Name: Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a administrar anticuerpos monoclonales pasivamente contra Histoplasma capsulatum en ratones C57BL/6 para evaluar la eficacia protectora y estudiar la inmunidad humoral en la histoplasmosis.

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1. El crecimiento de H. Capsulatum <ol><li> Prepare un gabinete de bioseguridad para el trabajo con el hongo por la limpieza de la caja con lejía al 10% seguido por la radiación UV 20 min. H. capsulatum en la fase de levadura requiere de bioseguridad de nivel (BSL) prácticas II, mientras que la forma del molde requiere BSLIII. Utilizar el formulario de la levadura en los siguientes pasos. </li><li> A continuación preparar un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de PBS. Cosecha de una colonia de H. capsulatum (cepa ATCC G217B Hc) de una placa de agar sangre BHI [glucosa de 10 g / L, cisteína 0,1 g / L, penicilina-estreptomicina al 1% y las ovejas glóbulos rojos 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, EE.UU.) ] cultivadas a 37 ° C o tomar una alícuota de las existencias de levadura congelado a -80 ° C y añadir a la PBS. Vortex las células vigorosamente y se centrifuga durante 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el precipitado y agregar 10 ml de PBS. Repita este procedimiento tres veces. Suspender las células en 5 ml de PBS y traslado a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Para interrumpir células agregadas, pasar la suspensión de células de levadura a través de un G1 26 / 2 agujas u cantar una jeringa de 10 ml 5 veces en un gabinete de bioseguridad (uso de protección facial). Para aislar levaduras pequeñas, de tamaño uniforme, centrifugar las células a 55 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego retirar la parte superior de 1 ml. </li><li> Añadir la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer estéril que contiene 100 ml de medio HAM F12 (GIBCO) suplementado con 16 g / L de glucosa, 1 g / L de ácido glutámico, cistina 8.4mg / L, 6 g / L de ácido glutámico y luego crecer a las células a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora con agitación 150 rpm. </li></ol> 2. Hibridoma de crecimiento y purificación de anticuerpos monoclonales <ol><li> La transferencia de los hibridomas seleccionados a medio DMEM con 10% de suero fetal bovino, 10% NCTC, el 1% no aminoácidos esenciales y 1% de penicilina-estreptomicina. Crecer las células en un frasco de cultivo celular (Becton Dickenson) durante 5-7 días a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Centrifugar el medio a 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente y recoger todas las sobrenadante sin perturbar las pastillas. </li><li> A continuación, purificar el sobrenadante libre de células con una proteína de una resina / G por FPLC. </li><li> La concentración de AcM se puede calcular mediante un ELISA de captura (1) con un control de isotipo IgG de serie (fig. 1B). </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Preparación del inóculo <ol><li> Tome un 48 h Histoplasma capsulatum (cepa ATCC Hc G217B) cultivo en fase de levadura cultivada en HAM F-12 medianas. </li><li> Centrifugar las células a 1100 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y añadir PBS. </li><li> Repita el procedimiento 3.2 3 veces. </li><li> Pase la suspensión de células de levadura 5 veces a través de una aguja 26G1 / 2 con una jeringa. </li><li> Centrifugar la suspensión a 55 g durante 1 min a grupos pellet de células residuales. Transferir el sobrenadante que contiene la única suspensión de células a un tubo nuevo. </li><li> Enumerar la única suspensión de células con un hematocitómetro. </li><li> Ajustar la concentración de células a fin de alcanzar 1,25 x 10 7 levadura (supervivencia) o 5,0 x 10 6 (CFU, citoquinas y la histología) en una suspención de &lt;50 l (Figura 2). </li></ol> 4. La administración intraperitoneal de los anticuerpos monoclonales <ol><li> Levante el ratón por la cola y la piel del cuello (Fig. 3A). Inmovilizar el