Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

Hola, soy Alex Hoge. Trabajo en el gimnasio Hall Lab en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y hoy voy a mostrarte cómo transformar una ecoli eléctricamente competente por el método de cada choque.

Así que hoy estoy usando esta técnica para transformar una coli con mi producto de lación porque estoy haciendo un intento de hacer un montaje completo en el pez cebra. Bien, entonces vamos a empezar a hacer la transformación. Por lo tanto, primero debe tener su baño de agua o autobús seco a 42 grados.

Necesitas tener las bacterias que acabas de sacar de la ciudad principal en hielo. Hoy en día utilizamos células de competencia eléctrica de las idades y también de su ADN en el hielo. Además, necesita un tubo de medios SOC a temperatura doméstica o 37 y sus placas de LV más medios antibióticos.

Así que ahora voy a añadir el ADN con las bacterias. Así que trabajo al lado de la llama para no contaminar las bacterias. Así que agrego lación con las bacterias.

Son 50 microlitros de bacterias y luego, inmediatamente de vuelta en el hielo, puedes moverlo un poco para mezclar las bacterias y tu ADN y dejarlo hasta 15 minutos en hielo. Así que ahora han pasado 15 minutos y estamos listos para hacer el choque térmico, que consiste en poner las bacterias a 42 grados durante 45 segundos. Así que saco los tubos del hielo directamente a 42 grados, con temporizador de 30 y 45 segundos, y luego los vuelvo a poner en el hielo muy rápido y los saco de 42 directamente en el hielo.

Y luego esperamos dos minutos. Así que ahora voy a agregar el medio SOC a las bacterias y ponerlas a 37 durante 30 minutos. Así que lo vapeo con 500 microlitros del medio SOC y lo pongo en las bacterias y las pongo en mi pequeña cámara improvisada.

Entonces, si va a usar tubos eend y una cámara improvisada para su incubadora, asegúrese de poner sus tubos eend horizontales porque se agitarán mucho mejor así. Así que ahora estamos listos para poner los tubos en el agitador. Por eso tenemos esta pequeña cámara a 37 grados durante 30 minutos.

Así que ahora hemos terminado la incubación a 37 grados y vamos a colocar las bacterias en libras más antibióticos. Así que en mi caso es el cloral. Así que a 50 microlitros de cada muestra y ponerlo en el plato.

Entonces, con los 500 microlitros restantes, los giras en una pequeña mesa, algunos desechan para pelar las bacterias. Así que después de la ificación obtenemos un buen pellet y lo que vamos a hacer ahora es eliminar casi todos los medios SOC, solo dejamos 50 microlitros y luego podemos colocar estos 50 microlitros de bacterias concentradas. Así que pagué aproximadamente 450 microlitros.

Solo dejo esto mucho. Así que ahora voy a suspender el palet en los 50 microlitros que quedan de los medios SOC. Y después de eso, puedo colocar estos 50 microlitros en otro plato.

Así que me resisto a cada palet, luego lo hago y lo emplata. Por lo tanto, habrá al final dos placas por muestra. Así que ahora tenemos que esparcir las bacterias en la placa LB.

Así que voy a usar algunas cuentas de vidrio de autoclave, pero también puedes usar una tubería más allá de la que le das forma de esparcidor así. Así que voy a poner algunas cuentas en la placa de Petri. Me gusta.

Bueno, 10 15. Entonces, después de agregar las cuentas, coloca todos sus platos en una pila como esa y los agita suavemente para que las cuentas esparzan las bacterias por todas partes de manera uniforme en los platos. Así que mientras muevo los platos hasta que estén secos.

Por lo tanto, lo que significa que no deberías ver grandes rayas de líquido cuando te muevas con las cuentas. Por ejemplo, en ese plato, las cuentas tienden a colapsar juntas y ver muchas rayas. Es el sudor ese, las cuentas se mueven libremente, ese es seco.

Así que ahora los platos están secos para que podamos desechar las cuentas. Así que me pongo así para que puedas reciclarlos. Así que ahora vamos a poner la placa en la incubadora a 37 durante la noche, y pones las placas boca abajo después de 12 horas de incubación a 37, sacamos la placa de la incubadora.

Y como podemos ver, tenemos menos colonias en el plato donde lo coloco 50 microlitros que en el plato donde emplaté el resto. Lo importante a la hora de transformar las bacterias es tener la cantidad adecuada de colonias en el plato, la densidad adecuada. Así que en este lugar tienes muy pocas colonias, pero si quieres más colonias, puedes tener el buen ejemplo en esta placa donde es exactamente la densidad correcta, aproximadamente 100 colonias por placa.

Este plato es un mal ejemplo porque hay demasiadas colonias y no se pueden elegir colonias individuales. Así que les acabo de mostrar cómo transformar la E. coli con cada transformación. Así que el aspecto muy importante de esta técnica es mantener todo o hielo frío antes del choque.

Luego 45 segundos normal, más a 42 grados de vuelta en el hielo. Y luego todo lo demás tiene que estar a una temperatura cálida o 37 grados. Así que ahora voy a examinar mis colonias mediante PCR.

Así que uno de los puntos también es tener dos platos. Entonces, primero, esperamos tener muchas colonias y esas menos colonias. Y lo importante es tener tus platos muy secos con el uso de cuentas o el paso de la pipa.

Gracias por mirar y buena suerte con tu confirmación.