Name: Una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a medir la sensibilidad al etanol en Drosophila mediante el ensayo de pérdida del reflejo de enderezamiento. Este método permite evaluar diferencias entre cepas y mutantes, así como inducir tolerancia en moscas.

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Damos las gracias a Aylin Rodan para la lectura crítica del manuscrito, y los miembros del laboratorio útil para el debate. Esta investigación es apoyada por el NIH, R01AA019526.

1. La creación de la cámara de exposición <ol><li> Cortar un tapón vial en la mitad de una hoja de afeitar. Como alternativa, utilice las bolas de algodón. </li><li> Empuje el tapón de media vial, o la bola de algodón, en el fondo de un frasco de comida para hacer una superficie lisa que las moscas no se queda bloqueado pulg </li><li> Si la toma de múltiples cámaras de la exposición, asegúrese de que el tapón del vial y los alimentos ocupan el mismo volumen en cada cámara. Una marca en el lado del vial puede facilitar esta tarea. </li></ol> 2. La exposición de las moscas <ol><li> Colecciona 8 moscas de un mismo sexo, la edad de 1-5 días, el día antes de la exposición en viales comida regular sin levadura. </li><li> Etiqueta en el código, de tal manera que el experimentador se desconocía el genotipo real / cepa utilizada. </li><li> La transferencia de los ocho moscas en las cámaras de la exposición tocando. No anestesiar. </li><li> Agregue una pequeña cantidad de colorantes en los alimentos, por ejemplo, ácido azul 9, a prueba de etanol 200 para que sea fácilmente visible. </li><li> Cubrir el fondo de un tapón de vial, o una bola de algodón, con 0,5 ml de etanol. </li><li> Inserte el enchufe del etanol en el vial de la exposición. Asegúrese de que el alcohol se enfrenta en el vial, y no hacia la pared del vial. </li><li> Iniciar un temporizador contando. </li></ol> 3. Registro de intoxicación inducida por el etanol <ol><li> Cada minuto después se inicia el temporizador, pulse en la cámara de exposición en el banco para asustar a las moscas y los observamos durante diez segundos. </li><li> Anote el número de moscas fijas por cada minuto. Las moscas son fijos si no pueden salir de sus espaldas, siendo en un solo lugar, o la velocidad de vibración de sus alas a lo largo de toda la observación de diez segundos de periodo. Las moscas últimos son considerados fijos porque la gran mayoría de estas moscas son estacionarias entre los períodos de rápido movimiento de las alas. Las moscas no son estacionarias, si se puede bajar la espalda y el pie y / o hasta la pared del vial. </li><li> Un ensayo de la exposición se termina cuando cuatro o más moscas se registran como estacionario. </li><li> Deseche las moscas y deja que el aire de la cámara a la exposición para su posterior reutilización. </li></ol> 4. Determinar el tiempo que el 50% de sedación El tiempo hasta el 50% de sedación (ST50) es el tiempo después del inicio de la exposición a etanol, cuando cuatro de los ocho moscas permanecen estacionarias. Esto se determina de la siguiente manera: O bien: el momento en la primera medición cuando exactamente cuatro moscas son estacionarias. O: si tiene menos de cuatro moscas (Y1) son estacionarias en un momento determinado (X minutos), y más de cuatro (Y2) en el punto de medir el tiempo siguiente (X +1 minutos), luego linealmente interpolar la ST50 con la fórmula: ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X 5. Repita la exposición para determinar la tolerancia La exposición de las moscas <ol><li> Determinar el ST50 (en peso) para el control de la cepa de tipo salvaje utilizados en el experimento. </li><li> Exponer los grupos experimentales de las moscas de etanol como se describió anteriormente. </li><li> Medir su ST50 (1), pero continúan exponiendo hasta llegar a la hora 2x ST50 (en peso). </li><li> Transferencia de las moscas de nuevo en un frasco de comida vacías, y mantener durante 4 horas. </li><li> Volver a exponer las moscas, y determinar el ST50 (2) de la exposición 2. </li></ol> Determinar la tolerancia Calcular la tolerancia en% como (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100. 6. Los resultados representativos: Se muestra aquí, son algunos de los resultados que obtuvimos con el representante de 6-8 viales de moscas por el genotipo y la dosis. Si el error estándar es sustancialmente mayor, entonces un problema sistemático que probablemente ocurrió. Asegúrese de que el etanol se enfrenta a las cámaras de la exposición, y que las cámaras tienen el mismo volumen. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva dosis-respuesta de tipo salvaje moscas expuestas a un porcentaje creciente de etanol. Ocho frascos de moscas fueron expuestas por dosis y el sexo. Machos y hembras muestran la ST50 mismo en cada dosis (p&gt; 0,22, 2-way ANOVA), mientras que el ST50 en todas las dosis se reduce significativamente con la dosis de etanol cada vez mayor (p &lt;0,001). Tenga en cuenta que las moscas de hacinamiento botellas pueden ser sustancialmente menores que los de las botellas de salud, y esta diferencia de tamaño puede afectar a la ST50. Semillas de cada botella con las hembras 15-20 por la que se durante 1-2 días para obtener la densidad óptima de las larvas por botella. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La exposición de moscas para el etanol del 90% o 100% reproduce el etanol se ha descrito anteriormente, la resistencia causada por el blanco rabbit1 mutation2 (p &lt;0,001, 2-way ANOVA). <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Repita la exposición a etanol al 100%, separadas por un intervalo de recuperación de 4 horas, provoca un aumento significativo en el ST50 después de la segunda exposición (p &lt;0,001, t pareada-Test). Tenga en cuenta que las moscas fueron expuestas durante 24 minutos durante la primera exposición (que corresponde al doble de su ve na ST50). La exposición de un corto período de tiempo (12 minutos) no causó un aumento significativo en ST50 en la re-exposición (datos no mostrados).

