Name: Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a inferir el tropismo del VIH-1 mediante secuenciación poblacional de la región V3 del gen env. Este método utiliza RT-PCR anidada y bioinformática para clasificar el virus como R5 o no R5 de forma rápida y económica.

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El desarrollo de este ensayo fue financiado por Viiv Salud y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) ya través de una Cátedra GlaxoSmithKline / CIHR en Virología Clínica del Dr. Harrigan. El apoyo prestado por Pfizer y Salud ViiV.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan tiene conflictos de interés con ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, y Quest. Este vídeo-artículo es patrocinado por ViiV Healthcare.

El método presentado aquí es un método de secuenciación estándar se aplica a las pruebas de tropismo. La aplicación clínica de lazo V3 del VIH sobre la secuencia de predecir el tropismo viral ha sido hasta finales limitada. Este método se ha demostrado, en análisis retrospectivos de la maraviroc (ViiV Healthcare) los ensayos clínicos, para ser como mínimo igual de capaces de predecir el tropismo viral en comparación con otros ensayos validados utilizado clínicamente. Hay muchos beneficios de llevar a cabo el análisis genotípico de la V3 para la predicción de tropismo. En primer lugar, este procedimiento se puede realizar en cualquier instalación con un equipo de secuenciación de funcionamiento, aumentando la accesibilidad y la reducción del tiempo de respuesta de las pruebas de tropismo. En comparación, las características fenotípicas de ensayo mejorado Trofile Sensibilidad (ESTA) (Monogram Biosciences), que ha servido como el estándar de oro para las pruebas de tropismo, se lleva a cabo en un centro en el sur de California. Los beneficios adicionales incluyen la exigencia de menos material de partida y un mínimo de carga viral en plasma requiere de 500copies/mL. Además, los costes operativos de la ejecución del ensayo genotípico son relativamente bajos en comparación con los de un ensayo fenotípico. El uso del software de recordar en particular elimina la necesidad de revisar la secuencia manual, que tiende a ser una parte de mano de obra de los análisis de genotipo. El método presentado aquí es bastante sencillo, sin otro paso en particular prevalezca en importancia. Sugerimos funcionando PCR y secuenciación por triplicado para aumentar las probabilidades de las especies de la captura de las minorías dentro de la población viral de una muestra. Réplicas de más de tres se pueden realizar, sin embargo hemos encontrado triplica a ser eficiente y confiable. También se sugiere el uso de un paso de la transcriptasa inversa PCR Kit (Qiagen), que realiza tanto la RT-PCR y PCR en primera ronda en la misma reacción, manteniendo una alta sensibilidad y especificidad.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Extracción de ARN utilizando NucliSens easyMAG versión 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG, sílice magnética</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0,6 ml)</td></tr><tr><td>Tampón de lisis NucliSens easyMAG</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>Tampón de extracción 1 NucliSens easyMAG</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>Tampón de extracción 2 NucliSens easyMAG</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>Tampón de extracción 3 NucliSens easyMAG</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG versión 1.0</td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de seguridad biológica clase II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RT-PCR en un solo paso y PCR de segunda ronda&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>Sistema SuperScript III One-Step RT-PCR con Platinum Taq de alta fidelidad</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>Componentes del kit utilizados:&lt;br/&gt;- Mezcla de enzimas SuperScript III RT/Platinum Taq de alta fidelidad&lt;br/&gt;- Mezcla de reacción 2X (un tampón que contiene 0,4 mM de cada dNTP, 2,4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Sistema Expand High Fidelity PCR</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>Componentes del kit utilizados:- Tampón Expand High Fidelity 10X concentrado con 15 mM MgCl2 (tapas etiquetadas como 2)- Mezcla de enzimas Expand HF PCR (3,5 U/&amp;#x03BC;l)- Solución stock de MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM) (tapas