Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas
14 de febrero de 2011
Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.
El objetivo general de este procedimiento es microinyectar y localizar células de borrelia berg de ferry en el intestino de la garrapata. Esto se logra preparando primero las agujas capilares de vidrio y llenándolas con células Beberg de Ferry. A continuación, las células diferentes de beberg se transfieren al intestino de la garrapata mediante microinyección.
A continuación, se disecciona la garrapata y se extraen los tejidos intestinales. Por último, se realiza el marcaje por inmunofluorescencia de beberg defer en el intestino de la garrapata. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran la localización de beberg para transportar en el intestino de la garrapata utilizando microscopía confocal.
Hola, soy la Dra. Ruth Paul Paul, profesora asistente en el Departamento de Medicina Veterinaria de la Universidad de Maryland. Hoy, dos de mis miembros de laboratorio, Toro Cairo, becario postdoctoral, y Adam Coleman, estudiante de posgrado, les mostrarán el procedimiento para la infección artificial de garrapatas a través de microinyecciones que hacemos rutinariamente en el laboratorio. Después de la microinyección, diseccionaremos la garrapata y tomaremos imágenes de las bacterias en el intestino de la garrapata utilizando un microscopio CE confocal.
La principal ventaja de la microinyección de garrapatas de una generación de garrapatas infectadas naturales es la duración del procedimiento. La microinyección acorta todo el procedimiento de semanas horas, ya que se requieren aproximadamente cinco semanas para generar garrapatas infectadas mediante un proceso de alimentación natural. Esta técnica también se puede adaptar para inyectar otros reactivos útiles como el ARN bicatenario para el ARNi o los antisueros para la interferencia de anticuerpos específicos en el interior de la garrapata.
Para comenzar, fabrique varias agujas de microinyección calentando y tirando de tubos capilares de vidrio de un milímetro en un dispositivo de extracción de micropipetas de vidrio. Retire con cuidado los frágiles tubos capilares. Guarde las agujas agrupadas con la punta hacia arriba sobre cinta adhesiva en una placa de Petri.
A continuación, cultive b berg de ferry en la cultura BSK. Medio a una concentración de aproximadamente 10 a siete células por mililitro de pellet b berg de ferry por centrifugación a 3000 veces G durante 10 minutos. A temperatura ambiente, retire el snat y vuelva a suspender completamente el pellet en medio BSK pasando suavemente a través de una micropunta estéril de 200 microlitros hasta una concentración final de 10 a nueve células por mililitro.
Dado que las células se resuspenden a una alta densidad celular y podrían agruparse, la suspensión celular debe usarse inmediatamente para la microinyección para preparar las garrapatas, coloque cinta adhesiva transparente de doble cara en un portaobjetos de vidrio que trabaje sobre una alfombra adhesiva, retire con cuidado las garrapatas del recipiente Con un cepillo pequeño, coloque la cantidad requerida de garrapatas que se inyectarán en la cinta adhesiva con el lado ventral hacia arriba mirando en la misma dirección. Cargue cinco microlitros del cultivo beberg de ferry en la aguja capilar agrupada. Usando una microcarga de 20 microlitros de punta de pipeta, inspeccione la aguja en busca de burbujas de aire atrapadas y vuelva a cargar la aguja con cultivo bacteriano.
Si es necesario, observe la garrapata bajo el microscopio binocular de disección y concéntrese en el área de apertura anal de la garrapata. Toque suavemente la punta de la aguja capilar para romper el tubo donde el diámetro es ligeramente menor que el de la abertura anal de la garrapata que forma la aguja de microinyección. Este paso es fundamental, ya que cualquier intento de inyectar garrapatas con puntas de aguja inapropiadas causa lesiones y posiblemente la muerte.
A la garrapata inyectada. Coloque las garrapatas inmovilizadas bajo el microscopio binocular de disección y concéntrese en la abertura anal, que está cubierta por dos placas anales móviles. Con pinzas finas, toque suavemente y aplique una presión muy suave en cualquier área cerca de la abertura anal.
