Una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas

Hola, soy Thomas Maples del laboratorio del Dr. Adrian Rothen flu del Departamento de Psiquiatría del Centro Médico UT Southwestern en Dallas. Hoy demostraré un procedimiento sencillo para determinar la sensibilidad de las moscas a la sedación inducida por etanol. Este ensayo se basa en la pérdida del reflejo de enderezamiento y de la capacidad de caminar en las moscas tras la exposición al etanol.

Esta medida puede utilizarse para determinar las diferencias de sensibilidad al alcohol entre distintas cepas de drosófila y mutantes. También podemos usar este ensayo para inducir tolerancia en las moscas, entendiendo la tolerancia como una respuesta reducida al alcohol tras exposiciones repetidas. Comencemos.

Para este experimento, necesitará los siguientes viales. Con ocho moscas de la fruta, un espécimen que haya recolectado uno o dos días antes. Puede realizar las exposiciones con machos o hembras.

Sin embargo, cada vial debe contener solo un sexo. Un vial de alimento vacío que no contenga moscas, una cuchilla, dos tapones de vial hechos de un material similar al algodón. Si no tiene este tipo de tapones, también puede usar bolitas de algodón, una micropipeta de 1000 microlitros con puntas, etanol al 200 grados que contenga colorante alimentario que puede conseguir en cualquier tienda de abarrotes y un temporizador.

Lo primero que debemos hacer es crear una cámara de exposición en la cual expondremos a las moscas al etanol y monitorearemos su movilidad. Para crear esta cámara, primero corte un tapón de vial por la mitad usando una cuchilla de afeitar. Luego, empuje una de las mitades hasta el fondo de un vial, cubriendo la comida.

Esto crea una superficie nivelada y no adhesiva para que las moscas caminen. Si utiliza una bola de algodón, presiónela suavemente y trate de hacerla lo menos peluda posible para que las moscas no queden atrapadas en los hilos de algodón. Si está preparando varias cámaras, asegúrese de que la comida y el tapón del vial ocupen la misma cantidad de espacio en cada cámara.

Esto asegura que las moscas en cada cámara estén expuestas al etanol en el mismo volumen. Con práctica, es fácil exponer tres viales de moscas en paralelo. Una vez que se han preparado las cámaras de exposición, ahora podemos exponer las moscas al etanol.

Primero, transfiera un vial con ocho moscas a una cámara de exposición, sellando la cámara con el tapón del vial que originalmente contenía las moscas. A continuación, aspire con pipeta 500 microlitros de etanol teñido de la concentración elegida y colóquelos en un extremo de un tapón de vial similar a algodón. Luego, sustituya el tapón de la cámara de exposición por el tapón recubierto con etanol, introduciendo en la cámara el extremo recubierto con etanol.

Inmediatamente después de añadir el tapón recubierto de etanol a la cámara de exposición, inicie un cronómetro. El colorante en el etanol ayuda a garantizar que el etanol quede orientado hacia el interior de la cámara de exposición y no hacia la pared del vial. Esto es especialmente importante si se utilizan bolas de algodón en lugar de tapones específicos, ya que cualquier lado de una bola de algodón puede quedar orientado hacia el interior del vial.

En esta exposición, estamos utilizando alcohol al 100 %, que ahora se difunde hacia la cámara de exposición donde las moscas lo inhalan del aire. Cada minuto después de agregar el tapón recubierto con etanol a la cámara de exposición, contaremos cuántas moscas se han vuelto inmóviles, es decir, que son incapaces de darse la vuelta y caminar. Cuanto más tiempo permanezcan móviles las moscas, mayor será su resistencia en cada intervalo de un minuto.

Sorprenda a las moscas golpeando el compartimento sobre la mesa para asegurarse de que todas las moscas que pueden moverse estén en movimiento. Observe las moscas durante 10 segundos después de golpear el compartimento para darles tiempo a comenzar a moverse o darse la vuelta, en cada intervalo de un minuto. Registre cuántas de las ocho moscas están inmóviles al comienzo del experimento.

La mayoría de las moscas correrán rápidamente hacia arriba por el costado del vial tras asustarse. Tras aproximadamente seis minutos de exposición al etanol al 100 %, comienzan a moverse lentamente y a veces de forma errática hacia los 12 minutos. La mayoría de las moscas permanecerán inmóviles, incapaces de caminar o de darse la vuelta cuando estén tumbadas de espaldas.