etiquetadas como 4)</td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol azul, sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de cresol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>grado indicador</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electroforesis en gel&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón TAE 50X</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml)</td></tr><tr><td>Tinción SYBR Safe para geles de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (ultrapura)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Escala cuantitativa de ADN E-Gel Low Range</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Agua grado reactivo tipo II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato para electroforesis en gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secuenciación&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit ABI PRISM BigDye Terminator para secuenciación por ciclo</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25000 reacciones)</td></tr><tr><td>Formamida Hi-Di</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0,5 M, pH = 8,0</td></tr><tr><td>Solución tampón TRIZMA clorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9,0</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Etileno al 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de corrida (10X) con EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polímero Pop-7 (25 mL) o Polímero Pop-7 (10 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 o cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>Kit estándar 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 para secuenciación</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga con portaplacas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizador de ADN 3730xl</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inferencia genotípica del vih-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Antecedentes: Antes de recibir un medicamento de la clase antagonista CCR5 en la terapia del VIH, el paciente debe someterse a una prueba de tropismo del VIH para confirmar que la población de su virus utiliza el correceptor CCR5 para entrar celulares, y no un correceptor alternativo. Una aproximación a las pruebas de tropismo es examinar la secuencia de la región V3 de la envoltura del VIH, que interactúa con el co-receptor. Métodos: El ARN viral se extrae del plasma sanguíneo. La región V3 es amplificado por triplicado con anidado de la transcriptasa inversa-PCR. Las amplificaciones son luego secuenciados y analizados utilizando el software, RE_Call. Las secuencias son sometidas a un algoritmo de bioinformática, como geno2pheno inferir tropismo viral de la región V3. Las secuencias se infiere que no R5 si su geno2pheno tasa de falsos positivos es inferior 5,75%. Si cualquiera de las tres secuencias de una muestra se infiere que no-R5, el paciente no responde a un antagonista CCR5.

Tropismo del VIH se puede deducir de la región V3 de la envoltura viral. V3 es amplificada por PCR en triplicado, utilizando RT-PCR, secuencia, e interpretados mediante el software bioinformático. Las muestras con con la secuencia de 1 o más (s) con calificaciones bajas G2P son clasificados como no-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Antecedentes: Antes de recibir un fármaco de la clase de antagonistas del CCR5 en la terapia contra el VIH, el paciente debe someterse a una prueba de tropismo del VIH para confirmar que su ...

El objetivo general de este procedimiento es inferir la tropismo viral en un paciente infectado con VIH mediante la secuenciación de la región V tres del gen del envoltorio viral, para lo cual se comienza por extraer el ARN del VIH del plasma sanguíneo del paciente. A continuación, se amplifica la región V tres del GP uno 20 del VIH utilizando RT-PCR anidada. Luego, se identifica la presencia del producto mediante electroforesis en gel, seguido de la secuenciación basada en población de los productos V tres amplificados.Finalmente, analice las secuencias utilizando software de llamado de bases e infiera el uso de co-receptores mediante el algoritmo de genoma a fenotipo. En última instancia, estos resultados pueden mostrar si la tropismo viral de un paciente es R5 o no R5 mediante la secuenciación basada en población del bucle V3 del VIH. Por lo tanto, la ventaja principal de esta técnica de ensayo de tropismo frente a métodos