Esto permitirá la separación de las placas anales y la apertura del poro anal que se conecta con el intestino. Inserte con cuidado la punta de la aguja ligeramente en la abertura anal a través de la abertura forzada de las placas anales. La inserción de la aguja debe mantenerse al mínimo, ya que la punta de vidrio podría dañar el intestino posterior semitransparente que se conecta al recto.
Utilizando un microinyector equipado con un control de pie automatizado, inyecte la solución de beberg de ferry utilizando los siguientes parámetros: presión de inyección de 1000 Hector Pascals, 0,2 segundos de tiempo de inyección y ocho presiones de compensación de Hector Pascal. Cada garrapata recibe una única inyección después de la microinyección.
La garrapata debe mostrar signos de movimiento o gateo en respuesta a estímulos similares a los que recibía antes de la inyección. Para diseccionar garrapatas para microscopía de inmunofluorescencia, primero coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato en un portaobjetos de vidrio limpio para la disección y otra en un portaobjetos recubierto de poli L lisina Para la microscopía, prepare otro portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva de doble cara. A continuación, retire la garrapata del recipiente y colóquela sobre cinta adhesiva de doble cara.
Usando un cepillo pequeño debajo de la vista del microscopio de disección y concéntrese en la garrapata, coloque una hoja de afeitar afilada en la garrapata entre el primer y el segundo par de patas. Presione firmemente hacia abajo cortando la garrapata en dos piezas, exponiendo el abdomen inmediatamente sumergió el abdomen en una gota de PBS con pinzas finas. Agarra el exoesqueleto dorsal y ventral alrededor del sitio del corte.
Tire con cuidado del escudo dorsal hacia arriba y lejos de la garrapata, exponiendo el diverticular intestinal de color marrón. Tenga cuidado de mantener las garrapatas diseccionadoras debajo del PBS en todo momento. Los haces semitranslúcidos de glándulas sali se encuentran a ambos lados de la región anterior del intestino y se pueden extraer en este punto si se desea.
Sosteniendo el exoesqueleto restante en su lugar con pinzas, extraiga con cuidado el intestino del abdomen. Limpie cuidadosamente el intestino eliminando cualquier tejido atrapado, como la tráquia. Con la punta de unas pinzas finas, transfiera rápidamente el intestino de la garrapata a una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio de poli L lisina.
Separe la tripa en trozos más pequeños con cuchillas finas o presionando suavemente con la punta de unas pinzas finas. Aspire cuidadosamente el exceso de PBS alrededor de los tejidos intestinales. Deje que los tejidos intestinales se sequen al aire y a temperatura ambiente.
Arregla la tripa de la garrapata sumergiéndola en acetona durante 10 minutos. Deje que se seque al aire, los portaobjetos a temperatura ambiente se pueden almacenar en este paso durante meses a menos 20 grados centígrados en un recipiente hermético. Para el marcaje inmunofluorescente del intestino, dibuje un círculo alrededor del intestino fijo de la garrapata con una pluma de Papanicolaou u otro dispositivo de revestimiento de barrera hidrofóbica.
Esto ayudará a retener las soluciones de tinción durante los siguientes pasos de incubación. Cubra el intestino de la garrapata con una o unas gotas de tampón bloqueante durante 30 minutos. A temperatura ambiente.
El suero utilizado para el bloqueo depende de la fuente del animal huésped para el anticuerpo. No permita que el portaobjetos se seque a partir de este punto. Aspire lentamente el tampón de bloqueo.
Incubar el intestino con soluciones adecuadas de anticuerpos primarios y/o secundarios. Utilizamos fluoresceína, isotiocianato o anti B berg marcados con FXI. Diferir el anticuerpo en una dilución de uno a 100 en tampón de bloqueo durante una hora.