ratón por la piel de su cuello, cerca de theears como sea posible (asegúrese de tomar suficiente piel para que el ratón cannotturn su cabeza para morder la persona encargada de ella, la figura 3B y 3C). </li><li> Estabilizar el dedo conel colita presiona suavemente contra la palma de la mano (Figura 3D). </li><li> Limpie el área de la inyección con etanol al 70% antes de colocar la aguja y aspirar a buscar la sangre antes de la inyección. </li><li> Utilice el 26G1 / 2 a piercethe piel y abdominalmuscles para inyectar la solución que contiene 500μg MAB (PBS, control de isotipo de anticuerpos o el MAB de la prueba, diluido en 1 ml de PBS) en la izquierda thelower o en el cuadrante inferior derecho del abdomen (la cavidad intraperitoneal), con el animal en la posición cabeza abajo, teniendo cuidado de evitar los órganos andother membrana interna (Figura 3E). </li><li> Espere un momento antes de retirar el needleto reducir la probabilidad de fuga. </li><li> Espere un mínimo de dos horas antes de proceder al siguiente paso. </li></ol> 5. Anestesia del ratón y las infecciones intranasales <ol><li> Prepare la anestesia con ketamina y xilazina a 100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente. Realizar la administración intraperitoneal de PBS, control de isotipo de anticuerpos, o un anticuerpo experimental como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña. Espere dos horas después de la inyección antes de anestesiar el AcM de ratón y de proceder a la infección intranasal. Prepare la anestesia con ketamina y xilazina con dosis de 100 mg / kg y 10 mg / Kg, respectivamente (7). </li><li> Durante el período de 2 horas de espera, preparar el inóculo capsulum Histoplasma como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña. </li><li> Proceder de acuerdo a la itens 5,1 a 5,5. Toe pellizco a los animales con una pinza y para verificar la ausencia de reflejos y confirman que la anestesia trabajado. Después de anestesiarlo, suspender suavemente el ratón por sus dientes frente a un nylon o hilo de algodón. Use 2 soportes de columna para atar las cuerdas con el fin de suspender los animales. </li><li> Poco a poco la administración de aproximadamente 50 l de inóculo en un orificio nasal utilizando una micropipeta, mientras que la tasa de cerca del ratón respiración. Deje que el ratón para descansar en esta posición durante 2-5 minutos después de la infección intranasal para facilitar la deposición de las levaduras en los pulmones de los animales (Figura 3F). </li><li> Después de que el ratón ha sido infectado, mantener el ratón en un ambiente controlado y cálido (temperatura entre 25 y 37 ° C), con cuidado utilizando una lámpara de calor si es necesario, hasta que se recupere de la anestesia. Cuando se despierta el ratón, volver a una jaula limpia con acceso ad libitum al alimento y agua. Las jaulas son devueltos a nuestras instalaciones y animales mantenidos en un cuarto animal limpio (BLSI). </li></ol> 6. Los estudios de supervivencia <ol><li> Evaluar los animales infectados y se burlan de infectados clínicamente para la taquipnea, letargia, embotamiento y pérdida de peso. Los animales se debe comprobar dos veces al día por los miembros del laboratorio y todos los días por los cuidadores de animales. </li><li> Con histoplasmosis murino, hasta cerca del final de la vida, generalmente no hay signos evidentes de la infección, excepto un leve aumento en la tasa de respiración. Con enfermedad avanzada, lo que suele ocurrir 10 a 11 días, los ratones se taquipnea y significativamente disminuidos de actividad. Típicamente se convierten rápidamente en moribundo y expirar. </li><li> Lamentando los animales deben ser sacrificados adecuadamente con CO 2 en una cámara dedicada, animales muertos deben ser enumerados todos los días. </li></ol> 7. Estudios UFC, Histología y citoquinas Estudios <ol><li> Prepare 15 ml tubos cónicos de 10 ml con PBS para cada órgano para ser recogidos. </li><li> La eutanasia a los animales 7 y 14 días después de la infección con un inuculum subletal (5,0 