<ol><li>Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
</ol>

En esta presentación, hemos delineado un método sencillo para determinar la intoxicación inducida por el etanol basado en los ensayos anteriores se ha descrito por Bainton et al. 2000 1, y Rothenfluh et al. 2006 2. Puesto que el alcohol sedación inducida se correlaciona con la preferencia de consumo de alcohol 3, este ensayo es relevante para el estudio de trastornos por consumo de alcohol. El ensayo se describe se basa en sobresalto inducida geotaxis negativo, y como una exposición al alcohol interfiere con la respuesta innata. Antes de iniciar la exposición, asegúrese de que todas las moscas de mostrar una respuesta normal a un sobresalto, es decir, después de tocar por las moscas en el frasco de alimentos, todos ellos deben moverse hacia arriba desde el fondo dentro de un tiempo de observación de 10 segundos. Ejemplos de las moscas de haber reducido geotaxis negativos incluyen bang-sensibles cinco mutantes convulsiones y deficiencia de locomoción-moscas causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas 6. A pesar de que el ensayo descrito es relativamente simple, dos variables merecen la mayor atención para asegurar resultados reproducibles. En primer lugar, todos los viales de exposición debe ser el mismo volumen. Esto incluye asegurarse de que el fondo del frasco contiene el mismo volumen de alimentos + vial plug / bola de algodón, así como de insertar el etanol que contienen la misma distancia de cada vial. Un vial completamente vacío puede utilizarse para este ensayo, sino que lo conduce a los valores ya ST50, la disminución del rendimiento de la prueba. Este ensayo también es adecuado para determinar la cantidad de moscas de la tolerancia a desarrollar en la exposición repetida de etanol. Una serie de variables deben tenerse en cuenta al hacer exposiciones repetidas. En primer lugar, el intervalo entre la exposición es descrita aquí como 4 horas. Esta variable se puede cambiar, pero se recomienda que no sea inferior a 2 horas, para asegurar la eliminación de etanol a partir de la primera exposición. Ver Scholz et al. 2000 4 de la cinética de desarrollo de etanol de la tolerancia y la decadencia. La segunda variable a considerar es la duración de la primera exposición. Esto, obviamente, tiene que ser la misma para el control de las moscas y experimental. Sin embargo, esto no puede dar lugar a la misma cantidad de etanol entregado a estas dos cepas de volar. Moscas sedado absorber más etanol que las moscas activa 2, por lo tanto, una variedad que a principios de seda pueden recibir una dosis más alta que una cepa más sedante, y así desarrollar una mayor tolerancia, debido a una dosis inicial más alta. Le advierte al lector cuando se compara el desarrollo de la tolerancia de las cepas que muestran diferencias en los primeros ST50 (1). El ensayo se describe aquí es una herramienta útil en forma fácil y reproducible para determinar las respuestas de las moscas de la conducta con el alcohol.

<table><tbody><tr><td>Viales de exposición</td><td>www.flystuff.com</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Tapas</td><td>www.flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Azul 9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr></tbody></table>

una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Las dosis bajas de etanol causa moscas se vuelven hiperactivos, mientras que altas dosis son sedantes. La sensibilidad a la sedación inducida por el etanol de una cepa de mosca dado se correlaciona con la preferencia de etanol que la cepa s, y por lo tanto, la sedación es una medida de gran importancia para estudiar la genética de las respuestas de alcohol y la bebida. Nos demuestran una manera sencilla de exponer a las moscas de etanol y medir sus efectos intoxicantes. El ensayo se describe se puede determinar la sensibilidad aguda, así como la tolerancia del etanol inducido por la exposición repetida. No requiere una instalación técnicamente involucrados, y por lo tanto se puede aplicar en cualquier laboratorio con las herramientas básicas de la cultura volar.

