Name: La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a crear embriones quiméricos mediante trasplante de ectodermo en embriones de pollo para estudiar la señalización y patronaje del ectodermo cefálico superficial durante el desarrollo craneofacial.

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Este trabajo fue financiado por R01-R01 DE018234 y DE019638.

1. Preparación del tejido de un donante <ol><li> Preparar medios de cultivo, afilar pernos de vidrio, afilar agujas de tungsteno. </li><li> Recoger embrión a partir de cáscara, lavado en PBS helado. <ol class="lalpha"><li> Con una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 18 extraer 1,0 ml de albúmina en la punta de la cáscara del huevo. </li><li> Haz un pequeño agujero en la parte superior de la misma utilizando el punto de tijeras, y luego se corta una abertura circular para exponer el embrión </li></ol></li><li> Quitar la cabeza y el lugar en DMEM (libre de suero, la temperatura ambiente) </li><li> Diseccionar proceso frontonasal del embrión (o en el sitio de otros donantes como el proceso maxilar o mandibular) </li><li> Compendio de 2.4U / mL dispasa en PBS en hielo durante 20 minutos </li><li> Cubrir los tejidos con DMEM con BSA al 1% para detener la digestión </li><li> El uso de agujas afiladas de tungsteno para ectodermo separado, mesénquima, y ​​neuroectodermo </li><li> Tienda de injerto de tejido en DMEM BSA al 1% en el hielo hasta el ordenador está listo para el trasplante </li></ol> 2. La preparación de la acogida <ol><li> Exponer el embrión <ol class="lalpha"><li> Con una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 18 extraer 1,0 ml de albúmina en la punta de la cáscara del huevo. </li><li> Haz un pequeño agujero en la parte superior de la misma utilizando el punto de tijeras. Coloque un pedazo de cinta adhesiva sobre el agujero, y luego se corta una abertura circular para exponer el embrión. </li></ol></li><li> Utilizando dos pares de pinzas, sujete el amnios y el desgarro con cuidado para hacer un agujero. </li><li> Gire la cabeza colocando un par de pinzas en el ojo derecho y la aplicación de presión. Mientras mantiene la cabeza firme, utilice una aguja de tungsteno para eliminar el ectodermo de acogida para dar cabida a la corrupción. </li><li> Transferencia del injerto al huésped con una pipeta de vidrio. </li><li> La posición del injerto para reemplazar el ectodermo eliminado. Inserte un vaso en cada esquina del tejido injertado para fijar el injerto en su lugar. Para hacer alfileres de cristal, tirar de un tubo capilar a una punta fina sobre una llama de alcohol. </li><li> Coloque cinta firmemente sobre el agujero y volver embrión de la incubadora de tiempo adecuado para el análisis. </li><li> véase también: 9 </li></ol> 3. Los resultados representativos: Para evaluar las quimeras, los embriones deben ser recogidos y procesados ​​para el análisis de la distribución de los anfitriones y los tejidos del donante. Para la detección de células de codorniz, inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo QcPN (que se describe en: 3) se emplea, y para la detección de células de ratón, hibridación in situ en secciones de parafina se utilizan 6. Las células del donante se debe restringir al epitelio, y no debe haber evidencia de donantes tejidos mesenquimales (Figura 1). La presencia de células del donante aislado en el mesénquima indica la presencia de células de la contaminación de la cresta neural que confundir cualquier interpretación morfológica debido a la influencia de estas células en muchos aspectos del desarrollo facial (por ejemplo, 10). Una vez convencidos de que la técnica de injerto libre de contaminantes mesénquima, las medidas de resultado más morfológicos o moleculares se pueden utilizar para evaluar las quimeras. Para nuestros propósitos, hemos detectado la presencia de los cartílagos y los huesos ectópico que se correspondía con la duplicación de la mandíbula superior que fueron inducidos por los tejidos trasplantados (Figura 2), y los cambios moleculares en los tejidos mesenquimales en respuesta a la ectodermo injerto (Figura 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Evaluación de quimerismo (A) Anti-manchas QcPN se utiliza para detectar células de codorniz en la codorniz, pollo quimeras. No hay evidencia de manchas en el mesénquima. (B) La hibridación in situ se utiliza para detectar la expresión de las transcripciones B2 SINE en quimeras pollo ratón. Expresión está restringida al ectodermo que incluye el injerto. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Tinción de la figura 2. Tricrómica muestra la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior en (A) de codorniz-chick quimera, y (B) quimeras pollo ratón. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El ectodermo regultes la expresión de genes en el mesénquima. (A) Normal BMP7 expresión en el mesénquima de un embrión de pollo (radiactivos hibridación in situ con señal positiva pseudo-color rojo en Adobe Photoshop). (B) la expresión BMP7 se induce en el mesénquima adyacente al injerto (flecha) en embriones quiméricos.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