x 10 6) como se ha demostrado y extirpar el pulmón, el bazo y el hígado de inmediato. </li><li> Extraer un pedazo de órgano para ser evaluados y realizar la fijación en formol durante la noche. Las secciones se examinan bajo el microscopio para su evaluación patológica. </li><li> Prepare 50 ml tubos cónicos con 5 ml de PBS encabezó con 70 filtros de células micras para cada órgano para ser homogeneizada. Macerar cada porción restante de los órganos por separado en el uso de tubos de 50 ml estéril émbolos de la jeringa de 5 ml. </li><li> A continuación, en serie diluida homogeneizados de órganos (1:100, 1:1000 y 1:5000) y 100μL placa de cada dilución en placas de agar BHI-sangre (2). </li><li> Añadir tabletas inhibidor de la proteasa a los homogeneizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania). </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante un máximo de 14 días y UFC enumerar. </li><li> Centrifugar los homogeneizados de órganos en 4000xg durante 10 minutos y retirar sobrenadantes de órganos, Whish se utilizará en uso en los ensayos de citoquinas a cabo por métodos estándar de acuerdo con el fabricante. </li></ol> 8. Protección de anticuerpo monoclonal contra el H. Capsulatum depende de la especificidad del anticuerpo y del isotipo <ol><li> MAb isotipo es fundamental en la protección contra H. capsulatum, como los ratones tratados con mAb IgG1 o IgG2a de Hsp60 tienen una supervivencia significativamente más prolongada en comparación con el control de los ratones que recibieron un mAb IgG2b de Hsp60 o ya sea un control de isotipo mAb o PBS (Figura 4). </li><li> Además, en los ratones que recibieron los mAbs de protección, se produjo una reducción significativa en el número de UFC pulmonar y del bazo en el día 7 y se reduce de 2 y 2,5 unidades de registro de los números de levaduras en los pulmones a los 14 días (Figura 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Crecimiento de la H. capsulatum y hibridomas. (A) HAM F-12 líquido cultura preparación de una sola colonia obtenida de H. capsulatum crecido en placas de agar sangre BHI. (B) el crecimiento del hibridoma en frascos de cultivo celular y purificación de proteínas por el mAb una resina / G a través de cromatografía de afinidad. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: H. capsulatum preparación del inóculo para la infección por vía intranasal. Suspensión celular obtenida después de H. trastornos agregados capsulatum con una jeringa y la centrifugación se enumera contando en un hemocitómetro. Concentración celular se ajusta a 1,25 x 10 7 (experimentos de supervivencia) o 5 x 10 6 (UFC, citoquinas y la histología) en &lt;50 mL. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/&gt; Figura 3: manejo del ratón durante la administración de MAB. (A) El ratón es recogido por la cola y (B y C) inmovilizada mediante la celebración de la nuca de su cuello lo más cerca posible theears. (D) La cola se lleva a cabo entre el dedo meñique y la palma. (E) La solución AcM se inyecta con una aguja 26G1 / 2. (F) El H. capsulatum inóculo se administra por vía intranasal pipeteando suavemente la suspensión celular en un orificio nasal. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: anticuerpos monoclonales para Hsp60 puede alterar la patogénesis de la histoplasmosis. inyecciones ip con 500 mg de IgG1, IgG2a Acm o 2 h antes de la supervivencia de la infección prolonga significativamente (p &lt;0,05, en comparación con los controles), pero un IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: UFC determinaciones en los pulmones a los 7 y 14 días después de un desafío intranasal subletales con 5x10 6 levaduras Hc de los ratones tratados ip con mAbs seleccionados para Hsp60 o AcMo irrelevante mostraron una reducción en la carga de hongos de IgG1 e IgG2a Acm los animales tratados. Barras de color negro representan UFC en el día 7 y barras blancas 14 días post-infección (* p &lt;0,001 en 7 días y ** p &lt;0,001 a los 14 días post infección).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

