Name: Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a expandir y purificar células NK humanas de sangre periférica mediante co-cultivo con células presentadoras de antígeno artificiales e IL-2. Este protocolo permite obtener altos rendimientos de células funcionales para inmunoterapia contra cáncer.

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Los autores desean agradecer a Laurence Cooper, Singh Harjeet y Hurton Lenka por su trabajo en la creación de la primera K562 AAPC y mIL21 vectores de fusión. La financiación de este trabajo fue proporcionado por el Programa de UT MD Anderson Physician científico, la Fundación San Baldrick, y las leyendas de Friendswood.

1. Aislamiento de PBMC de Buffy Coat Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se obtienen por centrifugación densidad de flotación en Ficoll-Paque de las muestras de donantes sanos capa leucocitaria obtenidas por aféresis. <ol><li> La centrifugación de Ficoll-Paque se hace como por el protocolo del fabricante con ligeras modificaciones. </li><li> Añadir PBS a un donante normal de bancos de sangre la capa leucocitaria a un volumen final de 140 ml (volumen típico de la capa leucocitaria es 40-70 mL). </li><li> Capa de 35 ml de muestra de la capa leucocitaria en 15 ml de Ficoll-Paque (4 tubos). </li><li> Centrifugar a 400 g durante 20 minutos sin freno. </li><li> Recuperar los PBMCs de la Ficoll-Paque: interfaz de plasma, no descartan los glóbulos rojos en la parte inferior de la Ficoll-Paque. </li><li> Lave PBMCs tres veces con PBS, centrifugando cada vez a 400 g durante 10 minutos. </li><li> PBMCs se puede utilizar directamente para la expansión de las células NK en esta etapa o células NK pueden ser aislados por RosetteSep (Sección 4) </li><li> PBMCs restantes pueden ser congelados en FBS que contiene DMSO al 10% en nitrógeno líquido. </li><li> Aspirar el Ficoll y recoger los glóbulos rojos a partir del paso 5 en dos tubo de centrífuga de 50 ml, lavar tres veces con PBS (añadido a la marca de 50 ml), cada vez que aspire el sobrenadante rozando la parte superior de la capa de glóbulos rojos para eliminar los granulocitos. </li><li> Los glóbulos rojos pueden ser utilizados inmediatamente para RosetteSep  purificación de las células NK (véase la Sección 4) o almacenado en un volumen igual de solución de Alsever a 4 ° C para su uso posterior (Los glóbulos rojos se puede almacenar por un máximo de 4 semanas). </li></ol> 2. La expansión de células NK La expansión de las células NK puede iniciarse mediante PBMC o células NK purificadas. La cantidad de PBMCs utilizados para la expansión puede variar según la cantidad de las células NK deseado al final de una expansión de tres semanas, consulte al representante de la sección de resultados para más detalles. (Ver Nota 1) ESTIMULACIÓN 1 Día 0 <ol><li> Para cada 5x10 6 PBMCs ser ampliado, cuenta e irradiar 10x10 6 K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy. </li><li> Después de la irradiación, se lavan las células con PBS y resuspender las células NK en la expansión de medios (Nkem). </li><li> Semillas de 5x10 6 PBMC irradiadas con 10x10 6 K562 CL9 mIL21 (1:2) en 40 ml de Nkem en un matraz T75 y colóquelo en una incubadora a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li></ol> Días 3 y 5 <ol start="4"><li> Recuperar las células por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con Nkem fresca (la adición de IL-2 frescas para el volumen de los medios de comunicación todo) y al cultivo. </li></ol> ESTIMULACIÓN 2 Día 7 <ol><li> Cuente el número de células en cultivo al final de una semana. </li><li> Ponga a un lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2) </li><li> Para cada uno de 5x10 6 células se estimularon de nuevo, contar e irradiar 5x10 6 K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy. </li><li> Añadir un número igual de elementos combustibles irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1 ratio) y resuspender en Nkem a 2.5x10 5 el total de células / ml (Ver Nota 3). </li><li> Las células de las semillas en frascos T75 (un máximo de 50 ml por frasco). </li></ol> Días 10 y 12 <ol start="6"><li> Cuente el número de células. </li><li> Cambiar los medios de comunicación con toda Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> El día 14 <ol start="8"><li> Al final de dos semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo. </li><li> Ponga a un lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2) </li><li> Si la expansión se inició a partir de PBMC las células NK pueden ser purificados en esta etapa de expansión mediante el protocolo de purificación RosetteSep (véase la Sección IV). Si la expansión