Solo deben contarse como moscas móviles aquellas que son capaces de enderezarse y caminar; las moscas que simplemente mueven las patas o las alas en el mismo lugar deben contarse como moscas inmóviles. Las moscas que permanecen boca arriba durante todo el período de observación también deben considerarse inmóviles, ya que su incapacidad para enderezarse es un signo de intoxicación. Asimismo, deben contarse como inmóviles las moscas que vibran vigorosamente sus alas durante todo el período de observación de diez segundos, incluso si cambian de posición. La gran mayoría de estas moscas permanece inmóvil entre períodos de movimiento rápido de las alas.

En resumen, las moscas que son capaces de darse la vuelta y caminar son moscas móviles; aquellas que no pueden darse la vuelta, mover sus patas y alas en el lugar o vibrar rápidamente sus alas están inmóviles. Si aplicamos estas reglas, observamos que un mayor número de moscas de tipo silvestre se vuelven inmóviles a medida que aumenta el tiempo de exposición a los vapores de etanol. El valor que este ensayo utiliza para cuantificar la sensibilidad al etanol es el tiempo mediano de sedación o MST.

Definimos el MST como los minutos de exposición al etanol necesarios para que cuatro de las ocho moscas en la cámara de exposición se vuelvan inmóviles. Este valor se determina fácilmente si exactamente cuatro moscas están inmóviles en un período específico de observación. Por ejemplo, si exactamente cuatro moscas están inmóviles tras 11 minutos de exposición, entonces 11 es el MST.

Si exactamente cuatro moscas están inmóviles tras 11 minutos de exposición y lo mismo ocurre a los 12 minutos, entonces tómese el primer valor como el momento en que las moscas alcanzan por primera vez su TS. Si no hay cuatro moscas inmóviles en un período específico de observación, es necesario interpolar linealmente el momento en que cuatro moscas se volvieron inmóviles. Por ejemplo, si el número de moscas inmóviles aumenta de tres a cinco entre los nueve y diez minutos de exposición, puede determinarse gráficamente que el TMS es 9,5. Los siguientes datos recopilados mediante este ensayo muestran que este diseño experimental es una forma precisa de medir la sensibilidad al etanol.

Se utilizaron de seis a ocho viales (N) en los siguientes experimentos, lo cual se indica dentro de las barras. El TMS de moscas macho de tipo silvestre expuestas al 100 % de etanol es aproximadamente de 11 minutos, con un error estándar bajo. La variabilidad de un día a otro es baja y en su mayoría no es estadísticamente significativa, pero aún así recomendamos que mida sus muestras experimentales y controles en paralelo el mismo día.

Téngase también en cuenta que las moscas expuestas el día A y el día B no son los mismos individuos. Se trata de hermanos que representan la misma cepa genética. Las moscas macho y hembra expuestas al 100%Ethanol no muestran diferencias en el MST. Sin embargo, recomendamos ceñirse a un solo sexo.

Si exponemos moscas macho y hembra a dosis crecientes de etanol, obtenemos una curva de respuesta dosis-dependiente que muestra una disminución estadísticamente significativa del MST en función del aumento de la concentración de etanol. Este ensayo también reproduce fenotipos previamente publicados que se midieron con un sistema más elaborado de vaporización de etanol: moscas con la mutación right rabbit one mostraron un aumento significativo en el MST. Este aumento se observó tanto al 100% como al 90% de etanol.

Mediante este ensayo, también podemos inducir y medir la tolerancia al etanol en moscas. La tolerancia se define como una reducción en la respuesta al alcohol tras una exposición previa al alcohol para inducir tolerancia. Exponga un frasco de moscas al etanol durante aproximadamente el doble de su MST.

Por ejemplo, exponemos estos machos de la cepa silvestre Berlin al 100 % de etanol durante 24 minutos. Después de exponerlos, golpee suavemente el tubo para devolver los ocho mosquitos a su vial de alimento, donde los dejará recuperarse durante cuatro horas. Registre el MST original de los mosquitos en su vial tras cuatro horas de recuperación, vuelva a exponer exactamente a los mismos mosquitos a la misma dosis de etanol y registre su segundo MST.

Como puede observarse en este gráfico, el TMS de la segunda exposición al etanol es significativamente mayor que el TMS de la primera exposición, lo que indica que las moscas han desarrollado tolerancia a los efectos sedantes del etanol. Una medida de la tolerancia se calcula dividiendo el segundo TMS de un frasco determinado de moscas por el primer TMS de las mismas moscas y restando uno; el valor se expresa como porcentaje de tolerancia, que en nuestro caso es aproximadamente del 50 %. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.