A temperatura ambiente, cubra el recipiente con papel de aluminio para limitar la exposición a la luz. Retire la solución de anticuerpos mediante una aspiración suave. Incubar el intestino con un tinte fluorescente para marcar los tejidos de las garrapatas, como DPI o yoduro de propidio.
Normalmente usamos 20 microgramos por mililitro de yoduro de peridio en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, lavamos tres veces con 0.05% entre 20 en PBS durante cinco minutos. Finalmente, monte el portaobjetos en glicerol tamponado que contenga un reactivo Antifa y cúbralo cuidadosamente con una cubierta de vidrio. Los portaobjetos deslizantes se pueden almacenar en este paso durante unos meses a cuatro grados centígrados en una imagen de contenedor hermético y localizarse bajo un microscopio confocal.
Aquí se muestra una microinyección de garrapatas con una aguja llena de azul brillante kumasi para mayor visibilidad. Las pinzas finas se utilizan para aplicar una presión suave sobre el cuerpo, lo que permite la separación de las placas anales y la apertura del poro anal para la microinyección. Aquí, se muestra la región anterior de un divertículo intestinal con un transbordador de Beberg dentro del intestino.
Los núcleos intestinales y las espiroquetas están marcados con yoduro de propidio o anti beberg conjugado de Fitzy, respectivamente. Una vez dominado, hemos descubierto que 10 garrapatas pueden ser micro inyectadas con naturalmente cien mil supervivientes e infectadas con fer. Si bien las garrapatas se pueden usar inmediatamente para otros experimentos, generalmente esperamos uno o dos días para asegurarnos de que las garrapatas sobrevivan al procedimiento antes de continuar.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar garrapatas infectadas artificiales mediante micro insectos de barrera localizados dentro del intestino de la garrapata utilizando flujos inmunológicos confocal. Micro Trabajar con garrapatas y agujas de vidrio finas llenas de un patógeno humano, como los alevines de brelia brior, puede ser peligroso mientras trabaja. Sea consciente de la ubicación de las garrapatas y las agujas y practique las precauciones de nivel dos de bioseguridad en todo momento.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este estudio presenta un método basado en microinyección para infectar garrapatas con Borrelia burgdorferi, reduciendo significativamente el tiempo requerido para la infección de las garrapatas. Además, se demuestra una técnica de inmunofluorescencia para localizar el patógeno dentro de los tejidos de las garrapatas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología de vectores
- Localización de patógenos
Antecedentes
- La enfermedad de Lyme es causada por la bacteria Borrelia burgdorferi.
- Las garrapatas son los vectores principales para transmitir este patógeno.
- Los métodos tradicionales para infectar garrapatas son muy lentos.
- Los métodos de infección rápida pueden mejorar la eficiencia de la investigación.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método más rápido para infectar garrapatas con B. burgdorferi.
- Permitir la localización in situ del patógeno en los tejidos de las garrapatas.
- Mejorar la comprensión de las interacciones entre garrapatas y patógenos.
Métodos utilizados
- Preparación de agujas de capilar de vidrio para microinyección.
- Microinyección de células de B. burgdorferi en el intestino de las garrapatas.
- Disección de garrapatas para aislar los tejidos intestinales.
- Etiquetado por inmunofluorescencia de B. burgdorferi en los tejidos intestinales.
Resultados principales
- Microinyección exitosa de B. burgdorferi en los intestinos de las garrapatas.
- Localización efectiva del patógeno demostrada a través de inmunofluorescencia.
- Resultados visualizados usando microscopía confocal.
- El método reduce significativamente el tiempo para la infección de las garrapatas.
Conclusiones
- La técnica de microinyección es una alternativa viable para la infección de garrapatas.
- La inmunofluorescencia permite una localización precisa de los patógenos.
- Este enfoque puede facilitar la investigación adicional sobre la transmisión de la enfermedad de Lyme.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