se inició a partir de las células NK purificadas proceder a la estimulación 3. </li><li> Después de la purificación de lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo para verificar la pureza de las células NK (como en el paso 8). </li><li> Continuar con la estimulación 3 con todas las células NK purificadas (Ver Nota 4). </li></ol> ESTIMULACIÓN 3 <ol><li> Resuspender las células NK con irradiado K562 CL9 mIL21 (1:1) en Nkem basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> Días 17 y 19 <ol start="2"><li> Cuente el número de células. </li><li> Cambiar los medios de comunicación con Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> El día 21 <ol start="4"><li> Al cabo de tres semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo. </li><li> Recuperar 1x10 6 células para el análisis de citometría de flujo para el panel completo de las células NK anticuerpos fenotipo (ver Tabla 1). </li><li> Congelar las células de FBS que contiene 10% de DMSO a una densidad máxima de 5x10 7 células por frasco para su uso futuro. </li></ol> 3. Células NK Citotoxicidad de ensayo <ol><li> Descongelar un vial de células NK y la semilla en Nkem, un día antes de performing ensayo de citotoxicidad para permitir la recuperación. </li><li> Para cada ensayo de células de la citotoxicidad NK utilizando una línea de células objetivo único, 6x10 5 células NK y 3x10 5 células diana se requieren (ver nota 5). </li><li> Prepare CAM-Media mediante la dilución de calceína-AM (stock 1 mg / ml en DMSO) en Nkem (Ver Nota 6). </li><li> Resuspender 10 6 células diana en 1 ml de CAM-media (Ver Nota 7). </li><li> Incubar durante 1 hora a 37 ° C, con agitación ocasional. </li><li> Resuspender las células NK en 1x10 6 células / ml y añadir 200uL de la suspensión de las células NK a cada uno de los tres pozos de fondo en U de 96 pocillos correspondientes a 10: 1 E: índice T se muestra en la Figura 1. (Ver Nota 8) </li><li> Añadir 100uL de los medios de comunicación completa a todos los pocillos restantes a excepción de "Máximo". </li><li> Añadir 100uL del 2% Triton X-100 a "Máximo". </li><li> Realizar diluciones seriadas de las células NK para la E 5 siguientes: Relaciones de T mediante la transferencia de 100uL de células cada vez, mezclar bien. Deseche 100uL de los últimos pozos (E: T proporción de 0.3125:1). </li><li> Después de 1 hora de carga calceína, lavar las células diana en Nkem dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) </li><li> Recuento de las células diana y resuspender en 1x10 5 células / ml. </li><li> Añadir 100 ml de las células diana a cada pocillo (1x10 4 / y). Centrifugar durante 1 minuto a 100 g para iniciar el contacto de la célula. </li><li> Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 4 horas. </li><li> Mezclar suavemente la cultura con la pipeta con una pipeta de 100 l con el fin de suspender de manera uniforme la calceína liberados, la desaceleración de placas a 100 g durante 5 minutos para que sedimenten las células y la transferencia de 100 L del sobrenadante a un nuevo plato con cuidado para evitar burbujas. Pop todas las burbujas que se forman con aguja fina. </li><li> Lea la placa con un lector de placas fluorescentes (excitación filtro de 485 nm, emisión de filtro de 530 nm). Lectura inferior es recomendable. </li><li> Calcular porcentaje de lisis específica de acuerdo a la fórmula [(versión de prueba de liberación espontánea) / (máximo liberación - la liberación espontánea)] x 100. </li></ol> 4. NK purificación de células por RosetteSep <ol><li> Tener 100 veces el exceso de glóbulos rojos a la de PBMC o células expandidas, en un tubo de 50 ml (100:1 RBC: CMSP). </li><li> Si utiliza los glóbulos rojos frescos vaya directamente al paso siguiente o si los glóbulos rojos se almacenan en la solución de Alsever s, contar el número de glóbulos rojos y lavar apropiado (100 veces superior a) la cantidad de glóbulos rojos con PBS suplementado con FBS al 2% tres veces, centrifugando a 1200 rpm durante 10 minutos cada vez. </li><li> Los glóbulos rojos se combinan con PBMC a partir del paso 1.7 o células expandidas desde el paso en PBS 2,10 + 2% de SFB a un volumen final de 1 ml por 5x10 7 de PBMC o células expandidas. </li><li> Añadir 1μL de RosetteSep  Células NK Cóctel de enriquecimiento por 1x10 6 de PBMC o células expandidas. </li><li> Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave cada 5 minutos. </li><li> Añadir un volumen igual de PBS + 2% de SFB mezclar suavemente y la capa en la parte superior de Ficoll-Paque. </li><li> Repita los pasos de centrifugación Ficoll-Paque descrito para el aislamiento de PBMC (Sección I). </li><li> Contar las células NK se