Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico
1 de agosto de 2007
Hola, soy Alex Hoge. Trabajo en el Laboratorio de la Sala Gym del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Hoy les mostraré cómo transformar E. coli electrocompetente mediante el método de choque eléctrico.
Hoy voy a utilizar esta técnica para transformar un coli con mi producto de ligación porque estoy preparando una sonda para realizar una hibridación in situ en montaje completo en pez cebra. Bien, así que vamos a comenzar con la transformación. Primero, debes tener tu baño de agua o bloque seco a 42 grados.
Debe tener sus bacterias que acaba de sacar de la ciudad principal sobre hielo. Hoy utilizamos células competentes eléctricamente procedentes de ities y también su ADN sobre hielo. Además, necesita un tubo de medio SOC a temperatura ambiente o a 37 °C y sus placas de medio LB más antibiótico.
Ahora voy a añadir el ADN junto con las bacterias. Trabajo cerca de la llama para no contaminar las bacterias. Añado la lación junto con las bacterias.
50 microlitros de bacterias y luego inmediatamente de vuelta en el hielo; puede agitarlo ligeramente para mezclar las bacterias con su ADN y dejarlo hasta 15 minutos en hielo. Ahora han pasado 15 minutos y estamos listos para realizar el choque térmico, que consiste en colocar las bacterias a 42 grados durante 45 segundos. Así que saco los tubos del hielo y los coloco directamente en un baño a 42 grados, pongo un temporizador de 45 segundos y luego los regreso rápidamente al hielo, sacándolos inmediatamente de los 42 grados y colocándolos directamente sobre hielo.
Luego esperamos durante dos minutos. Ahora voy a añadir el medio SOC a las bacterias y colocarlas a 37 durante 30 minutos. Así que pipeteo 500 microlitros del medio SOC y los añado a las bacterias, colocándolas luego en mi pequeña cámara improvisada.
Entonces, si va a utilizar tubos eppendorf y una cámara improvisada para su incubadora, asegúrese de colocar los tubos eppendorf en posición horizontal porque así se agitarán mucho mejor. Ahora estamos listos para colocar los tubos en el agitador, de modo que mantengamos esta pequeña cámara a 37 grados durante 30 minutos.
Ahora hemos terminado la incubación a 37 grados y vamos a sembrar las bacterias en agar lb más antibióticos. En mi caso, es cloranfenicol. Así que tomo 50 microlitros de cada muestra y los coloco en la placa.
Así que con los 500 microlitros restantes, se centrifugan en una pequeña centrífuga de mesa, con el fin de separar las bacterias. Después de la centrifugación, obtenemos un buen pellet y lo que haremos ahora es eliminar casi todo el medio SOC, dejando solo 50 microlitros, y luego podemos sembrar estos 50 microlitros de bacterias concentradas. Así que he eliminado aproximadamente 450 microlitros.
Dejo solo esta cantidad. Ahora voy a suspender el pellet en los 50 microlitros restantes de medio SOC. Y después puedo sembrar estos 50 microlitros en otra placa.
Así que resisto cada placa, luego la manipulo y la siembro. Al final habrá dos placas por muestra. Ahora debemos extender las bacterias sobre la placa de LB.
Así que voy a usar algunas perlas de vidrio autoclavadas, pero también puedes usar una pipeta de Pasteur que dobles para formar un espátula como esta. Voy a colocar algunas perlas en la placa de Petri. Me gusta eso.
Bueno, 10 15. Después de agregar las perlas, coloque todas sus placas en una pila como esa y agítelas suavemente para que las perlas distribuyan las bacterias uniformemente por toda la superficie de las placas. Así, mientras muevo las placas, hasta que se sequen.
Por lo tanto, eso significa que no debería ver grandes manchas de líquido cuando mueve las perlas. Por ejemplo, en esa placa, las perlas tienden a agruparse y se observan muchas manchas. Está sudorosa esa, las perlas se mueven libremente; esa otra está seca.
Ahora las placas están secas, por lo que podemos desechar las perlas. Simplemente hago la succión así para que puedan reciclarse. Ahora vamos a colocar la placa en el incubador a 37 °C durante la noche, y colocan las placas boca abajo. Después de 12 horas de incubación a 37 °C, sacamos la placa del incubador.
Y como podemos observar, tenemos menos colonias en la placa donde sembré 50 microlitros en comparación con la placa donde sembré el resto. Lo importante al transformar bacterias es tener la cantidad adecuada de colonias en la placa, es decir, la densidad correcta. En este caso, hay muy pocas colonias, pero si se desean más colonias, se puede tomar como buen ejemplo esta placa, donde la densidad es exactamente la adecuada, aproximadamente 100 colonias por placa.
Esta placa es un mal ejemplo porque hay demasiadas colonias y no se pueden seleccionar colonias individuales. Así que acabo de mostrarle cómo transformar E. coli mediante cada transformación. Por lo tanto, el aspecto muy importante de esta técnica es mantener todo frío en hielo antes del choque.