El protocolo presentado aquí demuestra que el mAb a H. capsulatum puede modificar el curso de la histoplasmosis experimental murino. Anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular de los patógenos puede modificar la compleja dinámica que se producen durante la interacción entre un huésped y un agente patógeno. Este estudio establece que la protección de los mAbs mediar en un modelo murino de la histoplasmosis letal cuando se inyecta por vía intraperitoneal, y sugiere las proteínas candidata...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del material </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> Cabina de seguridad biológica (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 medianas </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C agitador </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos cónicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 agujas </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 ml jeringa </td><td> BD </td></tr><tr><td> Frascos de 250 ml </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas) del sistema </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Lector de ELISA </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anestesia (ketamina y xilazina) </td><td></td></tr><tr><td> Columna se encuentra </td><td></td></tr><tr><td> Cuerdas de nylon </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara de calor </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de 70μm celular </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> Placas de agar BHI </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra h. capsulatum y otros hongos patógenos

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

El propósito de la utilización de esta metodología es: 1) para avanzar en nuestra capacidad para proteger a las personas con anticuerpos o vacunas para la prevención o el tratamiento de la histoplasmosis causadas por el hongo Histoplasma capsulatum y 2) para examinar el papel de factores de virulencia como blanco para la terapia. Para generar mAbs, los ratones son inmunizados, la respuesta inmune se evaluó a través de una fase sólida del sistema ELISA desarrollado en nuestro laboratorio, y la mejor respuesta ratones se seleccionan para el aislamiento de esplenocitos para la fusión con células de hibridoma. Ratones C57BL / 6 se han utilizado ampliamente para estudiar H. patogénesis capsulatum y el mejor modelo para la obtención de los datos requeridos. Con el fin de evaluar el papel de los mAbs de la infección, los ratones se administraron por vía intraperitoneal, ya sea con mAb a H. capsulatum o isotipo control pareado mAb y luego infectados por cualquiera vía intravenosa (iv), por vía intraperitoneal (ip) o intranasal (in) rutas. En la literatura científica, la eficacia de mAbs de las infecciones por hongos en ratones se basa en la mortalidad como punto final, junto con metformina unidades de colonias (UFC) evaluaciones en momentos anteriores. La supervivencia (tiempo hasta la muerte) son necesarios estudios a medida que mejor representan las enfermedades humanas. Por lo tanto, la eficacia de nuestra intervención no adecuada sería establecer sin curvas de supervivencia. Esto también es válido para establecer la eficacia de la vacuna o prueba de los mutantes de la virulencia. Con histoplasmosis, los ratones a menudo pasan de ser enérgico a los muertos durante varias horas. La capacidad de una intervención como la administración de un mAb inicialmente puede proteger a un animal de la enfermedad, pero la enfermedad recaída puede que no se llevaría a cabo en el corto experimentos UFC. Además de la supervivencia y los ensayos de carga de hongos, se analiza la respuesta inflamatoria a la infección (histología, el reclutamiento celular, las respuestas de citocinas). Para la supervivencia / hora para los experimentos de muerte, los ratones están infectados y controlados por lo menos dos veces al día para detectar signos de morbilidad. Para evaluar la carga de hongos, la histopatología, y las respuestas de citocinas, los ratones son sacrificados en las varias horas después de la infección. Los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto de Estudios Animal de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

Ratones C57BL / 6 se han utilizado para estudiar la patogénesis Hc y el mejor modelo. Estamos explorando los beneficios potenciales de la inmunidad humoral contra este hongo y generó varias Acm [de la histona H2B y 60kDa proteína de choque térmico] que la prueba de su eficacia protectora tras la administración intraperitoneal.