recuperó después de la purificación y dejar de lado 5x105 células de phenotpying por citometría de flujo para la pureza de las células NK (Paso 8). </li></ol> 5. Notas NOTA 1. Las células NK se puede ampliar directamente de PBMCs, o de RosetteSep células NK purificadas . Hemos tomado nota de la eficiencia de expansión similar, pero algunos donantes pueden tener un número muy bajo de células NK que resulta en la purificación de dificultad RosetteSep antes de la expansión. NOTA 2. Habitualmente usamos CD56-FITC, CD16-PE y CD3-PE-Cy5 para fenotipificación durante la expansión, la enumeración de las células NK como los que son CD3 negativo y CD16-CD56 o positiva. NOTA 3. En cada cambio de los medios de comunicación o la estimulación, las células se resuspenden en 2,5 x 10 5 / ml para mantener PBMC / NK número de células en o menos de 2 millones por ml en etapas pico de la expansión. Esto evitará el agotamiento de los nutrientes y ayudan a lograr la expansión máxima y la supervivencia. NOTA 4. La tasa de expansión es NK dependientes de los donantes y al final de estímulos 1 y 2 parte de las células se pueden congelar y parte amplió aún más en función de la necesidad de experimentación. Hemos tenido buen éxito en el uso de las células congeladas para la expansión en un momento posterior. NOTA 5. Con el fin de dejar espacio para el error se recomienda utilizar un mínimo de 7x10 5 células NK se resuspendieron en 700 ULS de Nkem y 4x10 5 calceína-AM células blanco manchado resuspendieron en 4 ml de Nkem para establecer el ensayo de citotoxicidad. Si se utiliza una pipeta multicanal para la siembra de las células diana mayor volumen de las células (hasta 6x10 5 en 6 mL) puede ser necesaria en función del tamaño de la cuenca media que se utiliza. También el número recomendado de las células NK son específicamente para el E: T ratios muestran en el protocolo, para el uso de mayor E: T ratios aumentoel número de células NK por ml en consecuencia (por ejemplo, para una E 40:1: índice T 4x10 utilizar 6 células / ml) NOTA 6. Se recomienda realizar un preliminar calceína-AM de carga de la valoración de la línea celular de destino de su elección, con las siguientes diluciones de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 y 1:100 para lograr la diferencia óptima entre la liberación máxima y espontánea. NOTA 7. Cuando se utiliza una línea de células adherentes como objetivo, en primer lugar preparar la suspensión de células individuales usando no enzimática celular tampón de disociación. Si se realiza la ADCC, prepare un tubo de duplicados de las células diana en el CAM-medios de comunicación. NOTA 8 Si se realiza la ADCC, añadir mismas células NK a tres pozos correspondientes a 10:1 E:. T para la ADCC. Repita este procedimiento para otros donantes. Repita el procedimiento para las células diana adicionales. NOTA 9. Si se realiza un experimento ADCC, después de 45 minutos de carga calceína, añadir 10ug de anticuerpos específicos para inducir ADCC contra las células diana. Después de 15 minutos, lavar las células diana en medio completo dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. Resuspender las células en el 1x10 5 células / ml y proceder con el siguiente paso en el protocolo. 6. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cuando la expansión se realiza según el esquema descrito anteriormente, utilizando 5x106 PBMC como material de partida, típica de las células NK gama rendimientos de 1x10 9 al 10 10 células (variabilidad dependientes de los donantes). La figura muestra la expansión de células NK veces (n = 19) en comparación con las células NK presentes en el producto original (media + / - cuartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La ampliación de las células NK expresan diferentes receptores de células NK que son comparables a los dilatar las células NK primaria, con algunas excepciones (CD11b, CD160 y CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. PBMCs recuperación de la capa leucocitaria es dependiente de los donantes y puede variar de 6 a 300x10 800x10 6. Las células NK pueden comprender un 2% - 18% de las PBMC. Para la purificación de las células RosetteSep ampliado, la recuperación de las células NK pura en el día 14 oscila entre 40-70%. Siguiendo el protocolo recomendado de la expansión y la purificación, la pureza de las células NK de 99% se puede esperar. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Ampliado las células NK han demostrado citotoxicidad frente a una serie de líneas de células tumorales, incluyendo neuroblastoma, AML, el osteosarcoma y el melanoma (representante de la matanza LMA muestra como la lisis por ciento específicas).