existentes, como los ensayos fenotípicos basados en células, es que puede realizarse en cualquier laboratorio equipado con aparatos de secuenciación, con menor costo, en menos tiempo y con menor cantidad de material inicial.Esta técnica es relevante para el tratamiento con terapia antirretroviral porque puede determinar si la población viral de un paciente probablemente responderá a un antagonista de CCR cinco. A partir de 500 microlitros de plasma, utilice un extractor automatizado Easy Mag para extraer el ARN del VIH. A continuación, trasládese a una sala limpia para PCR para preparar la RT-PCR, con el fin de garantizar un muestreo adecuado de la población viral.Planifique realizar cada reacción de transcripción inversa por triplicado en esta reacción de un solo paso. Utilice ARN viral para sintetizar ADNc, amplificando específicamente la región tres de HIVV con SQV tres F1 y CO 6 0 2 prime repair. Según los componentes por reacción.Prepare una solución stock suficiente para el número de muestras que se van a amplificar utilizando una pipeta repetidora. Añada 36 microlitros de la mezcla de muestra a cada pocillo de la placa de PCR. Ahora cambie a una pipeta multicanal para transferir microlitros del extracto de la muestra de ARN a cada uno de los pocillos designados. Tenga cuidado de cambiar las puntas entre cada adición.Una vez completada la transferencia, cubra los pocillos con tapas de tira para PCR. Luego coloque la placa de PCR en un termociclador programado para una reacción de RT-PCR en un solo paso de la región tres del VIH. Para la PCR anidada, utilice el par de cebadores SQV tres F dos y reparación del cebador CD cuatro R.Calcule la cantidad de reactivo necesaria para el número de muestras que se amplificarán en una sala limpia de PCR. Prepare la mezcla de PCR anidada y luego utilice una pipeta repetidora para aliquotar 19 microlitros por pocillo en una placa de PCR limpia. Tras completar la R-T-P-C-R, trasládese a una sala de postamplificación.Utilice una pipeta multicanal de ocho canales para transferir un microlitro de la plantilla de R-T-P-C-R a la mezcla de PCR anidada. Cambie las puntas entre cada adición. Cubra los pocillos con tapas en tira para PCR y transfiera la placa a un termociclador para la amplificación.Retire la placa del termociclador después de que la temperatura haya regresado a 25 grados Celsius. Para confirmar que la región V tres se ha amplificado con éxito, analice primero los productos mediante electroforesis en gel. Prepare un gel de AROS al 1.6 % con tinción segura para el gel cyber.Utilizando una pipeta multicanal de 10 microlitros, transfiera ocho microlitros de muestras de PCR a los pozos respectivos. También cargue un marcador de ADN en al menos un pozo por fila.Corra el gel a aproximadamente 100 voltios durante 10 minutos. Visualice las bandas mediante fluorescencia ultravioleta y documente la imagen por fotografía. Registre los ejemplares en los que las tres amplificaciones por triplicado fueron exitosas.Si es necesario, repita la R-T-P-C-R para aquellas muestras con menos de tres amplificaciones del producto. Las muestras amplificadas de ADNc viral se verifican además mediante reacciones de secuenciación de ADN que se realizarán utilizando los cebadores V 3 0 2 F y S QV tres R uno. Retire el reactivo grande di del congelador y deshiélelo a temperatura ambiente.Calcule y prepare los reactivos necesarios para el número de muestras que se van a analizar. Aliquote cinco microlitros de la mezcla de reacción de secuenciación en los pozos adecuados de la placa utilizando una pipeta multicanal. Cubra la placa con una toalla Kim y déjela aparte.Mientras tanto, prepare una dilución de uno a 15 del producto PCR amplificado añadiendo 180 microlitros de agua estéril al producto PCR restante. Pipetee un microlitro de la muestra diluida hasta el fondo de la placa adecuada. Cambie siempre las puntas entre muestras cuando la transferencia de la muestra esté completa.Selle la placa con tapas en tira y vortexee durante un segundo. Para centrifugar la placa, ajuste la velocidad a 140 5G. Cuando la velocidad de giro alcance 140 5G, detenga la centrifugación.Coloque la placa en un termociclador para que la reacción transcurra. En cada pocillo, precipite el ADN con cuatro microlitros de acetato de sodio 3 M y 40 microlitros de etanol al 95 % frío, y vuelva a sellar las tapas. Centrifugue la placa durante 10 segundos y golpee suavemente la placa para desprender cualquier