Una prueba sencilla para medir los efectos sedantes del alcohol en<em&gt; Drosophila</em&gt; Moscas, basado en la pérdida de los reflejos, se describe.

Una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas

Las dosis bajas de etanol provocan que las moscas se vuelvan hiperactivas, mientras que las dosis altas son sedantes. La sensibilidad a la sedación inducida por el etanol de una cepa de moscas determinada...

Hola, soy Thomas Maples del laboratorio del Dr. Adrian Rothen flu del Departamento de Psiquiatría del Centro Médico UT Southwestern en Dallas. Hoy demostraré un procedimiento sencillo para determinar la sensibilidad de las moscas a la sedación inducida por etanol. Este ensayo se basa en la pérdida del reflejo de enderezamiento y de la capacidad de caminar en las moscas tras la exposición al etanol.Esta medida puede utilizarse para determinar las diferencias de sensibilidad al alcohol entre distintas cepas de drosófila y mutantes. También podemos usar este ensayo para inducir tolerancia en las moscas, entendiendo la tolerancia como una respuesta reducida al alcohol tras exposiciones repetidas. Comencemos.Para este experimento, necesitará los siguientes viales. Con ocho moscas de la fruta, un espécimen que haya recolectado uno o dos días antes. Puede realizar las exposiciones con machos o hembras.Sin embargo, cada vial debe contener solo un sexo. Un vial de alimento vacío que no contenga moscas, una cuchilla, dos tapones de vial hechos de un material similar al algodón. Si no tiene este tipo de tapones, también puede usar bolitas de algodón, una micropipeta de 1000 microlitros con puntas, etanol al 200 grados que contenga colorante alimentario que puede conseguir en cualquier tienda de abarrotes y un temporizador.Lo primero que debemos hacer es crear una cámara de exposición en la cual expondremos a las moscas al etanol y monitorearemos su movilidad. Para crear esta cámara, primero corte un tapón de vial por la mitad usando una cuchilla de afeitar. Luego, empuje una de las mitades hasta el fondo de un vial, cubriendo la comida.Esto crea una superficie nivelada y no adhesiva para que las moscas caminen. Si utiliza una bola de algodón, presiónela suavemente y trate de hacerla lo menos peluda posible para que las moscas no queden atrapadas en los hilos de algodón. Si está preparando varias cámaras, asegúrese de que la comida y el tapón del vial ocupen la misma cantidad de espacio en cada cámara.Esto asegura que las moscas en cada cámara estén expuestas al etanol en el mismo volumen. Con práctica, es fácil exponer tres viales de moscas en paralelo. Una vez que se han preparado las cámaras de exposición, ahora podemos exponer las moscas al etanol.Primero, transfiera un vial con ocho moscas a una cámara de exposición, sellando la cámara con el tapón del vial que originalmente contenía las moscas. A continuación, aspire con pipeta 500 microlitros de etanol teñido de la concentración elegida y colóquelos en un extremo de un tapón de vial similar a algodón. Luego, sustituya el tapón de la cámara de exposición por el tapón recubierto con etanol, introduciendo en la cámara el extremo recubierto con etanol.Inmediatamente después de añadir el tapón recubierto de etanol a la cámara de exposición, inicie un cronómetro. El colorante en el etanol ayuda a garantizar que el etanol quede orientado hacia el interior de la cámara de exposición y no hacia la pared del vial. Esto es especialmente importante si se utilizan bolas de algodón en lugar de tapones específicos, ya que cualquier lado de una bola de algodón puede quedar orientado hacia el interior del vial.En esta exposición, estamos utilizando alcohol al 100 %, que ahora se difunde hacia la cámara de exposición donde las moscas lo inhalan del aire. Cada minuto después de agregar el tapón recubierto con etanol a la cámara de exposición, contaremos cuántas moscas se han vuelto inmóviles, es decir, que son incapaces de darse la vuelta y caminar. Cuanto más tiempo permanezcan móviles las moscas, mayor será su resistencia en cada intervalo de un minuto.Sorprenda a las moscas golpeando el compartimento sobre la mesa para asegurarse de que todas las moscas que pueden moverse estén en movimiento. Observe las moscas durante 10 segundos después de golpear el compartimento para darles tiempo a comenzar a moverse o darse la vuelta, en cada intervalo de un minuto. Registre cuántas de las ocho moscas están inmóviles al comienzo del experimento.La mayoría de las moscas correrán rápidamente hacia arriba por el costado del vial tras asustarse. Tras aproximadamente seis minutos de exposición al etanol al 100 %, comienzan a moverse lentamente y a veces de forma errática hacia los 12 minutos. La mayoría de las moscas permanecerán inmóviles, incapaces de caminar o de darse la vuelta cuando estén tumbadas de espaldas.Solo