La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

El objetivo general de este procedimiento es crear embriones quiméricos mediante el trasplante de ectodermo de embriones donantes a la mandíbula superior en desarrollo de embriones de pollo. Esto se logra primero eliminando el dermis donante para su trasplante. Luego, se prepara el sitio receptor para el injerto.

El paso final del procedimiento consiste en colocar el tejido donante en el sitio receptor y fijar el injerto en su posición. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el injerto exclusivo del ectodermo donante, y mediante análisis moleculares y morfológicos, puede determinarse la función del ectodermo donante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como identificar el papel de diversos tejidos durante la morfogénesis.

La doctora Diane, investigadora principal de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los medios y asegúrese de que todas las soluciones necesarias estén disponibles y a la temperatura correcta. Luego, mientras usa protección ocular adecuada, estire tubos capilares microscópicos hasta obtener una punta fina sobre una llama de alcohol.

Para fabricar alfileres de vidrio, afílese agujas de tungsteno sosteniéndolas en la llama de un soplete de propano. Comience la extracción del embrión donante desde el cascarón colocando un trozo de cinta adhesiva sobre el extremo del huevo. Luego, use la punta de una aguja de disección para crear un pequeño orificio en el centro de la cinta.

Inserte una jeringa de 10 mililitros y una aguja hipodérmica de calibre 18 en el orificio, y retire un mililitro de albúmina del huevo. Luego, utilizando una aguja de disección, haga un pequeño orificio en la parte superior del cascarón. Coloque un segundo trozo de cinta adhesiva para cubrir este orificio.

Corte una abertura circular en el huevo utilizando dos pares de pinzas. Sujete el embrión y colóquelo en un recipiente con PBS frío con hielo para lavarlo. Después de que se haya eliminado la cabeza del embrión, colóquela en un recipiente de cultivo celular que contenga DMEM sin suero a temperatura ambiente.

Coloque el recipiente bajo el microscopio de disección mientras sostiene la cabeza con pinzas. Utilice tijeras de resorte para diseccionar groseramente la mandíbula superior y el lagon del resto de la cabeza. Luego, usando un portacuchillas con una cuchilla de afeitar afilada, corte el proceso nasal frontal de la mandíbula superior.

Utilice una pipeta para transferir el proceso nasal frontonasal a una placa de Petri de 30 milímetros que contenga un volumen suficiente de disolución en PBS e incube en hielo durante 20 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspire la solución sin perturbar el tejido. A continuación, cubra completamente los tejidos con DMEM que contenga 1 % de BSA.

Para detener la digestión, transfiera el tejido a una nueva placa de cultivo. A continuación, trabaje bajo un microscopio estereoscópico. Sujete el tejido con una aguja de tungsteno no afilada utilizando una aguja de tungsteno afilada.

Se pare el ectodermo separándolo de los demás tejidos. Una vez preparado, almacene el tejido de injerto en DMEM con BSA sobre hielo hasta que el huésped esté listo para el trasplante. Utilizando el método previamente demostrado, cree una ventana en el huevo de pollo.

Coloque el huevo que contiene el embrión bajo el microscopio estereoscópico utilizando dos pares de pinzas. Sujete la membrana IGN y el amnios y desgarre suavemente para hacer un orificio y exponer el embrión huésped. Gire la cabeza colocando un par de pinzas sobre el ojo derecho y aplicando presión mientras mantiene la cabeza firme.

Utilice una pinza y una aguja para retirar la dermis del huésped y así acomodar el injerto. Añada dos microlitros de rojo neutro a la placa de Petri que contiene los injertos preparados. Utilice una pipeta de vidrio para transferir el injerto al huésped.

Coloque el injerto en posición para reemplazar el ectodermo eliminado. Inserte una aguja de vidrio en cada esquina del tejido injertado para fijar el injerto en su lugar tras el injerto. Cierre la ventana firmemente con cinta adhesiva.

Devuelva el embrión al incubador hasta alcanzar la etapa de desarrollo requerida para el análisis. Esta imagen muestra tejido de un embrión de codorniz URA que ha sido teñido con el anticuerpo específico para codorniz anti Q-C-P-N-A. El tejido injertado se encuentra entre las dos flechas. No hay evidencia de tinción QCPN en el tejido meen kind de una quimera de ratón-codorniz que se observa aquí. Nuevamente, el tejido injertado se localiza entre las dos flechas en C, dos hibridaciones con secuencias repetitivas específicas para la señal B.

El análisis de los genes de clase uno revela que la expresión del marcador B2 está restringida al ome que comprende el injerto mostrado aquí como una imagen de un quimérico de codorniz y pollo, cuya tinción tricrómica colorea en azul el colágeno y el hueso. Se observa la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior, tal como indica la flecha. Esta imagen muestra un quimérico de ratón y pollo, nuevamente teñido con tinción tricrómica.

Se observa la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior. Esta imagen muestra la hibridación por radioactividad en C dos de la expresión normal de BMP siete en el mequi de un embrión de pollo injertado, mostrado aquí como tejido de un quimérico ratón-pollo espejo. Puede observarse que la expresión de BMP siete se induce en el mequi adyacente al injerto, como indica la flecha.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular embriones de pollo para evaluar los mecanismos que regulan el desarrollo del proceso frontal y nasal.