Name: La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a crear embriones quiméricos mediante trasplante de ectodermo en embriones de pollo para estudiar la señalización y patronaje del ectodermo cefálico superficial durante el desarrollo craneofacial.

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Este trabajo fue financiado por R01-R01 DE018234 y DE019638.

1. Preparación del tejido de un donante <ol><li> Preparar medios de cultivo, afilar pernos de vidrio, afilar agujas de tungsteno. </li><li> Recoger embrión a partir de cáscara, lavado en PBS helado. <ol class="lalpha"><li> Con una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 18 extraer 1,0 ml de albúmina en la punta de la cáscara del huevo. </li><li> Haz un pequeño agujero en la parte superior de la misma utilizando el punto de tijeras, y luego se corta una abertura circular para exponer el embrión </li></ol></li><li> Quitar la cabeza y el lugar en DMEM (libre de suero, la temperatura ambiente) </li><li> Diseccionar proceso frontonasal del embrión (o en el sitio de otros donantes como el proceso maxilar o mandibular) </li><li> Compendio de 2.4U / mL dispasa en PBS en hielo durante 20 minutos </li><li> Cubrir los tejidos con DMEM con BSA al 1% para detener la digestión </li><li> El uso de agujas afiladas de tungsteno para ectodermo separado, mesénquima, y ​​neuroectodermo </li><li> Tienda de injerto de tejido en DMEM BSA al 1% en el hielo hasta el ordenador está listo para el trasplante </li></ol> 2. La preparación de la acogida <ol><li> Exponer el embrión <ol class="lalpha"><li> Con una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 18 extraer 1,0 ml de albúmina en la punta de la cáscara del huevo. </li><li> Haz un pequeño agujero en la parte superior de la misma utilizando el punto de tijeras. Coloque un pedazo de cinta adhesiva sobre el agujero, y luego se corta una abertura circular para exponer el embrión. </li></ol></li><li> Utilizando dos pares de pinzas, sujete el amnios y el desgarro con cuidado para hacer un agujero. </li><li> Gire la cabeza colocando un par de pinzas en el ojo derecho y la aplicación de presión. Mientras mantiene la cabeza firme, utilice una aguja de tungsteno para eliminar el ectodermo de acogida para dar cabida a la corrupción. </li><li> Transferencia del injerto al huésped con una pipeta de vidrio. </li><li> La posición del injerto para reemplazar el ectodermo eliminado. Inserte un vaso en cada esquina del tejido injertado para fijar el injerto en su lugar. Para hacer alfileres de cristal, tirar de un tubo capilar a una punta fina sobre una llama de alcohol. </li><li> Coloque cinta firmemente sobre el agujero y volver embrión de la incubadora de tiempo adecuado para el análisis. </li><li> véase también: 9 </li></ol> 3. Los resultados representativos: Para evaluar las quimeras, los embriones deben ser recogidos y procesados ​​para el análisis de la distribución de los anfitriones y los tejidos del donante. Para la detección de células de codorniz, inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo QcPN (que se describe en: 3) se emplea, y para la detección de células de ratón, hibridación in situ en secciones de parafina se utilizan 6. Las células del donante se debe restringir al epitelio, y no debe haber evidencia de donantes tejidos mesenquimales (Figura 1). La presencia de células del donante aislado en el mesénquima indica la presencia de células de la contaminación de la cresta neural que confundir cualquier interpretación morfológica debido a la influencia de estas células en muchos aspectos del desarrollo facial (por ejemplo, 10). Una vez convencidos de que la técnica de injerto libre de contaminantes mesénquima, las medidas de resultado más morfológicos o moleculares se pueden utilizar para evaluar las quimeras. Para nuestros propósitos, hemos detectado la presencia de los cartílagos y los huesos ectópico que se correspondía con la duplicación de la mandíbula superior que fueron inducidos por los tejidos trasplantados (Figura 2), y los cambios moleculares en los tejidos mesenquimales en respuesta a la ectodermo injerto (Figura 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Evaluación de quimerismo (A) Anti-manchas QcPN se utiliza para detectar células de codorniz en la codorniz, pollo quimeras. No hay evidencia de manchas en el mesénquima. (B) La hibridación in situ se utiliza para detectar la expresión de las transcripciones B2 SINE en quimeras pollo ratón. Expresión está restringida al ectodermo que incluye el injerto. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Tinción de la figura 2. Tricrómica muestra la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior en (A) de codorniz-chick quimera, y (B) quimeras pollo ratón. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El ectodermo regultes la expresión de genes en el mesénquima. (A) Normal BMP7 expresión en el mesénquima de un embrión de pollo (radiactivos hibridación in situ con señal positiva pseudo-color rojo en Adobe Photoshop). (B) la expresión BMP7 se induce en el mesénquima adyacente al injerto (flecha) en embriones quiméricos.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

