objetivo del estudio
- Evaluar la virulencia de MRSA en un modelo de infección controlado.
- Medir las respuestas inmunológicas del huésped durante la infección.
- Analizar la diseminación de MRSA y su impacto en los tejidos del huésped.
Métodos Utilizados
- Eliminación del vello de la espalda de los ratones para crear un área clara de observación.
- Administración subcutánea de suspensión de MRSA a los ratones.
- Evaluación de las patologías infecciosas mediante recuentos bacterianos.
- Determinación de unidades formadoras de colonias a partir de homogeneizados tisulares en placas de agar.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de un modelo de infección subcutánea.
- Cuantificación de la carga bacteriana en los sitios de infección.
- Análisis de los niveles de quimioquinas y citoquinas en respuesta al MRSA.
- Conocimientos sobre la dinámica de la respuesta inmunitaria durante la infección.
Conclusiones
- El modelo murino es efectivo para estudiar las infecciones por MRSA.
- Las respuestas inmunitarias del huésped son fundamentales para controlar la diseminación de MRSA.
- Se necesita más investigación para explorar intervenciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos in vivo robustos para la infección por MRSA son esenciales para reducir los riesgos en el descubrimiento temprano de agentes antiinfecciosos y para aclarar las interacciones huésped-patógeno que provocan una patología tisular grave. Este modelo de infección subcutánea permite la evaluación cuantitativa de la supervivencia bacteriana, la diseminación y la respuesta inmunitaria, lo que fortalece la confianza predictiva en la validación de dianas y en la investigación traslacional. El enfoque orienta las decisiones del portafolio al proporcionar resultados cuantitativos reproducibles, relevantes tanto para pruebas de hipótesis mecanicistas como terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar factores de virulencia de MRSA y vías inmunitarias del huésped en un sistema controlado y relevante para la enfermedad.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la cuantificación de la supervivencia bacteriana y la patología de las lesiones in vivo.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante la medición de las respuestas de quimioquinas y citoquinas en los sitios de infección.
- Proporciona datos para orientar la confianza predictiva y la clasificación de candidatos antiinfecciosos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un modelo animal validado para la evaluación de eficacia y cribado mecanicista de agentes anti-MRSA.
- Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas, como el tamaño de la lesión y el recuento de unidades formadoras de colonias.
- Permite la reproducibilidad y escalabilidad para la evaluación comparativa de intervenciones candidatas.
- Facilita la preparación del ensayo para la integración de datos entre estudios y equipos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con puntos finales relevantes para la enfermedad al modelar infecciones graves de tejidos blandos observadas clínicamente.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la evaluación de biomarcadores y patología.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos cuantitativos de infección y respuesta inmunitaria.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas en programas translacionales de agentes antiinfecciosos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este modelo se sitúa dentro del continuo que va desde el descubrimiento temprano hasta la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, la validación de dianas y la evaluación traslacional de estrategias antiinfecciosas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación basada en hipótesis de los mecanismos de virulencia del SARM y de la respuesta del huésped.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la evaluación de candidatos y la estandarización de ensayos.
- Análisis: Permite la medición del tamaño de las lesiones, la carga bacteriana y los mediadores inmunitarios para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante datos de patología y biomarcadores relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y reutilizable para la I+D de agentes antiinfecciosos en múltiples programas y patógenos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo in vivo estandarizados, escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos antiinfecciosos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales, modelado de enfermedades infecciosas y evaluación cuantitativa de la patología.
- Exige infraestructura de instalaciones BSL-2 y protocolos rigurosos de bioseguridad para el manejo de MRSA.
- Necesita estandarización entre equipos en la preparación del inóculo, la medición de lesiones y el análisis de datos.
- Adaptable a otros patógenos y modelos de infección con validación adecuada.
- Potencial de variabilidad en los datos si no se mantiene el fenotipo bacteriano o la consistencia de los procedimientos.
