Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

El objetivo general de este procedimiento es inferir el tropismo viral en un paciente infectado por el VIH mediante la secuenciación de la región V tres del gen de la envoltura viral para comenzar a extraer H-I-V-R-N-A del plasma sanguíneo del paciente. A continuación, amplifique la región V tres del VIH GP one 20 utilizando R-T-P-C-R anidado. A continuación, identifique la presencia del producto mediante electroforesis en gel, seguida de una secuenciación basada en la población de los productos V tres amplificados.

Finalmente, analice las secuencias utilizando el software de llamada base e infiera el uso de co-receptores utilizando el algoritmo de genoma a feno. En última instancia, estos resultados pueden mostrar si la tropa viral de un paciente es R cinco o no R cinco a través de la secuenciación poblacional del bucle 3 del VIHV. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es un ensayo de tropa sobre los métodos existentes, como los ensayos fenotípicos basados en células, es que se puede realizar en cualquier laboratorio equipado con aparatos de secuenciación para reducir el costo, en menos tiempo y con menos material de partida.

Esta técnica es relevante para el tratamiento con terapia antirretroviral porque puede identificar si es probable que la población viral de un paciente responda a un antagonista de CCR cinco a partir de 500 microlitros de plasma. Utilice un extractor automatizado de cargadores fáciles para extraer H-I-V-R-N-A. Ahora pase a una sala limpia de PCR para configurar el R-T-P-C-R con el fin de garantizar un muestreo adecuado de la población viral.

Planifique realizar cada reacción de transcripción inversa por triplicado en esta reacción de un solo paso. Utilice el ARN viral para sintetizar CDNA, amplificando específicamente la región tres del VIH con la reparación principal de SQV tres F1 y CO 6 0 2. Basado en componentes por reacción.

Prepare una solución de mezcla madre suficiente para el número de muestras que se van a amplificar con una pipeta repetidora Añada 36 microlitros de mezcla de muestra a cada pocillo de la placa de PCR. Ahora cambie a una pipeta multicanal para transformar los microlitros de extracto de muestra de ARN en cada uno de los pocillos designados. Tenga cuidado de cambiar las puntas entre cada adición.

Una vez completada la transferencia, cubra los pocillos con tapas de tiras de PCR. A continuación, coloque la placa de PCR en un termociclador programado para un R-T-P-C-R de un paso de la región tres del VIH. Para la PCR anidada, utilice la reparación de cebadores SQV three F two y CD four R.

Calcule la cantidad de reactivo necesaria para el número de muestras que se van a amplificar en una sala limpia de PCR. Genere la mezcla de PCR anidada y, a continuación, utilice una pipeta repetidora para obtener alícuotas de 19 microlitros por pocillo de una placa de PCR limpia. Al finalizar el R-T-P-C-R, muévase a una sala de postamplificación.

Utilice una pipeta multicanal de ocho canales para transferir un microlitro de la plantilla R-T-P-C-R a la mezcla de PCR anidada. Cambia las propinas entre cada adición. Cubra los pocillos con tapas de tiras de PCR y transfiera la placa a un termociclador para su amplificación.

Retire la placa del termociclador después de que la temperatura haya vuelto a 25 grados centígrados. Para confirmar que la región V tres se ha amplificado con éxito, primero analice los productos mediante electroforesis en gel. Prepara un gel 1.6%AROS con tinte de gel ciberseguro.

Utilizando una pipeta multicanal de 10 microlitros. Transfiera ocho muestras de PCR de microlitros a los pocillos respectivos. También cargue una escalera de ADN en al menos un pocillo por fila.

Deje correr el gel a unos 100 voltios durante 10 minutos. Visualice bandas por fluorescencia ultravioleta y documente la imagen mediante fotografía. Tome nota de las muestras en las que todas las amplificaciones por triplicado se realizaron correctamente.

Si es necesario, repita R-T-P-C-R para aquellas muestras con menos de tres amplificaciones de producto. Las muestras de CDNA viral amplificadas se verifican posteriormente mediante secuenciación de ADN, las reacciones se realizarán utilizando los cebadores V, 3, 0, 2, F y S, QV, tres R one. Retire el reactivo di grande del congelador y descongele a temperatura ambiente.

Calcular y preparar los reactivos necesarios para el número de muestras que se van a analizar. Alícuota de cinco microlitros de mezcla de reacción de secuenciación en los pocillos de placa apropiados utilizando una pipeta multicanal. Cubre el plato con una toallita Kim y déjalo a un lado.

Mientras tanto, prepare una dilución de uno a 15 del producto de PCR amplificado agregando 180 microlitros de agua estéril al producto de PCR restante. Pipetear un microlitro de la muestra diluida en el fondo de la placa correspondiente. Los pocillos siempre cambian las puntas entre muestras cuando se completa la transferencia de muestras.

