Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

El objetivo general de este procedimiento es expandir rápidamente un gran número de células NK humanas. Comience ex vivo aislando PBMC o células NK de un buffy coat o una muestra de sangre completa. Luego, realice un cultivo conjunto de PBMC con células presentadoras de antígeno artificiales en la expansión de células NK.

El medio suplementado con IL-2 mantiene el cultivo de células NK durante tres semanas con estimulaciones semanales mediante aPCs, teniendo cuidado de mantener el número de células NK por debajo de 1 × 10⁶ por mililitro de cultivo. Finalmente, se valida la eficacia funcional de las células NK expandidas mediante un ensayo de citotoxicidad no radiactivo. Un rendimiento típico de células NK con este esquema de expansión da como resultado una expansión mediana de 21.000 veces al final de 21 días, mostrando una alta citotoxicidad frente a diversos tumores, según se determinó mediante un ensayo de liberación de calcio.

Este procedimiento puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología de las células NK, ya que históricamente ha sido muy difícil obtener grandes cantidades de células NK. Esta técnica tiene implicaciones para la inmunoterapia del cáncer humano, porque generar suficientes células NK para dicha terapia ha sido tradicionalmente muy difícil. Cecily, la ayudante de investigación principal de mi laboratorio, demostrará esta técnica para obtener PBMC a partir de sangre de donantes sanos.

Normalmente se utiliza el capa leucocitaria de banco de sangre como fuente. Primero, agregue PBS para ajustar el volumen del capa leucocitaria a 140 mililitros. Luego, coloque 35 mililitros de muestra sobre 15 mililitros de fial PA para la centrifugación de separación en gradiente a 400 G durante 20 minutos.

Sin interrupción. Recupere cuidadosamente las BMC-P de la interfase plasma Fial PA y aparte el tubo de GR para usarlo posteriormente. Lave las BMC-P tres veces con PBS, centrifugando cada vez a 400 ×g durante 10 minutos.

Utilice esta fracción de BMCs P para la expansión de células NK. Vuelva ahora al tubo de gradiente. Aspire el fi.

Llame y transfiera los GR a dos tubos de centrífuga de 50 mililitros y lávelos con PBS agregado hasta la marca de 50 mililitros. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante pasando por la parte superior de la capa de GR. Para eliminar los granulocitos.

Realice tres lavados, luego re suspenda los GR en un volumen igual de solución else y almacénelos a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Esta fracción de GR puede utilizarse para la purificación de células NK mediante roseta SEP al final de dos semanas de expansión. Para expandir eficientemente células NK funcionales ex vivo, use células del clon K 5 62 nueve con IL 21 unida a la membrana, denominadas a partir de ahora como K 5 62.

Se utilizan nueve clones de IL-21 como células presentadoras de antígeno artificiales. Primero, cuente los PBMC y calcule el volumen necesario para sembrar cinco veces 10 a la sexta células para la expansión de células NK por cada recuento de cinco veces 10 a la sexta PBMC, e irradie 10 veces 10 a la sexta células K562 clon nueve IL-21. Utilice un irradiador gamma a 100 Gy; las células irradiadas también pueden congelarse para uso futuro. Lave ahora las células previamente irradiadas con PBS y resuspenda en medio de expansión de células NK.

Ahora observe una proporción de dos a uno de células irradiadas con PBMC en 40 mililitros de medio de expansión de células NK y coloque el frasco T75 en posición vertical en un incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono el día tres. Recupere las células estimuladas mediante centrifugación a 400 ×g durante cinco minutos y reemplace la mitad del medio con NKEM fresco y continúe el cultivo. Repita el cambio de medio el día cinco. Al final de una semana, cuente el número de células y reserve cinco veces 10 a la quinta células para fenotipificación mediante citometría de flujo para la segunda estimulación, cuente e irradie una proporción uno a uno de K562.

