Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

El objetivo general del siguiente experimento es obtener una imagen cuantitativa de una infección en animales vivos que pueda permitir la localización del organismo infeccioso dentro de los tejidos y órganos del huésped. Los ratones anestesiados se infectan primero por vía intratraqueal con bacterias bioluminiscentes. A continuación, a los ratones infectados se les inyecta Luciferino, lo que permite obtener imágenes en vivo en el sistema VIVIS.

Una vez que se han obtenido imágenes de todo el cuerpo, se extraen los pulmones infectados. Se pueden realizar imágenes de los órganos aislados para demostrar la verdadera localización del patógeno. Después de las imágenes, los pulmones se homogeneizan y se diluyen en un medio de crecimiento bacteriano para cuantificar la carga microbiana.

En última instancia, se obtienen resultados que muestran la ubicación y el número de patógenos presentes dentro del huésped en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que los patógenos se pueden visualizar y monitorear en animales vivos mediante imágenes en tiempo real, lo que proporciona información sobre los tics espaciales de la infección microbiana. La Dra. Mihi Chang, becaria postdoctoral en mi laboratorio, y SWAT Cillo, investigadora en mi laboratorio, demostrarán este procedimiento.

Comience por vía intraperitoneal, inyectando a ratones con válvula C de seis a 12 semanas de edad una solución anestésica premezclada que contenga 100 microgramos de ketamina y 10 microgramos de xilacina por gramo de peso del ratón. Vuelva a colocar a los ratones en sus jaulas hasta que el anestésico haga efecto. Para determinar si la anestesia ha sido completa, apriete la almohadilla de cada ratón y asegúrese de que no se produzca ninguna reacción refleja al pedal.

Una vez que los animales estén completamente anestesiados, tome un ratón y colóquelo en la intubación. Párate acostado boca arriba. Use cinta adhesiva para fijar las piernas y los brazos del mouse en el soporte.

Fije una banda elástica al soporte de intubación. A continuación, colócalo debajo de los incisivos superiores del ratón. Una vez que el ratón esté inmovilizado, use fórceps para sacar suavemente la lengua de la boca.

A continuación, inserte suavemente el espéculo con el otoscopio dentro de la boca del ratón y busque la abertura de la laringe, que se encuentra frente al esófago en el lado ventral de la orofaringe. Una vez que se haya identificado la abertura de la laringe, inserte un catéter de una pulgada de calibre 22 que contenga un cable guía en la tráquea hasta que el cubo del catéter llegue a los incisivos. Retire el cable guía y conecte el catéter a la bomba de plástico.

A continuación, introduzca el aire en el catéter. El pecho del ratón se inflará si la intubación es correcta. Una vez confirmada la correcta colocación del catéter, pipetear 50 microlitros de solución bacteriana bioluminiscente a la concentración deseada en el catéter y conectar una jeringa de un mililitro con 50 microlitros de aire para empujar la solución hacia los pulmones del ratón.

Dos o tres veces, retire el catéter y vuelva a colocar al ratón en su jaula para que pueda recuperarse de la anestesia. Antes de realizar las imágenes de bioluminiscencia, anestesiar a los ratones con isoflurano. Una vez que los ratones estén completamente anestesiados, retírelos de la cámara de inducción y aplique suavemente un ungüento óptico para proteger los ojos del animal.

Durante la toma de imágenes, coloque los ratones en la cámara de imágenes cada uno y uno de los conos de la nariz en el colector de anestesia. Use un deflector de luz entre los ratones para evitar el reflejo de la luz entre los sujetos animales adyacentes. Finalmente, inyecte a cada ratón intraperitoneal 150 microgramos por gramo de peso corporal de Lucifer.

Permita que Lucifer se disperse por todo el cuerpo del animal durante 10 minutos. A continuación, comience a tomar imágenes. Inicie el software de imágenes en vivo e inicialice el sistema de imágenes IVIS.

Para establecer primero los parámetros, haga clic en configuración de secuencia. A continuación, seleccione el modo de luminiscencia y fotografía de imagen. Seleccione imágenes fotográficas de luz luminiscente y estructural como parte de la secuencia de imágenes para habilitar la reconstrucción DLIT 3D.

A continuación, establece el tiempo de exposición en un minuto. A continuación, ajuste el binning a medio y el número F a uno. Configure el filtro de excitación en bloque y los filtros de emisión en abierto para la reconstrucción 3D para habilitar múltiples filtros de diferentes longitudes de onda.