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

El propósito del uso de esta metodología es 1) ampliar nuestra capacidad para proteger a los individuos mediante el uso de anticuerpos o vacunas para prevenir o tratar ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar nuestra capacidad para proteger a las personas mediante anticuerpos o vacunas para prevenir o tratar la histoplasmosis, y examinar el papel de los factores de virulencia en la patogénesis de la enfermedad. Esto se logra primero aislando y caracterizando anticuerpos monoclonales contra antígenos diana. El segundo paso del procedimiento consiste en administrar los anticuerpos monoclonales seleccionados por vía intraperitoneal dos horas antes de la infección intranasal.Para que estas moléculas tengan tiempo de distribuirse por todo el cuerpo, el tercer paso del procedimiento consiste en anestesiar a los ratones e infectarlos por vía intranasal con el inóculo deseado. El paso final del procedimiento es monitorear la salud de los animales. Los animales se sacrifican en diversos intervalos para determinar las cargas fúngicas y evaluar las respuestas inflamatorias, o se mantienen bajo observación para el seguimiento de supervivencia.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una prolongación de la supervivencia y una modificación de las respuestas patológicas en los órganos afectados de ratones infectados letalmente. A través de la administración peritoneal de los anticuerpos monoclonales protectores antes de la infección, el procedimiento será demostrado por Ally Emer, una estudiante posdoctoral con amplia experiencia en patogénesis fúngica y modelos de infección animal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los fármacos antifúngicos es que los anticuerpos monoclonales son moléculas con propiedades específicas que actúan mediante la activación del factor potencial del huésped. La demostración visual de este método es fundamental.La administración de anticuerpos monoclonales y los pasos de infección intranasal son difíciles de aprender porque requieren experiencia en el manejo de los animales. Prepare un gabinete de nivel de bioseguridad dos para trabajar con el hongo en forma de levadura limpiando el gabinete con lejía, seguido de irradiación con UV. Prepare un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de PBS.Recolecte una colonia de H caps AUM a partir de una alícuota del stock, congelada a menos 80 grados Celsius, y añádala al vórtice de PBS. Vortexee vigorosamente las células y centrifugue a 1100 ×g durante 10 minutos. A temperatura ambiente, retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento y agregue al menos 10 mililitros de PBS fresco.Repita este procedimiento tres veces después del lavado final. Resuspenda las células en cinco mililitros de PBS. Todos los lavados deben realizarse a temperatura ambiente. Para desagregar las células, pase las células de levadura a través de una aguja de calibre 26 y media usando una jeringa de 10 mililitros cinco veces, recolectando las células de levadura en un tubo cónico de 50 mililitros.Para aislar levaduras pequeñas y de tamaño uniforme, centrifugue las células a 55 veces G durante un minuto y luego retire el mililitro superior. Añada la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer de vidrio estéril de 250 mililitros que contenga 100 mililitros de medio Ham F-12, y luego cultive las células a 37 grados Celsius durante 48 horas en un incubador con agitación a la concentración ambiente de dióxido de carbono. Este cultivo se utilizará para preparar el inóculo, y se evaluará la eficacia de los anticuerpos monoclonales generados en el siguiente paso.Cultive los hibridomas seleccionados en DMEM después de cinco a siete días. Incube, luego recopile los anticuerpos reuniendo todo el medio del frasco de cultivo celular y centrifugue el medio a 1100 ×g durante 10 minutos. Al igual que con las células de levadura, los anticuerpos pueden lavarse a temperatura ambiente.Recolecte el sobrenadante sin perturbar los sedimentos. A continuación, purifique el sobrenadante libre de células utilizando una resina de proteína AG mediante captura F-P-L-C-A. Se utiliza ELiSA para calcular la concentración de anticuerpo monoclonal y determinar cuánto del anticuerpo purificado debe inyectarse.Realice la administración intraperitoneal de anticuerpo control de isotipo PBS o anticuerpo experimental por vía intraperitoneal según se describe en el protocolo escrito adjunto. Espere dos horas tras la inyección del anticuerpo monoclonal antes de anestesiar al ratón y proceder con la infección intranasal durante el periodo de espera. Prepare el inóculo de Histoplasma capsulatum según se describe en el protocolo escrito adjunto, y monte el dispositivo de cuerda para la infección del ratón atando firmemente una cuerda de nailon o algodón entre dos soportes verticales y luego separando los soportes de modo que la cuerda quede tensa.La anestesia con ketamina a 100 miligramos por kilogramo y xilacina a 10 miligramos por kilogramo. También se puede preparar en este momento, cuando los anticuerpos hayan tenido suficiente tiempo para dispersarse. Anestesie al ratón y confirme la sedación por la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo del pie.Agarre con pinzas. Sujete suavemente al ratón por sus dientes frontales del hilo. Administre lentamente aproximadamente 50 microlitros de inóculo en el aire utilizando una micropipeta.Mientras