Clone nueve células IL-21 para expandir sus células y luego combine las células en medio de expansión de células NK a 2,5 × 10⁵ células totales por mililitro. Incube ahora las células en matraces T-75 y continúe el cultivo los días 10 y 12, pasando las células en medio de expansión de células NK a 2,5 × 10⁵ células por mililitro al día 14 de expansión. Nuevamente, enumere las células y caracterice fenotípicamente una muestra mediante citometría de flujo.

Purifique esta expansión celular derivada de PBMC utilizando el protocolo de purificación por separación con rosetas SEP y verifique la pureza de las células NK mediante citometría de flujo y fenotipificación. Realice una tercera estimulación sobre las células NK purificadas utilizando una proporción uno a uno de células K562 clon nueve IL-21 irradiadas. Finalmente, en el día 21, analice las células NK amplificadas mediante citometría de flujo empleando un panel completo de anticuerpos para fenotipificación.

Congele los cultivos celulares en FBS que contenga 10 % DMSO a una densidad máxima de cinco veces 10 a la séptima células por vial. Utilice células NK frescas o congeladas para el ensayo de citotoxicidad. Si utiliza células NK congeladas, primero descongele el vial de células NK y siembre en NKEM durante 24 horas para permitir la recuperación celular el día del ensayo; resuspenda 10 a la sexta células diana en un mililitro de NKEM que contenga calcio am y incube durante una hora a 37 grados Celsius con agitación ocasional. En una placa UBO de 96 pocillos, agregue en réplica triple 200 microlitros de células NK suspendidas a una concentración de una vez 10 a la sexta células por mililitro y realice diluciones seriadas de las células según se indica.

Después de una hora de carga con calcio, lave las células diana en medio de expansión de células NK mediante dos centrifugaciones durante cinco minutos a 400 G. Vuelva a contar las células diana y resuspenda a una concentración de un por diez a la quinta células por mililitro. Añada 100 microlitros de células diana a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y centrifugue durante un minuto a 100 G para iniciar el contacto celular; incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cuatro horas.

Para suspender de manera uniforme el calcio liberado, mezcle suavemente la cultura pipeteando las células del pellet a 100 G durante cinco minutos y transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una nueva placa plana de 96 pocillos, teniendo cuidado de evitar burbujas; si es necesario, elimine cualquier burbuja que se forme utilizando una aguja fina. Lea la placa utilizando un lector de placas de fluorescencia ajustado con un filtro de excitación de 485 nanómetros y un filtro de emisión de 530 nanómetros.

Calcule el porcentaje de lisis específica. Típicamente, la expansión de cinco veces 10 a la sexta pbmc aisladas de capa buffy produce entre uno por diez a la novena y diez a la décima. Células NK, las células NK expandidas expresan diversos receptores de células NK comparables a las células NK primarias no expandidas presentes en la capa buffy.

Las células NK pueden representar del 2 al 18 % de los PBMC en el día 14. La purificación por rosetas SEP de las células expandidas puede recuperar del 40 al 70 % de las células NK presentes en el cultivo, con una pureza de células NK del 99 %, indicada por CD tres. Las células NK expandidas negativas para CD 56 y positivas para CD 56 han demostrado citotoxicidad frente a una variedad de líneas celulares tumorales, incluyendo neuroblastoma, leucemia mieloide aguda, osteosarcoma y melanoma.

Aquí, la muerte representativa mediada por linfocitos citotóxicos (A ML) se muestra como porcentaje de lisis específica. El video en vivo BIOT muestra la muerte celular mediada por células asesinas naturales (NK) de la línea celular de neuroblastoma CHP 1 34 cargada con amarillo de calcio. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de la producción de citoquinas por células NK y la transferencia adaptativa en modelos animales de tumor, para responder preguntas adicionales sobre las funciones de las células NK.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expandir y purificar grandes cantidades de células NK. Esto puede lograrse directamente a partir de células mononucleares de sangre periférica y luego purificar las células NK, o bien se puede iniciar la expansión utilizando células NK purificadas mediante el método de roseta. En los inicios, un coágulo típico de glóbulos blancos proporcionará entre 15 y 40 millones de células NK, todas las cuales pueden utilizarse para expandir cantidades muy grandes de células NK siguiendo el esquema descrito en este método.