Para permitir una localización precisa de la fuente de señal, seleccione el campo de visión correspondiente al número de ratones que se visualizan. Una vez que se hayan definido todos los ajustes, haga clic en Agregar en el asistente de imágenes en el panel de control de adquisición para agregar la configuración de la secuencia y haga clic en Adquirir para comenzar la secuencia de imágenes durante la adquisición. Registre los detalles y las condiciones experimentales en la ventana de edición de imágenes y guarde las imágenes.

Finalmente, retire a los ratones de la cámara de imágenes y devuélvalos a sus jaulas. Monitoree a los animales constantemente hasta que se recuperen de la anestesia. Para obtener imágenes de tejidos, eutanasia humanitaria a los ratones.

En este punto, recoja asépticamente los pulmones de cada ratón y transfiera los órganos a una placa de Petri estéril. Coloque la placa de Petri que contiene los pulmones infectados dentro de la cámara de imágenes y adquiera imágenes de bioluminiscencia de la misma manera que se describió anteriormente en este video. Una vez obtenidas las imágenes, se retira la placa de Petri de la cámara de imagen y, con pinzas estériles, se transfieren los pulmones a un tubo que contiene un mililitro de PBS estéril utilizando un homogeneizador, se homogeneizan los pulmones durante dos a cinco minutos.

Preparar la dilución en serie de los homogeneizados pulmonares en PBS estéril. A continuación, coloque 100 microlitros de cada dilución en placas de Petri que contengan medio selectivo. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados hasta que las colonias bacterianas sean claramente visibles.

A continuación, cuente las UFC para evaluar el nivel de infección. Inicie el software de imagen viva y abra los archivos de imagen deseados desde el explorador de archivos. En la paleta de herramientas.

Haga clic en ajustar imagen para modificar la configuración de corrección y filtrado, así como los umbrales de la escala de colores. Para cuantificar la intensidad de la luminiscencia, utilice la región de interés o las herramientas de ROI de la lista desplegable, seleccione el número de forma y el tamaño del ROI. A continuación, haga clic en Medición del ROI y guarde la salida de datos cuantitativos para reconstruir imágenes 3D.

Primero, cargue la secuencia de imágenes, incluidas las imágenes de luz estructurada. Haga clic en Topografía de superficie en la paleta de herramientas. A continuación, en la lista desplegable, seleccione la pestaña reconstruir para generar una topografía de superficie.

A continuación, seleccione Reconstrucción 3D de DILT en la paleta de herramientas. Haga clic en la pestaña de propiedades en la lista desplegable y establezca las propiedades del tejido y el espectro de origen en el músculo. Haga clic en la pestaña analizar y seleccione la longitud de onda para el análisis.

A continuación, haga clic en Inicio. Una vez que se hayan ajustado todos los ajustes, haga clic en reconstruir para iniciar el análisis 3D. Cuando se complete la reconstrucción 3D, seleccione la vista 3D para mostrar los resultados haciendo clic en la pestaña de resultados, se puede ver la densidad de fotones, los vóxeles de datos y los parámetros del algoritmo, guardar los resultados y exportar los datos y las imágenes para su posterior análisis.

Como se muestra en esta figura, los dos ratones de la derecha que fueron infectados intratraquealmente con 10 a la sexta UFC de bacterias bioluminiscentes producen una fuerte señal desde el área pulmonar, mientras que el ratón no infectado de la izquierda no lo hace. Un análisis similar, utilizando solo pulmones disecados de ratones infectados, confirma que la luminiscencia emana de los pulmones en lugar de algún otro tejido estrechamente yuxtapuesto. La señal que emana de la muestra se puede cuantificar fácilmente como flujo total dentro de una región de interés.

Un análisis tomográfico confirma que la posición de la luminiscencia que se muestra en estas imágenes como cajas rojas se encuentra dentro del área que contiene los pulmones del ratón, según lo determinado por la reconstrucción 3D. Finalmente, la similitud entre la curva de densidad de fotones medida a la izquierda y la curva de densidad de fotones simulada a la derecha atestigua la buena calidad de la reconstrucción. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de animales infectados con precedentes y analizar las imágenes para la localización y cuantificación de la reminiscencia.