Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales
4 de abril de 2011
Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo real, In vivo Estudio de la microvasculatura de los ganglios linfáticos y la estructura tanto en la homeostasis y la infección. Esta técnica se puede adaptar a los estudios de tráfico celular y otros sitios de ganglios linfáticos.
El objetivo general de este procedimiento es visualizar y evaluar in vivo la arteria que irriga el ganglio linfático inguinal. Esto se logra primero creando un colgajo de piel mediante la disección cuidadosa de la piel en la región inguinal del ratón, que cubre el ganglio linfático inguinal. Luego, se separa el tejido conectivo que recubre la zona del ganglio linfático.
A continuación, debe eliminarse el tejido adiposo circundante para exponer la vasculatura arterial de aferencia del ganglio linfático. Finalmente, los cambios en la vasculatura del ganglio linfático se visualizan y evalúan mediante microscopía intravital P. Aunque la preparación que observarán hoy es la microcirculación del ganglio linfático inguinal, las técnicas quirúrgicas pueden utilizarse también para otras preparaciones, como el músculo esquelético y el cerebro.
Generalmente, al realizar esta técnica, las personas nuevas tienen dificultades por dos razones principales. La primera es que se trabaja con un animal vivo, y la segunda es que, al realizar una cirugía en un área muy pequeña, cualquier tipo de perturbación en el vaso mismo o en la zona circundante podría tener un impacto negativo, lo cual sería perjudicial para el experimento que se desea realizar. La demostración visual de esta técnica es fundamental para el éxito.
Existen varios pasos complejos que están involucrados y que no se traducen fácilmente del texto a la ejecución práctica de la técnica. Es importante verla para poder realizarla correctamente. Con mucho éxito.
Primero se anestesia al ratón y se afeita el área quirúrgica. Consulte el manuscrito de texto para obtener más detalles. Luego, el ratón puede colocarse sobre una tabla quirúrgica transparente en posición supina.
Sujete el ratón a la tabla fijando con cinta adhesiva cada almohadilla de las patas. El día anterior al experimento, mezcle el Thes Guard 180 4 según las instrucciones del fabricante. Luego, utilizando un plato de Petri desechable estándar como molde, vierta la mezcla hasta una profundidad de aproximadamente un cuarto de pulgada y déjela curar durante la noche. Retire el Thes Guard del plato de Petri y colóquelo sobre la tabla quirúrgica.
Coloque el ratón afeitado y anestesiado bajo el microscopio de disección. Realice una incisión media a lo largo de la superficie ventral de la cavidad abdominal utilizando pinzas de acero inoxidable número cinco y tijeras de hoja recta con muelle. A continuación, continúe la incisión media en diagonal hacia las extremidades y retire la piel hacia la columna espinal prominente.
Una vez que el ln sea fácilmente visible, sujete la piel retraída utilizando alfileres de insecto de acero inoxidable y pinzas recubiertas de epoxi inox sobre el pedestal 180 4. Añada solución salina fisiológica o PSS a la zona.
A continuación, retire la delgada capa de tejido conectivo que recubre la zona alrededor del ganglio linfático (ln). Con pinzas, levante cuidadosamente pequeños fragmentos de tejido conectivo y separelos del ln. Luego, con tijeras de resorte, elimine el tejido adiposo que recubre y rodea el ganglio linfático hasta exponer el lecho microvascular.
Para este paso, es importante tener cuidado de no hacer contacto nunca con la vasculatura de interés mediante instrumentos quirúrgicos ni lesionar los vasos al aplicar demasiada fuerza sobre ellos al manipular el tejido circundante. Es preferible eliminar la grasa del ganglio linfático aflojando el tejido conectivo, sosteniendo el tejido adiposo con pinzas y luego retirando suavemente el tejido adiposo hasta que el campo de visión quede despejado. Una vez que se han eliminado los tejidos conectivo y adiposo, puede visualizarse el segmento arterial principal adyacente al ganglio linfático y la vena acompañante que lo recubre.
Una vez que se haya expuesto el segmento vascular de interés bajo el microscopio de disección, fije la preparación en el microscopio intravital. Configure las líneas de superfusión y succión. Durante esta parte del procedimiento, es esencial que el tejido expuesto se mantenga siempre en superfusión con la solución de PSS equilibrada.