El uso de este método de trasplante nos ha permitido determinar que el ectodermo contiene información de señalización que regula la polaridad dorsoventral y extensión proximodistal de la mandíbula superior. La similitud de resultados cuando se utiliza la codorniz o ectodermo del ratón, y la conservación de las señales moleculares en este tejido, entre muchas especies de 6,11 indica que este es un centro altamente conservadas de señalización entre los vertebrados. Por otra parte, otros investigadores han utili...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcapilar</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Portacuchillas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

la evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

La accesibilidad de los embriones de aves ha ayudado a los embriólogos experimentales entender el destino de las células durante el desarrollo y el papel de las interacciones de los tejidos que regulan los patrones y la morfogénesis de los vertebrados (por ejemplo, 1, 2, 3, 4). Aquí, se expone un método que explota esta accesibilidad a la prueba de la señalización y las propiedades de los patrones de tejidos del ectodermo durante el desarrollo facial. En estos experimentos, se crea la codorniz-chick chick 5 o 6 quimeras de ratón mediante el trasplante de la superficie ectodermo cefálico que cubre la mandíbula superior de la codorniz o el ratón sobre cualquiera de la misma región o de una región ectópica de embriones de pollo. El uso de la codorniz como tejido de un donante para el trasplante en los pollos se ha desarrollado para tomar ventaja de un marcador nucleolar presente en la codorniz, pero no las células de pollo, lo que permite a los investigadores distinguir anfitrión y tejidos de donantes 7. Del mismo modo, un elemento repetitivo está presente en el genoma del ratón y se expresa doquier, lo que nos permite distinguir anfitrión y tejidos de donantes en el ratón-chick quimeras 8. El uso de ectodermo ratón como donantes de tejidos en gran medida ampliar nuestra comprensión de estas interacciones de tejidos, ya que esto nos permitirá poner a prueba las propiedades de señalización del ectodermo derivan de varios embriones mutantes.

En este artículo se describe una técnica de trasplante de tejido que se diseñó para probar la señalización y las propiedades de los patrones de la superficie del ectodermo cefálico durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

La accesibilidad de los embriones de aves ha ayudado a los embriólogos experimentales a comprender el destino de las células durante el desarrollo y la función del tejido...

El objetivo general de este procedimiento es crear embriones quiméricos mediante el trasplante de ectodermo de embriones donantes a la mandíbula superior en desarrollo de embriones de pollo. Esto se logra primero eliminando el dermis donante para su trasplante. Luego, se prepara el sitio receptor para el injerto.El paso final del procedimiento consiste en colocar el tejido donante en el sitio receptor y fijar el injerto en su posición. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el injerto exclusivo del ectodermo donante, y mediante análisis moleculares y morfológicos, puede determinarse la función del ectodermo donante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como identificar el papel de diversos tejidos durante la morfogénesis.La doctora Diane, investigadora principal de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los medios y asegúrese de que todas las soluciones necesarias estén disponibles y a la temperatura correcta. Luego, mientras usa protección ocular adecuada, estire tubos capilares microscópicos hasta obtener una punta fina sobre una llama de alcohol.Para fabricar alfil

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Investigación

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Cartílagos craneofaciales en estrecho contacto con otros tejidos, y son difíciles de manipular en animales vivos. Estamos utilizando electroporación para ofrecer herramientas moleculares durante el crecimiento del esqueleto craneofacial sin pasar por los primeros efectos de embriones. Este enfoque nos permite analizar de manera eficiente las moléculas...

Electroporación de mesénquima craneofacial

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues...

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

Un protocolo para la separación de ectodermo y el mesénquima facial embrión se describe. Utilizamos Dispasa II para el tratamiento de embriones enteros en primer lugar, analizar las prominencias faciales completas, y luego separar el ectodermo facial y mesénquima.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

Una técnica para el trasplante "Extreme anterior Dominio" tejido facial entre Xenopus laevis embriones se ha desarrollado. Los tejidos pueden moverse de un fondo de la expresión génica en otro, lo que permite el estudio de las necesidades locales para el desarrollo craneofacial y de señalización interacciones entre las regiones faciales.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial.

Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

Se describen los protocolos que utilizan barreras impermeables para bloquear los eventos de inducción entre los tejidos del eje principal del cuerpo y el flanco en el embrión de pollo necesarios para la formación de las extremidades. Las perlas empapadas en señales inductivas candidatas se utilizan para superar el efecto de la colocación de barreras y el análisis de la expresión génica lo confirma.

La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial mediante inmunoutilización utilizando tejidos craneofaciales de ratón como ejemplos. Además, describimos un método para la preparación y criosección de tejidos duros no descalcificados de ratones jóvenes para inmunostaining.

Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Aprende a crear embriones quiméricos mediante trasplante de ectodermo en embriones de pollo para estudiar la señalización y patronaje del ectodermo cefálico superficial durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

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