Selle la placa con tapas de tiras y vórtice durante un segundo. Para centrifugar la placa, ajuste la velocidad a 140 5G. Cuando la velocidad de centrifugado alcance 140 5G, detenga el centrifugado.

Coloque la placa en un termociclador para que continúe la reacción. En cada pocillo precipite el ADN con cuatro microlitros de acetato de sodio tres molares y 40 microlitros de etanol al 95% refrigerado, vuelva a sellar las tapas. Corta la placa durante 10 segundos y golpea la placa para desalojar las burbujas de aire.

Coloque los platos a menos 20 grados centígrados durante entre 30 minutos y dos horas. Recuperar el ADN por centrifugación a 2000 G durante 20 minutos. Retire y deseche las tapas de las tiras.

Invierta el plato sobre el contenedor de residuos y decante la supernatina. Deshazte de cualquier resto de supernatina. Secando los platos invertidos sobre una toalla de papel.

Dobla dos hojas de una toalla de papel para hacer un sándwich en el plato. Coloque la placa boca abajo en la centrífuga y gire a 140 5G. Deteniendo el giro cuando llega a 140 5G.

A continuación, lavar con 155 microlitros de etanol al 95% y decantar. A continuación, repita la centrifugación. Deje reposar la placa de dos a cinco minutos para permitir que se evapore el último etanol.

Para desnaturalizar las muestras de ADN, utilice una pipeta multicanal para distribuir 10 microlitros de alto tinte para la doncella en todos los pocillos de la placa, incluidos los que están vacíos. Selle la placa con una séptima y colóquela en un termociclador a 90 grados centígrados durante dos minutos. Finalmente, coloque la placa de muestra en una placa de secuenciación y en el secuenciador.

Una ruta aceptable para el análisis de datos es el uso de la recuperación de software para realizar llamadas base automáticas sin intervención humana. Recall es un software de llamadas gratuito y personalizado, inicie sesión y seleccione archivos de muestra para cargar con la opción de exploración. Localice el archivo de datos de secuenciación sin procesar y cargue hasta 20 megabytes.

A continuación, establezca la secuencia de referencia en V tres. Haga clic en procesar datos. Seleccione la carpeta resultante en el lado derecho de la página para mostrar la lista de ejemplos.

Los que son rojos han fracasado. Los que son verdes ya pasaron. Al hacer clic en una muestra específica y en el botón de visualización, puede revisar la secuencia, seguir las instrucciones en el lado derecho de la página para navegar por la secuencia, descargar archivos en una carpeta zip.

El tropismo viral se puede inferir a partir de secuencias generadas por secuenciación basada en la población utilizando el algoritmo de correceptor de geno a feno. En el menú desplegable de la configuración significativa, seleccione la optimizada basada en el análisis de datos clínicos de motivar 2% y 5.75%FPR. Ahora elija cargar o pegar una secuencia para su análisis.

Los archivos FASTA son aceptables. No agregue otros procedimientos para obtener un geno Tono FPRA predictor de respuesta a cinco antagonistas de CCR. El informe G two P generado proporciona la secuencia de V tres bucles en aminoácidos e indica las posiciones relevantes de las mutaciones asociadas con el virus que no es R cinco.

Al final del informe, se da la tasa de falsos positivos y se interpreta en términos de respuesta a un antagonista de CCR cinco. Este informe se puede descargar como archivo PDF. Si se infiere que alguna de las tres secuencias de una muestra no es R cinco, no es probable que el paciente responda a un antagonista de CCR cinco como se espera electroforesis en gel de RTP CR Las amplificaciones del bucle VIH uno V tres indican que no todas las muestras clínicas producen un producto.

Las secuencias generadas a partir de las muestras amplificadas se pueden visualizar en un cromatograma leído por memoria. Se espera una secuencia limpia con pocas mezclas. Ocasionalmente, las secuencias pueden ser desordenadas y no susceptibles de una asignación de base precisa.

Algunos pacientes pueden ser identificados como no CCR cinco usando el virus, como se muestra aquí. Es poco probable que estos pacientes respondan al tratamiento con un antagonista de CCR cinco. Sin embargo, se encuentra que la mayoría de los pacientes tienen una población viral compuesta por CCR cinco que usan el virus, como lo indica un cuadro verde en la parte inferior del informe de análisis G two P.

Por lo tanto, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro días de principio a fin. Eso es desde la extracción hasta el análisis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo predecir el tropismo viral utilizando métodos de secuenciación basados en poblaciones junto con el algoritmo bioinformático del fenoma del genoma.

Muy bien, eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.