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
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<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
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</ol>

La expansión de células NK y los medios de activación (Nkem) <ul><li> 90% de RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% de suero fetal bovino (Gibco) </li><li> 1x penicilina / estreptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-glutamina (Gibco) <ul><li> Filtro esterilizar los medios de comunicación antes de su uso. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL-2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.) <ul><li> - Diluidas de un 200 UI / l de valores. Añadir IL2 a la cantidad deseada de los medios de comunicación justo antes del uso cada vez. </li></ul></li></ul> PBMC y el aislamiento de células NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Solución de Alsever (Sigma) </li><li> RosetteSep Humanos de Células NK enriquecimiento Cocktail (StemCell Technologies) </li></ul> Células NK Citotoxicidad de ensayo <ul><li> Calceína-AM (Invitrogen) <ul><li> Solución madre se encuentra en 1 mg / ml, tienda de congelados en alícuotas de 50 mL. Se disuelven en los medios de comunicación para lograr Nkem dilución deseada para la tinción de células. </li></ul></li></ul> Anticuerpos La lista de los anticuerpos utilizados para el fenotipo de las células NK se enumeran en la tabla siguiente; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticuerpo </td><td> Volumen por prueba </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Un tubo </td><td valign="top"> FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tubo 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo de 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 APC CD27 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo de 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células nk

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Asesinas naturales (NK) desempeñan un papel importante en la vigilancia inmune contra una variedad de microorganismos infecciosos y tumores. La limitada disponibilidad de las células NK y la capacidad de ampliar in vitro ha restringido el desarrollo de la inmunoterapia de las células NK. Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente grandes cantidades de células NK funcionales ex vivo utilizando células que expresan K562 membrana IL21, como artificial célula presentadora de antígeno (AAPC). Terapias de células NK adoptivos a la fecha han utilizado un producto de células obtenidas por el estado de equilibrio de la aféresis de donantes seguido por el agotamiento de las células T o de la selección positiva de las células NK. El producto se activa normalmente en IL-2 durante la noche y luego se administra el día siguiente 1. Debido a la baja frecuencia de las células NK en sangre periférica, un número relativamente pequeño de las células NK se han entregado en los ensayos clínicos. La incapacidad para propagar las células NK in vitro ha sido el factor limitante para la generación de un número suficiente de células para el resultado clínico óptimo. Algunos expansión de las células NK (50-10 veces más de 1-2 semanas) se logra a través de altas dosis de IL-2 sola 2. La activación de células T autólogas puede mediar la expansión de células NK, probablemente también a través de la liberación de citoquinas local 3. Apoyo con estroma mesenquimal o de células presentadoras de antígeno artificiales (aAPCs) puede apoyar la expansión de las células NK, tanto de sangre periférica y sangre de cordón umbilical 4. Combinado NKp46 y la activación CD2 por anticuerpos revestida de piedras se comercializan actualmente para la expansión de las células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), lo que resulta en la expansión de aproximadamente 100 veces en 21 días. Los ensayos clínicos utilizando AAPC-expandido o activa las células NK están en marcha, uno con línea celular leucémica CTV-1 a las células NK y activar primer 5 sin una expansión significativa. Un segundo ensayo utiliza EBV-LCL para la expansión de las células NK, logrando una expansión media de 490 veces en 21 días 6. La tercera utiliza un AAPC K562 basado transducidas con 4 1BBL (CD137L) y 7 de membrana IL-15 (MIL-15), que alcanzó una expansión media de NK 277 veces en 21 días. A pesar de que las células NK ampliado con K562-41BBL-mIL15 AAPC son altamente citotóxicos in vitro e in vivo frente a dilatar las células NK, y participar en la ADCC, su proliferación se ve limitada por la senescencia atribuido a acortamiento de los telómeros 8. Más recientemente, una expansión de 350 veces de las células NK se informó mediante K562 expresan MICA, 4 y 9 1BBL-IL15. Nuestro método de expansión de las células NK se describe en este documento produce una rápida proliferación de las células NK, sin alcanzar la senescencia una expansión media de 21.000 veces en 21 días.

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Las células asesinas naturales (NK) desempeñan un papel importante en la vigilancia inmunitaria contra una variedad de microorganismos infecciosos y tumores. La disponibilidad limitada de...