La superperfusión con PSS ocurre por gravedad. Aliméntese desde un reservorio inicial hacia un reservorio calentado por camisa de agua que se perfunde con 5% de dióxido de carbono en equilibrio con nitrógeno, y luego hacia abajo por una línea de goteo a una velocidad de 10 mililitros por minuto. Se debe utilizar una línea de succión para seguir retirando el PSS superperfundido de la preparación colocándola en la parte inferior del colgajo de piel; luego se debe verificar y ajustar la temperatura del baño de agua circulante y la velocidad de la superperfusión con PSS para alcanzar una temperatura óptima de aproximadamente 36 grados Celsius.
Durante la preparación, permita que la vasculatura se equilibre con PSS durante al menos 60 minutos. Asegúrese de que el animal no sufra hipotermia utilizando un termómetro rectal y proporcione una lámpara de calor externa. Mientras el PSS se está equilibrando, cuantifique el diámetro del vaso sanguíneo.
Utilice los calibradores de video en múltiples puntos temporales para asegurar que el vaso se haya estabilizado; la estabilización se define como el mantenimiento constante del tamaño del diámetro dentro de cinco micrómetros durante un período de 20 minutos. Las mediciones del diámetro se registran en una computadora utilizando el software Chart Lab. Después del período de equilibrio, evalúe la salud del vaso mediante un agonista específico para el músculo liso, como la fenilefrina, tal como se muestra aquí con fenilefrine.
Añada el agonista al suse. Se deben evaluar ocho agonistas en cada log, aumentando la concentración acumulativa del agonista a medida que se añade al destino SUP entre las administraciones de cada agonista. Se debe realizar una fase de lavado con PSS durante 30 minutos o hasta que el vaso regrese al diámetro de reposo.
A continuación se muestran resultados representativos de un ganglio linfático inguinal tras el período de equilibración. La perfusión de la arteria con solución salina fisiológica produce una imagen nítida que permite identificar tanto la arteria de aporte, indicada aquí por la flecha roja, como la vena, indicada por la flecha verde, que irrigan el ganglio linfático inguinal. El gráfico muestra una respuesta vasoactiva típica de una arteria aferente inguinal frente a la adición acumulativa de fenilefrina SUP fusionada a la solución salina fisiológica.
Desde una concentración de 10 a la menos nueve molar hasta 10 a la menos cinco molar, la presencia de una vasoconstricción robusta sugiere una función normal del músculo liso presente en la arteria. En esta gráfica, se muestra una respuesta vasoactiva típica a la adición acumulativa de acetilcolina en solución salina fisiológica, desde una concentración de 10 a la menos nueve molar hasta 10 a la menos cinco molar.
La presencia de una vasodilatación robusta sugiere una función endotelial normal presente en la arteria. Al intentar este procedimiento, uno de los aspectos clave que debe recordarse es minimizar la perturbación del vaso y de la zona circundante para maximizar el éxito. Tras este procedimiento, pueden introducirse otros métodos, como la fluorescencia, para explorar otras funciones celulares, tales como el tráfico celular.
Tras el desarrollo de esta técnica, se allanó el camino para unir los campos de la inmunología y la biología vascular en un nuevo campo: la inmunología vascular.
Descripción general
Este artículo describe una técnica para realizar microscopía intravital del ganglio linfático inguinal, lo que permite el estudio en tiempo real y en vivo de la microvasculatura y la estructura del ganglio linfático durante la homeostasis y la infección. El método puede adaptarse para estudios de tráfico celular y otros sitios de ganglios linfáticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Imagenología microvascular
- Microscopía intravital
Antecedentes
- La microscopía intravital permite la visualización de tejidos vivos.
- El ganglio linfático inguinal es fundamental para los estudios de respuesta inmunitaria.
- Comprender la vasculatura del ganglio linfático es importante para diversas investigaciones biológicas.
- Las técnicas pueden aplicarse a otros tejidos como el músculo esquelético y el cerebro.
Objetivo del estudio
- Visualizar y evaluar in vivo la arteria que alimenta el ganglio linfático inguinal.
- Evaluar los cambios en la vasculatura del ganglio linfático durante diferentes estados fisiológicos.
- Proporcionar una guía detallada del procedimiento para investigadores.
Métodos Utilizados
- Creación de un colgajo cutáneo para exponer el ganglio linfático inguinal.