se monitorea de cerca la frecuencia respiratoria del ratón, permita que el animal descanse en esta posición durante dos a cinco minutos después de la infección intranasal para facilitar la deposición de la levadura en los pulmones del animal tras la infección. Mantenga al ratón en un ambiente cálido y supervisado, utilizando cuidadosamente una lámpara de calor si es necesario, hasta que se recupere de la anestesia.Cuando el ratón despierte, devuélvalo a una jaula limpia. Con acceso ad libitum a alimento y agua, evalúe clínicamente los animales infectados y los controles no infectados. Los miembros del laboratorio deben revisar los animales dos veces al día, y los cuidadores de animales una vez al día, para detectar taquipnea, letargo y pérdida de peso.Con infecciones leves de histoplasmosis, hasta casi el final de la vida, normalmente no hay signos evidentes de la infección más allá de un ligero aumento en la frecuencia respiratoria. Con la enfermedad avanzada, los ratones se vuelven significativamente postrados y presentan actividad reducida. Típicamente, empeoran rápidamente y fallecen.Los animales en estado crítico deben ser sacrificados adecuadamente con dióxido de carbono en una cámara dedicada. La muerte debe confirmarse por ausencia de respuesta refleja al pellizco en los dedos de los pies, y los animales fallecidos deben contarse diariamente.Prepare tubos cónicos de 15 mililitros con 10 mililitros de PBS para cada órgano que se vaya a recoger. Sacrificar los animales infectados con la inócula subletal cinco veces 10 a la sexta. Las células de levadura como se mostró previamente, y extraer inmediatamente los pulmones, bazo e hígado; prepare tubos cónicos de 50 mililitros con cinco mililitros de PBS.Monte una placa de Petri con filtros celulares de 70 micrones para cada órgano que se vaya a homogeneizar. Macece cada órgano por separado con émbolos de cinco mililitros y transfiera a tubos de 50 mililitros. A continuación, diluya seriamente el homogenado del órgano en tres diluciones: uno a 100, uno a 1001 a 5.000, y plaque 100 microlitros en BHI.Incubar las placas de agar sangre a 37 grados Celsius en un incubador con porcentaje normal de dióxido de carbono en el aire durante hasta 14 días y enumerar las UFC del anticuerpo monoclonal. El isotipo es fundamental en la protección frente a hcaps Lotum, ya que los ratones tratados con anticuerpos monoclonales IgG1 o IgG2a dirigidos contra HSP60 presentan una supervivencia significativamente prolongada en comparación con los ratones control que reciben un anticuerpo monoclonal IgG2b dirigido contra HSP60 o un anticuerpo monoclonal de control de isotipo o PS. Además, en los ratones que recibieron anticuerpos monoclonales protectores, se observó una reducción significativa en el número de UFC pulmonares y esplénicas al séptimo día, así como disminuciones de 2 y 2,5 unidades logarítmicas en los números de levaduras en los pulmones al día 14. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la determinación de la carga ugal indicativa de la unidad formadora de colonias, las citoquinas implicadas en la infección y la evaluación de la topología, con el fin de responder preguntas adicionales, como definir el mecanismo de acción de la modificación de la enfermedad por los anticuerpos durante el intento de este procedimiento.Es importante recordar trabajar en condiciones de seguridad biológica al manipular el knock on y actuar de acuerdo con las regulaciones de cuidado animal para las infecciones intranasales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la puntuación de inducción y clínicas de un modelo animal de esclerosis múltiple: las enfermedades crónico-recidivante la encefalomielitis autoinmune experimental en ratas DA. La enfermedad, inducida por la inmunización de ratas con una emulsión que contiene la médula espinal de ratas y toda adyuvante completo de Freund, presenta un cuadro clínico parecido a la enfermedad humana.

La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Preparación de una emulsión antigénica adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Este protocolo describe los pasos para inducir la uveítis micobacteriana preparada (PMU) en ratones. Este método describe los pasos para ayudar a producir una inflamación ocular confiable y robusta en el sistema modelo de ratón. Usando este protocolo, generamos ojos uveíticos y ojos compañeros no inflamados de animales individuales para su posterior evaluación con ensayos inmunológicos, transcriptómicos y proteómicos.

Uveítis micobacteriana (PMU) preparada como modelo para la uveítis postinfecciosa

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Los ratones son generalmente resistentes a las infecciones por Mycobacterium abscessus, lo que complica el descubrimiento y desarrollo de antibióticos muy necesarios contra las infecciones pulmonares. Aquí, describimos un método de preparación de inóculo e infección intratraqueal que demostró producir una infección sostenida en ratones inmunocompetentes.

Preparación de Mycobacterium abscessus incrustado en perlas de agar para inocular ratones inmunocompetentes por vía intratraqueal

Aprende a administrar anticuerpos monoclonales pasivamente contra Histoplasma capsulatum en ratones C57BL/6 para evaluar la eficacia protectora y estudiar la inmunidad humoral en la histoplasmosis.

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

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