El objetivo general de este procedimiento es expandir rápidamente un gran número de células NK humanas. Comience ex vivo aislando PBMC o células NK de un buffy coat o una muestra de sangre completa. Luego, realice un cultivo conjunto de PBMC con células presentadoras de antígeno artificiales en la expansión de células NK. El medio suplementado con IL-2 mantiene el cultivo de células NK durante tres semanas con estimulaciones semanales mediante aPCs, teniendo cuidado de mantener el número de células NK por debajo de 1 × 10⁶ por mililitro de cultivo. Finalmente, se valida la eficacia funcional de las células NK expandidas mediante un ensayo de citotoxicidad no radiactivo. Un rendimiento típico de células NK con este esquema de expansión da como resultado una expansión mediana de 21.000 veces al final de 21 días, mostrando una alta citotoxicidad frente a diversos tumores, según se determinó mediante un ensayo de liberación de calcio.Este procedimiento puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología de las células NK, ya que históricamente ha sido muy difícil obtener grandes cantidades de células NK. Esta técnica tiene implicaciones para la inmunoterapia del cáncer humano, porque generar suficientes células NK para dicha terapia ha sido tradicionalmente muy difícil. Cecily, la ayudante de investigación principal de mi laboratorio, demostrará esta técnica para obtener PBMC a partir de sangre de donantes sanos.Normalmente se utiliza el capa leucocitaria de banco de sangre como fuente. Primero, agregue PBS para ajustar el volumen del capa leucocitaria a 140 mililitros. Luego, coloque 35 mililitros de muestra sobre 15 mililitros de fial PA para la centrifugación de separación en gradiente a 400 G durante 20 minutos.Sin interrupción. Recupere cuidadosamente las BMC-P de la interfase plasma Fial PA y aparte el tubo de GR para usarlo posteriormente. Lave las BMC-P tres veces con PBS, centrifugando cada vez a 400 ×g durante 10 minutos.Utilice esta fracción de BMCs P para la expansión de células NK. Vuelva ahora al tubo de gradiente. Aspire el fi.Llame y transfiera los GR a dos tubos de centrífuga de 50 mililitros y lávelos con PBS agregado hasta la marca de 50 mililitros. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante pasando por la parte superior de la capa de GR. Para eliminar los granulocitos.Realice tres lavados, luego re suspenda los GR en un volumen igual de solución else y almacénelos a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Esta fracción de GR puede utilizarse para la purificación de células NK mediante roseta SEP al final de dos semanas de expansión. Para expandir eficientemente células NK funcionales ex vivo, use células del clon K 5 62 nueve con IL 21 unida a la membrana, denominadas a partir de ahora como K 5 62.Se utilizan nueve clones de IL-21 como células presentadoras de antígeno artificiales. Primero, cuente los PBMC y calcule el volumen necesario para sembrar cinco veces 10 a la sexta células para la expansión de células NK por cada recuento de cinco veces 10 a la sexta PBMC, e irradie 10 veces 10 a la sexta células K562 clon nueve IL-21. Utilice un irradiador gamma a 100 Gy; las células irradiadas también pueden congelarse para uso futuro. Lave ahora las células previamente irradiadas con PBS y resuspenda en medio de expansión de células NK.Ahora observe una proporción de dos a uno de células irradiadas con PBMC en 40 mililitros de medio de expansión de células NK y coloque el frasco T75 en posición vertical en un incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono el día tres. Recupere las células estimuladas mediante centrifugación a 400 ×g durante cinco minutos y reemplace la mitad del medio con NKEM fresco y continúe el cultivo. Repita el cambio de medio el día cinco. Al final de una semana, cuente el número de células y reserve cinco veces 10 a la quinta células para fenotipificación mediante citometría de flujo para la segunda estimulación, cuente e irradie una proporción uno a uno de K562.Clone nueve células IL-21 para expandir sus células y luego combine las células en medio de expansión de células NK a 2,5 × 10⁵ células totales por mililitro. Incube ahora las células en matraces T-75 y continúe el cultivo los días 10 y 12, pasando las células en medio de expansión de células NK a 2,5 × 10⁵ células por mililitro al día 14 de expansión. Nuevamente, enumere las células y caracterice fenotípicamente una muestra mediante citometría de flujo.Purifique esta expansión celular derivada de PBMC utilizando el protocolo de purificación por separación con rosetas SEP y verifique la pureza de las células NK mediante citometría de flujo y fenotipificación. Realice una tercera estimulación sobre las células NK purificadas utilizando una proporción uno a uno de células K562 clon nueve IL-21 irradiadas. Finalmente, en el día 21, analice las células NK amplificadas mediante citometría de flujo empleando un panel completo de anticuerpos para