Luego 45 segundos normales, más a 42 grados de vuelta en hielo. Y entonces todo lo demás debe estar a una temperatura cálida o de 37 grados. Ahora voy a tamizar mis colonias mediante tamizaje por PCR.
Por lo tanto, uno de los puntos también consiste en tener dos placas. En una, esperamos tener muchas colonias, y en la otra, menos colonias. Y lo importante es tener las placas muy secas mediante el uso de perlas o la pipeta Pasteur.
Gracias por ver el video y mucha suerte con su confirmación.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este video demuestra la transformación de E. coli competentes eléctricamente utilizando el método de choque térmico. La técnica se aplica para preparar E. coli para experimentos posteriores que involucran peces cebra.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Ingeniería Genética
- Biología Celular
Antecedentes
- La transformación es un método utilizado para introducir ADN extranjero en células bacterianas.
- El choque térmico es una técnica común para aumentar la permeabilidad de la membrana celular bacteriana.
- Este método es esencial para diversas aplicaciones en biología molecular.
- Los peces cebra se utilizan a menudo como organismo modelo en estudios de biología del desarrollo.
Objetivo del estudio
- Demostrar el método de choque térmico para transformar E. coli.
- Preparar E. coli para experimentos posteriores que involucren pez cebra.
- Ofrecer una guía visual para investigadores interesados en técnicas de transformación genética.
Métodos Utilizados
- Preparación de células competentes de E. coli.
- Aplicación de choque térmico a 42 grados Celsius.
- Uso de un baño de agua o bloque seco para el control de temperatura.
- Introducción de ADN plasmídico en las células competentes.
Resultados principales
- Transformación exitosa de E. coli con el plásmido deseado.
- Demuestra la eficacia de la técnica de choque térmico.
- Preparación de E. coli para análisis posteriores en estudios con pez cebra.
- Confirmación visual de la eficiencia de transformación.
Conclusiones
- El método de choque térmico es una técnica confiable para transformar E. coli.
- Este método puede aplicarse a diversas aplicaciones de ingeniería genética.
- Comprender esta técnica es fundamental para los investigadores en biología molecular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El método de transformación por choque térmico permite la introducción confiable de ADN plasmídico en E. coli, un paso fundamental para la construcción de herramientas genéticas utilizadas en la validación de dianas y el desarrollo de ensayos. Esta técnica apoya los flujos de trabajo iniciales de descubrimiento mediante la generación de cepas recombinantes para cribado fenotípico y desactivación mecanicista de riesgos en sistemas relevantes para enfermedades. Su estandarización y reproducibilidad aumentan la confianza predictiva en los procesos de identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la expresión génica o la inhibición por ARN interferente basadas en plásmidos en sistemas bacterianos.
- Valor operativo: Proporciona un método escalable para generar bibliotecas clonales destinadas a evaluar la función del blanco y la modulación de rutas metabólicas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Produce E. coli transformado adecuado para la preparación de bibliotecas de plásmidos utilizadas en campañas de cribado de alto rendimiento.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles mediante el conteo de colonias en medios selectivos, lo que favorece la estandarización de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la construcción de cepas marcadoras o sistemas sensores para monitorear la actividad de rutas metabólicas en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la propagación confiable de ADN para estudios in vivo.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método de choque térmico se integra en la continuidad del descubrimiento, actuando como un paso crítico entre la identificación del blanco y la generación de compuestos iniciales, al permitir la manipulación del ADN para la validación funcional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la transformación de plásmidos para evaluar la función génica en sistemas de expresión bacteriana.
- Selección: Permite la preparación estandarizada de células competentes y la transformación de bibliotecas de ADN para ensayos.
- Análisis: Proporciona métricas cuantitativas de eficiencia de transformación mediante el recuento de unidades formadoras de colonias, lo que permite comparar constructos de ADN.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante la generación de ADN plasmídico para su uso en modelos de mamíferos o de pez cebra, como se demuestra en la fuente.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de plataforma reutilizable para la ingeniería genética en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación de objetivos al permitir una manipulación genética precisa en sistemas microbianos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante parámetros estandarizados de choque térmico (42 °C durante 45 segundos) y protocolos de recuperación.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la identificación de candidatos principales al proporcionar acceso confiable a cepas modificadas para cribados posteriores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante la generación consistente de herramientas genéticas validadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere técnica aséptica y familiaridad con el manejo bacteriano para prevenir contaminaciones.
- Depende del acceso a equipos con control de temperatura (baño de agua o bloque seco) para la aplicación precisa del choque térmico.
- Necesita la estandarización de los medios SOC y de las placas de selección con antibióticos entre diferentes equipos para obtener resultados consistentes.
- Requiere considerar adaptaciones al utilizar diferentes cepas bacterianas o constructos de plásmidos, ya que la eficiencia puede variar.
- Limitación práctica: la eficiencia de transformación depende de la calidad del ADN y de la competencia celular, lo que exige una optimización para plásmidos difíciles de transformar.