deben contarse como moscas móviles aquellas que son capaces de enderezarse y caminar; las moscas que simplemente mueven las patas o las alas en el mismo lugar deben contarse como moscas inmóviles. Las moscas que permanecen boca arriba durante todo el período de observación también deben considerarse inmóviles, ya que su incapacidad para enderezarse es un signo de intoxicación. Asimismo, deben contarse como inmóviles las moscas que vibran vigorosamente sus alas durante todo el período de observación de diez segundos, incluso si cambian de posición. La gran mayoría de estas moscas permanece inmóvil entre períodos de movimiento rápido de las alas.En resumen, las moscas que son capaces de darse la vuelta y caminar son moscas móviles; aquellas que no pueden darse la vuelta, mover sus patas y alas en el lugar o vibrar rápidamente sus alas están inmóviles. Si aplicamos estas reglas, observamos que un mayor número de moscas de tipo silvestre se vuelven inmóviles a medida que aumenta el tiempo de exposición a los vapores de etanol. El valor que este ensayo utiliza para cuantificar la sensibilidad al etanol es el tiempo mediano de sedación o MST.Definimos el MST como los minutos de exposición al etanol necesarios para que cuatro de las ocho moscas en la cámara de exposición se vuelvan inmóviles. Este valor se determina fácilmente si exactamente cuatro moscas están inmóviles en un período específico de observación. Por ejemplo, si exactamente cuatro moscas están inmóviles tras 11 minutos de exposición, entonces 11 es el MST.Si exactamente cuatro moscas están inmóviles tras 11 minutos de exposición y lo mismo ocurre a los 12 minutos, entonces tómese el primer valor como el momento en que las moscas alcanzan por primera vez su TS. Si no hay cuatro moscas inmóviles en un período específico de observación, es necesario interpolar linealmente el momento en que cuatro moscas se volvieron inmóviles. Por ejemplo, si el número de moscas inmóviles aumenta de tres a cinco entre los nueve y diez minutos de exposición, puede determinarse gráficamente que el TMS es 9,5. Los siguientes datos recopilados mediante este ensayo muestran que este diseño experimental es una forma precisa de medir la sensibilidad al etanol.Se utilizaron de seis a ocho viales (N) en los siguientes experimentos, lo cual se indica dentro de las barras. El TMS de moscas macho de tipo silvestre expuestas al 100 % de etanol es aproximadamente de 11 minutos, con un error estándar bajo. La variabilidad de un día a otro es baja y en su mayoría no es estadísticamente significativa, pero aún así recomendamos que mida sus muestras experimentales y controles en paralelo el mismo día.Téngase también en cuenta que las moscas expuestas el día A y el día B no son los mismos individuos. Se trata de hermanos que representan la misma cepa genética. Las moscas macho y hembra expuestas al 100%Ethanol no muestran diferencias en el MST. Sin embargo, recomendamos ceñirse a un solo sexo.Si exponemos moscas macho y hembra a dosis crecientes de etanol, obtenemos una curva de respuesta dosis-dependiente que muestra una disminución estadísticamente significativa del MST en función del aumento de la concentración de etanol. Este ensayo también reproduce fenotipos previamente publicados que se midieron con un sistema más elaborado de vaporización de etanol: moscas con la mutación right rabbit one mostraron un aumento significativo en el MST. Este aumento se observó tanto al 100% como al 90% de etanol.Mediante este ensayo, también podemos inducir y medir la tolerancia al etanol en moscas. La tolerancia se define como una reducción en la respuesta al alcohol tras una exposición previa al alcohol para inducir tolerancia. Exponga un frasco de moscas al etanol durante aproximadamente el doble de su MST.Por ejemplo, exponemos estos machos de la cepa silvestre Berlin al 100 % de etanol durante 24 minutos. Después de exponerlos, golpee suavemente el tubo para devolver los ocho mosquitos a su vial de alimento, donde los dejará recuperarse durante cuatro horas. Registre el MST original de los mosquitos en su vial tras cuatro horas de recuperación, vuelva a exponer exactamente a los mismos mosquitos a la misma dosis de etanol y registre su segundo MST.Como puede observarse en este gráfico, el TMS de la segunda exposición al etanol es significativamente mayor que el TMS de la primera exposición, lo que indica que las moscas han desarrollado tolerancia a los efectos sedantes del etanol. Una medida de la tolerancia se calcula dividiendo el segundo TMS de un frasco determinado de moscas por el primer TMS de las mismas moscas y restando uno; el valor se expresa como porcentaje de tolerancia, que en nuestro caso es aproximadamente del 50 %. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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