burbuja de aire.Coloque las placas a menos 20 grados Celsius durante un período comprendido entre 30 minutos y dos horas. Recupere el ADN mediante centrifugación a 2000 G durante 20 minutos. Retire y deseche las tapas de tira.Dar la vuelta a la placa sobre el recipiente de desecho y verter el sobrenadante. Eliminar cualquier sobrenadante restante presionando suavemente las placas invertidas sobre una toalla de papel.Doble dos hojas de papel absorbente para colocar la placa entre ellas. Coloque la placa boca abajo en la centrífuga y gire a 140 5G. Detenga la centrifugación cuando alcance 140 5G.Luego, lave con 155 microlitros de etanol al 95% y vierta el sobrenadante. A continuación, repita la centrifugación. Deje la placa reposar durante dos a cinco minutos para permitir que el etanol residual se evapore completamente.Para desnaturalizar las muestras de ADN, utilice una pipeta multicanal para distribuir 10 microlitros de colorante alto para maide en todos los pocillos de la placa, incluidos los que están vacíos. Selle la placa con una septima y colóquela en un termociclador a 90 grados Celsius durante dos minutos. Finalmente, coloque la placa de muestras en una placa de secuenciación y luego en el secuenciador.Una ruta aceptable para el análisis de datos es el uso del software Recall para realizar la llamada automática de bases sin intervención humana. Recall es un software gratuito basado en personalización; inicie sesión y seleccione los archivos de muestra para cargar mediante la opción de exploración. Localice el archivo de datos de secuenciación en bruto y cárguelo, hasta un máximo de 20 megabytes.A continuación, establezca la secuencia de referencia en V tres. Haga clic en procesar datos. Seleccione la carpeta resultante en el lado derecho de la página para mostrar la lista de muestras.Los que son rojos han fallado. Los que son verdes han aprobado. Al hacer clic en una muestra específica y en el botón de vista, puede revisar la secuencia, seguir las instrucciones del lado derecho de la página para navegar a través de la secuencia y descargar archivos en una carpeta comprimida en formato zip.El tropismo viral se puede inferir a partir de secuencias generadas mediante secuenciación basada en poblaciones, utilizando el algoritmo genotipo a fenotipo del coreceptor. En el menú desplegable de la configuración significativa, seleccione la opción optimizada según el análisis de datos clínicos de motivate al 2% y 5,75% FPR. Ahora, elija cargar o pegar una secuencia para su análisis.Se aceptan archivos FASTA. No agregue otros procedimientos para obtener un predictor genotípico FPRA de la respuesta a antagonistas de CCR cinco. El informe G dos P generado proporciona la secuencia del bucle V tres en aminoácidos e indica las posiciones relevantes de las mutaciones asociadas con virus no R cinco.En la parte inferior del informe, se proporciona la tasa de falsos positivos y se interpreta en términos de respuesta a un antagonista de CCR5. Este informe puede descargarse como un archivo PDF. Si se infiere que cualquiera de las tres secuencias de una muestra no es R5, es poco probable que el paciente responda a un antagonista de CCR5 según lo esperado. La electroforesis en gel de las amplificaciones por RTP-PCR del bucle V3 del VIH-1 indica que no todas las muestras clínicas producen un producto.Las secuencias generadas a partir de las muestras amplificadas pueden visualizarse en un cromatograma leído mediante recuperación. Se espera una secuencia limpia con pocas mezclas. Ocasionalmente, las secuencias pueden ser confusas y no adecuadas para la asignación precisa de bases.Algunos pacientes pueden identificarse como portadores de virus que no utilizan CCR5, como se muestra aquí. Es poco probable que estos pacientes respondan al tratamiento con un antagonista de CCR5. Sin embargo, la mayoría de los pacientes presentan una población viral compuesta por virus que utilizan CCR5, como indica el cuadro verde en la parte inferior del informe de análisis G2P.Así, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro días de principio a fin, desde la extracción hasta el análisis. Después de ver este video, deberían tener una buena comprensión de cómo predecir el tropismo viral utilizando métodos de secuenciación basados en poblaciones junto con el algoritmo bioinformático genome pheno.Muy bien, eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.

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