La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

El objetivo general de este procedimiento es crear embriones quiméricos mediante el trasplante de ectodermo de embriones de donantes a la mandíbula superior en desarrollo de embriones de pollo. Esto se logra extrayendo primero la dermis del donante para el trasplante. A continuación, se prepara el sitio anfitrión para el injerto.

El paso final del procedimiento es colocar el tejido del donante en el sitio del huésped y colocar el injerto en su posición. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un injerto exclusivo del ectodermo del donante, y a través del análisis molecular y morfológico, se puede determinar la función de la dermis de recod del donante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como la identificación del papel de varios tejidos durante la morfogénesis.

La demostración del procedimiento estará a cargo de la Dra. Diane, investigadora principal de nuestro laboratorio. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los medios y asegúrese de que todas las soluciones requeridas estén accesibles y a la temperatura correcta. Luego, mientras usa la protección ocular adecuada, tire de los tubos microcapilares hasta un punto fino sobre una llama de alcohol.

Para hacer alfileres de vidrio, afila las agujas de tungsteno sosteniéndolas en la llama de un soplete de propano. Comienza la extracción del embrión donado de la cáscara colocando un trozo de cinta adhesiva sobre el extremo del óvulo. Luego, usa la punta de una aguja de disección para crear un pequeño agujero en el centro de la cinta.

Inserte una jeringa de 10 mililitros y una aguja hipodérmica de calibre 18 en el orificio y retire un mililitro de albúmina del huevo. Luego, con una aguja de disección, haz un pequeño agujero en la parte superior de la concha. Coloca un segundo pedazo de cinta adhesiva para cubrir este agujero.

Corta una abertura circular en el huevo con dos pares de pinzas. Agarre el embrión y colóquelo en un plato de PBS helado para lavarlo. Después de que se haya extraído la cabeza del embrión, colóquelo en una placa de cultivo de tejidos que contenga DMEM a temperatura ambiente y sin suero.

Coloque el plato bajo el microscopio de disección mientras sostiene la cabeza con pinzas. Use tijeras de resorte para diseccionar la mandíbula superior y lagón del resto de la cabeza. Luego, usando un soporte de cuchilla con una cuchilla de afeitar afilada, recorte el proceso nasal frontal de la mandíbula superior.

Utilice una pipeta para transferir el proceso nasal frontón a una placa de Petri de 30 milímetros que contenga un volumen suficiente de diss en PBS e incube en hielo durante 20 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspirar la solución de dispa sin alterar el tejido. A continuación, cubra completamente los tejidos con DMEM que contenga un 1% de BSA.

Para detener la digestión, transfiera el tejido a una nueva placa de cultivo. Luego trabajando bajo un microscopio de disección. Sujete el pañuelo con una aguja de tungsteno sin afilar con una aguja de tungsteno afilada.

Separa el ectodermo separándolo de los otros tejidos. Una vez preparado, almacene el tejido del injerto en DMEM con BSA en hielo hasta que el huésped esté listo para el trasplante. Usando el método demostrado anteriormente, cree una ventana en el huevo de gallina.

Coloque el óvulo que contiene el embrión bajo el microscopio de disección con dos pares de pinzas. Agarre la membrana IGN y el amnios y rasgue suavemente para hacer un agujero y exponer al embrión huésped. Gire la cabeza colocando un par de pinzas en el ojo derecho y aplicando presión mientras mantiene la cabeza firme.

Use una lengua y una aguja para extraer la dermis del huésped y acomodar el injerto. Agregue dos microlitros de rojo neutro a la placa de Petri que contiene los injertos preparados. Use una pipeta de vidrio para transferir el injerto al huésped.

Coloque el injerto en posición para reemplazar el ectodermo extraído. Inserte un alfiler de vidrio en cada esquina del tejido injertado para fijar el injerto en su lugar después del injerto. Cierre la ventana herméticamente con cinta adhesiva.

Regrese el embrión a la incubadora hasta la etapa de desarrollo requerida para el análisis, esta imagen muestra tejido de un polluelo de codorniz URA que ha sido teñido con anticuerpo específico anti Q-C-P-N-A de codorniz. El tejido injertado se encuentra entre las dos flechas. No hay evidencia de tinción de QCPN en el tejido tipo meen de un espejo de campanilla de polluelo de ratón se ve aquí Nuevamente, el tejido injertado se encuentra entre las dos flechas en la hibridación C dos con secuencia repetitiva específica aprobada para el signo B dos.

Al reflejar, los genes de la clase uno revelan que la expresión del signo B, dos, está restringida al oma que comprende el injerto, que se muestra aquí como una imagen de un espejo de campanilla de polluelo de codorniz que ha sido teñido con tricrómico, la tinción de tricromo hace que el colágeno y el hueso sean de color. La duplicación del esqueleto de la mandíbula superior se ve como lo indica la flecha. Esta imagen muestra un espejo de campanilla de polluelo de ratón que ha sido teñido de tricromía nuevamente.

Se observa una duplicación del esqueleto de la mandíbula superior. Esta imagen muestra la hibridación radiactiva en C dos de la expresión normal de BMP siete en el mechy de un embrión de pollo en balsa, que se muestra aquí es tejido de un espejo de campana de polluelo de ratón. Se puede ver que la expresión de BMP siete se induce en el mecanismo adyacente al injerto como lo indica la flecha.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular embriones de pollo para evaluar los mecanismos que regulan el desarrollo del proceso frontal y nasal.