Name: Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende el método de choque térmico para transformar E. coli con ADN plásmido en ingeniería genética. Esta técnica permite preparar bacterias competentes para estudios de expresión proteica y biología molecular.

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transformación de adn plásmido en e. coli utilizando el método de choque térmico

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformación de ADN plásmido en E. coli usando el método de choque térmico es una técnica básica de la biología molecular. Consiste en la inserción de un producto extranjero plásmido o la ligadura en las bacterias. Este protocolo de vídeo describe el método tradicional de transformación utilizando comercialmente disponibles a partir de bacterias competentes químicamente Genlantis. Después de un corto de incubación en hielo, una mezcla de químicos y bacterias competentes de ADN se coloca a 42 ° C durante 45 segundos (golpe de calor) y luego se coloca de nuevo en hielo. SOC medios de comunicación y se añade a las células transformadas se incubaron a 37 º C durante 30 minutos con agitación. Para estar seguro de aislar a las colonias, independientemente de la eficiencia de transformación, dos cantidades de bacterias transformadas se siembran. Este protocolo tradicional puede ser utilizado con éxito para transformar bacterias competentes la mayoría de los disponibles en el mercado. El turbocells de Genlantis también puede ser utilizado en un protocolo de transformación la novela de 3 minutos, que se describe en el manual de instrucciones.

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

La transformación de ADN plasmidico en E. coli mediante el método de choque térmico es una técnica básica de la biología molecular. Consiste en la inserción de un ...

Hola, soy Alex Hoge. Trabajo en el Laboratorio de la Sala Gym del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Hoy les mostraré cómo transformar E. coli electrocompetente mediante el método de choque eléctrico.Hoy voy a utilizar esta técnica para transformar un coli con mi producto de ligación porque estoy preparando una sonda para realizar una hibridación in situ en montaje completo en pez cebra. Bien, así que vamos a comenzar con la transformación. Primero, debes tener tu baño de agua o bloque seco a 42 grados.Debe tener sus bacterias que acaba de sacar de la ciudad principal sobre hielo. Hoy utilizamos células competentes eléctricamente procedentes de ities y también su ADN sobre hielo. Además, necesita un tubo de medio SOC a temperatura ambiente o a 37 °C y sus placas de medio LB más antibiótico.Ahora voy a añadir el ADN junto con las bacterias. Trabajo cerca de la llama para no contaminar las bacterias. Añado la lación junto con las bacterias.50 microlitros de bacterias y luego inmediatamente de vuelta en el hielo; puede agitarlo ligeramente para mezclar las bacterias con su ADN y dejarlo hasta 15 minutos en hielo. Ahora han pasado 15 minutos y estamos listos para realizar el choque térmico, que consiste en colocar las bacterias a 42 grados durante 45 segundos. Así que saco los tubos del hielo y los coloco directamente en un baño a 42 grados, pongo un temporizador de 45 segundos y luego los regreso rápidamente al hielo, sacándolos inmediatamente de los 42 grados y colocándolos directamente sobre hielo.Luego esperamos durante dos minutos. Ahora voy a añadir el medio SOC a las bacterias y colocarlas a 37 durante 30 minutos. Así que pipeteo 500 microlitros del medio SOC y los añado a las bacterias, colocándolas luego en mi pequeña cámara improvisada.Entonces, si va a utilizar tubos eppendorf y una cámara improvisada para su incubadora, asegúrese de colocar los tubos eppendorf en posición horizontal porque así se agitarán mucho mejor. Ahora estamos listos para colocar los tubos en el agitador, de modo que mantengamos esta pequeña cámara a 37 grados durante 30 minutos.Ahora hemos terminado la incubación a 37 grados y vamos a sembrar las bacterias en agar lb más antibióticos. En mi caso, es cloranfenicol. Así que tomo 50 microlitros de cada muestra y los coloco en la placa.Así que con los 500 microlitros restantes, se centrifugan en una pequeña centrífuga de mesa, con el fin de separar las bacterias. Después de la centrifugación, obtenemos un buen pellet y lo que haremos ahora es eliminar casi todo el medio SOC, dejando solo 50 microlitros, y luego podemos sembrar estos 50 microlitros de bacterias concentradas. Así que he eliminado aproximadamente 450 microlitros.Dejo solo esta cantidad. Ahora voy a suspender el pellet en los 50 microlitros restantes de medio SOC. Y después puedo sembrar estos 50 microlitros en otra placa.Así que resisto cada placa, luego la manipulo y la siembro. Al final habrá dos placas por muestra. Ahora debemos extender las bacterias sobre la placa de LB.Así que voy a usar algunas perlas de vidrio autoclavadas, pero también puedes usar una pipeta de Pasteur que dobles para formar un espátula como esta. Voy a colocar algunas perlas en la placa de Petri. Me gusta eso.Bueno, 10 15. Después de agregar las perlas, coloque todas sus placas en una pila como esa y agítelas suavemente para que las perlas distribuyan las bacterias uniformemente por toda la superficie de las placas. Así, mientras muevo las placas, hasta que se sequen.Por lo tanto, eso significa que no debería ver grandes manchas de líquido cuando mueve las perlas. Por ejemplo, en esa placa, las perlas tienden a agruparse y se observan muchas manchas. Está sudorosa esa, las perlas se mueven libremente; esa otra está seca.Ahora las placas están secas, por lo que podemos desechar las perlas. Simplemente hago la succión así para que puedan reciclarse. Ahora vamos a colocar la placa en el incubador a 37 °C durante la noche, y colocan las placas boca abajo. Después de 12 horas de incubación a 37 °C, sacamos la placa del incubador.Y como podemos observar, tenemos menos colonias en la placa donde sembré 50 microlitros en comparación con la placa donde sembré el resto. Lo importante al transformar bacterias es tener la cantidad adecuada de colonias en la placa, es decir, la densidad correcta. En este caso, hay muy pocas colonias, pero si se desean más colonias, se puede tomar como buen ejemplo esta placa, donde la densidad es exactamente la adecuada, aproximadamente 100 colonias por placa.Esta placa es un mal ejemplo porque hay demasiadas colonias y no se pueden seleccionar colonias individuales. Así que acabo de mostrarle cómo transformar E. coli mediante cada transformación. Por lo tanto, el aspecto muy importante de esta técnica es mantener todo frío en hielo antes del choque.Luego 45 segundos normales, más a 42 grados de vuelta en hielo. Y entonces todo lo demás debe estar a una temperatura cálida o de 37 grados. Ahora voy a tamizar mis colonias mediante tamizaje por PCR.Por lo tanto, uno de los puntos también consiste en tener dos placas. En una, esperamos tener muchas colonias, y en la otra, menos colonias. Y lo importante es tener las placas muy secas mediante el uso de perlas o la pipeta Pasteur.Gracias por ver el video y mucha suerte con su confirmación.

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