fenotipificación.Congele los cultivos celulares en FBS que contenga 10 % DMSO a una densidad máxima de cinco veces 10 a la séptima células por vial. Utilice células NK frescas o congeladas para el ensayo de citotoxicidad. Si utiliza células NK congeladas, primero descongele el vial de células NK y siembre en NKEM durante 24 horas para permitir la recuperación celular el día del ensayo; resuspenda 10 a la sexta células diana en un mililitro de NKEM que contenga calcio am y incube durante una hora a 37 grados Celsius con agitación ocasional. En una placa UBO de 96 pocillos, agregue en réplica triple 200 microlitros de células NK suspendidas a una concentración de una vez 10 a la sexta células por mililitro y realice diluciones seriadas de las células según se indica.Después de una hora de carga con calcio, lave las células diana en medio de expansión de células NK mediante dos centrifugaciones durante cinco minutos a 400 G. Vuelva a contar las células diana y resuspenda a una concentración de un por diez a la quinta células por mililitro. Añada 100 microlitros de células diana a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y centrifugue durante un minuto a 100 G para iniciar el contacto celular; incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cuatro horas.Para suspender de manera uniforme el calcio liberado, mezcle suavemente la cultura pipeteando las células del pellet a 100 G durante cinco minutos y transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una nueva placa plana de 96 pocillos, teniendo cuidado de evitar burbujas; si es necesario, elimine cualquier burbuja que se forme utilizando una aguja fina. Lea la placa utilizando un lector de placas de fluorescencia ajustado con un filtro de excitación de 485 nanómetros y un filtro de emisión de 530 nanómetros.Calcule el porcentaje de lisis específica. Típicamente, la expansión de cinco veces 10 a la sexta pbmc aisladas de capa buffy produce entre uno por diez a la novena y diez a la décima. Células NK, las células NK expandidas expresan diversos receptores de células NK comparables a las células NK primarias no expandidas presentes en la capa buffy.Las células NK pueden representar del 2 al 18 % de los PBMC en el día 14. La purificación por rosetas SEP de las células expandidas puede recuperar del 40 al 70 % de las células NK presentes en el cultivo, con una pureza de células NK del 99 %, indicada por CD tres. Las células NK expandidas negativas para CD 56 y positivas para CD 56 han demostrado citotoxicidad frente a una variedad de líneas celulares tumorales, incluyendo neuroblastoma, leucemia mieloide aguda, osteosarcoma y melanoma.Aquí, la muerte representativa mediada por linfocitos citotóxicos (A ML) se muestra como porcentaje de lisis específica. El video en vivo BIOT muestra la muerte celular mediada por células asesinas naturales (NK) de la línea celular de neuroblastoma CHP 1 34 cargada con amarillo de calcio. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de la producción de citoquinas por células NK y la transferencia adaptativa en modelos animales de tumor, para responder preguntas adicionales sobre las funciones de las células NK.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expandir y purificar grandes cantidades de células NK. Esto puede lograrse directamente a partir de células mononucleares de sangre periférica y luego purificar las células NK, o bien se puede iniciar la expansión utilizando células NK purificadas mediante el método de roseta. En los inicios, un coágulo típico de glóbulos blancos proporcionará entre 15 y 40 millones de células NK, todas las cuales pueden utilizarse para expandir cantidades muy grandes de células NK siguiendo el esquema descrito en este método.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Este video muestra una técnica para la expansión de células asesinas naturales (NK) directamente desde células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando una línea celular alimentadora. Las PBMC se cocultivan con células alimentadoras linfoblastoides modificadas genéticamente que expresan interleucina-21 unida a la membrana (mIL-21), y el cultivo se complementa con las citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). En conjunto, este cóctel de ligandos conduce a la...

Expansión ex vivo de células asesinas naturales a partir de células mononucleares de sangre periférica

Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

Método de expansión celular Natural Killer (NK) y CAR-NK utilizando línea de células B modificada con IL-21 unida a la membrana

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Aprende a expandir y purificar células NK humanas de sangre periférica mediante co-cultivo con células presentadoras de antígeno artificiales e IL-2. Este protocolo permite obtener altos rendimientos de células funcionales para inmunoterapia contra cáncer.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

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