- Diseción de los tejidos conectivo y adiposo que rodean el ganglio linfático.
- Uso de microscopía intravital para visualizar el lecho microvascular.
- Administración de solución salina fisiológica para condiciones óptimas de imagen.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de la vasculatura del ganglio linfático inguinal.
- Demostración de la función normal del músculo liso en la respuesta arterial.
- Evaluación cuantitativa de la estabilidad del diámetro vascular.
- Identificación clara de las estructuras arteriales y venosas que irrigan el ganglio linfático.
Conclusiones
- La técnica proporciona información crítica sobre la microcirculación de los ganglios linfáticos.
- Las demostraciones visuales mejoran la comprensión de los pasos quirúrgicos complejos.
- Este método puede adaptarse para diversos diseños experimentales en biología vascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía intravital del ganglio linfático inguinal permite la visualización en tiempo real de la dinámica microvascular, fundamental para comprender el tráfico de células inmunitarias y las interacciones entre el sistema vascular y el inmunitario. Esta técnica facilita la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento, al proporcionar lecturas funcionales y cuantitativas de la salud vascular y la respuesta funcional en condiciones fisiológicas. Sirve de nexo entre la inmunología y la biología vascular, ofreciendo un valor predictivo para la validación de dianas en programas de investigación sobre inflamación, infección e inmuno-oncología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de respuestas microvasculares en tiempo real a agentes vasoactivos, apoyando la validación funcional de dianas.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cuantitativas del diámetro vascular que sirven como biomarcadores reproducibles de la función vascular en modelos de enfermedad.
- Confianza predictiva: Evalúa la función del músculo liso y del endotelio, ayudando a reducir el riesgo asociado a dianas implicadas en la regulación vascular y el reclutamiento de células inmunitarias.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de la función y estabilidad vascular basal antes de la prueba de compuestos.
- Valor operativo: Apoya la estandarización de ensayos mediante protocolos controlados de superfusión y criterios de estabilización (diámetro dentro de 5 µm durante 20 min), asegurando una evaluación confiable de compuestos.
- Escalabilidad: Permite la obtención de imágenes longitudinales durante varias horas, facilitando la evaluación de respuestas dependientes del tiempo en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el monitoreo longitudinal de las respuestas vasculares en modelos relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de la funcionalidad vascular, un determinante clave de la eficacia de la respuesta inmune en los ganglios linfáticos.
- Alineación de biomarcadores traslacionales: El diámetro y la reactividad vascular sirven como biomarcadores traslacionales que se correlacionan con el tráfico de células inmunitarias y la función del ganglio linfático.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, proporcionando lecturas funcionales vasculares que orientan la selección de dianas y la comprensión mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la observación directa de las interacciones microvasculares-inmunitarias durante la homeostasis y su alteración.
- Selección: Proporciona preparación para ensayos mediante una vascularización estabilizada y resultados cuantitativos (diámetro, reactividad) que permiten comparaciones entre condiciones experimentales.
- Análisis: Genera resultados mensurables, incluidos cambios en el diámetro vascular y respuestas de vasoconstricción/vasodilatación, lo que posibilita la comparación estadística de los efectos de los tratamientos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar las contribuciones vasculares a la respuesta inmunitaria, relevante para el desarrollo de adyuvantes y moduladores inmunitarios.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología intravital reutilizable, aplicable en múltiples sitios de ganglios linfáticos y modelos de enfermedad, maximizando la inversión en infraestructura.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la comunicación vascular-inmune.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y la reproducibilidad mediante la superfusión controlada, la regulación de la temperatura y los criterios de estabilización.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos vasculares funcionales que reducen el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas inmunomoduladores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en datos de funcionalidad vascular, apoyando el avance eficiente en términos de capital.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía e imagenología intravital para minimizar la perturbación vascular durante la preparación del tejido.
- Depende de un sistema de microscopía intravital equipado con líneas de superfusión y succión para mantener condiciones de imagen estables.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de cuantificación vascular (por ejemplo, la medición del diámetro mediante calibradores de video) para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar la técnica en otros sitios de ganglios linfáticos o tejidos, como el músculo esquelético o el cerebro.
- Está limitado por la dificultad técnica de mantener una vasculatura viable durante períodos prolongados de imagen, lo que requiere una gestión cuidadosa de la temperatura y la perfusión.