El uso de este método de trasplante nos ha permitido determinar que el ectodermo contiene información de señalización que regula la polaridad dorsoventral y extensión proximodistal de la mandíbula superior. La similitud de resultados cuando se utiliza la codorniz o ectodermo del ratón, y la conservación de las señales moleculares en este tejido, entre muchas especies de 6,11 indica que este es un centro altamente conservadas de señalización entre los vertebrados. Por otra parte, otros investigadores han utili...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcapilar</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Portacuchillas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

la evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

La accesibilidad de los embriones de aves ha ayudado a los embriólogos experimentales entender el destino de las células durante el desarrollo y el papel de las interacciones de los tejidos que regulan los patrones y la morfogénesis de los vertebrados (por ejemplo, 1, 2, 3, 4). Aquí, se expone un método que explota esta accesibilidad a la prueba de la señalización y las propiedades de los patrones de tejidos del ectodermo durante el desarrollo facial. En estos experimentos, se crea la codorniz-chick chick 5 o 6 quimeras de ratón mediante el trasplante de la superficie ectodermo cefálico que cubre la mandíbula superior de la codorniz o el ratón sobre cualquiera de la misma región o de una región ectópica de embriones de pollo. El uso de la codorniz como tejido de un donante para el trasplante en los pollos se ha desarrollado para tomar ventaja de un marcador nucleolar presente en la codorniz, pero no las células de pollo, lo que permite a los investigadores distinguir anfitrión y tejidos de donantes 7. Del mismo modo, un elemento repetitivo está presente en el genoma del ratón y se expresa doquier, lo que nos permite distinguir anfitrión y tejidos de donantes en el ratón-chick quimeras 8. El uso de ectodermo ratón como donantes de tejidos en gran medida ampliar nuestra comprensión de estas interacciones de tejidos, ya que esto nos permitirá poner a prueba las propiedades de señalización del ectodermo derivan de varios embriones mutantes.

En este artículo se describe una técnica de trasplante de tejido que se diseñó para probar la señalización y las propiedades de los patrones de la superficie del ectodermo cefálico durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

La accesibilidad de los embriones de aves ha ayudado a los embriólogos experimentales a comprender el destino de las células durante el desarrollo y la función del tejido...

El objetivo general de este procedimiento es crear embriones quiméricos mediante el trasplante de ectodermo de embriones donantes a la mandíbula superior en desarrollo de embriones de pollo. Esto se logra primero eliminando el dermis donante para su trasplante. Luego, se prepara el sitio receptor para el injerto.El paso final del procedimiento consiste en colocar el tejido donante en el sitio receptor y fijar el injerto en su posición. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el injerto exclusivo del ectodermo donante, y mediante análisis moleculares y morfológicos, puede determinarse la función del ectodermo donante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como identificar el papel de diversos tejidos durante la morfogénesis.La doctora Diane, investigadora principal de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los medios y asegúrese de que todas las soluciones necesarias estén disponibles y a la temperatura correcta. Luego, mientras usa protección ocular adecuada, estire tubos capilares microscópicos hasta obtener una punta fina sobre una llama de alcohol.Para fabricar alfileres de vidrio, afílese agujas de tungsteno sosteniéndolas en la llama de un soplete de propano. Comience la extracción del embrión donante desde el cascarón colocando un trozo de cinta adhesiva sobre el extremo del huevo. Luego, use la punta de una aguja de disección para crear un pequeño orificio en el centro de la cinta.Inserte una jeringa de 10 mililitros y una aguja hipodérmica de calibre 18 en el orificio, y retire un mililitro de albúmina del huevo. Luego, utilizando una aguja de disección, haga un pequeño orificio en la parte superior del cascarón. Coloque un segundo trozo de cinta adhesiva para cubrir este orificio.Corte una abertura circular en el huevo utilizando dos pares de pinzas. Sujete el embrión y colóquelo en un recipiente con PBS frío con hielo para lavarlo. Después de que se haya eliminado la cabeza del embrión, colóquela en un recipiente de cultivo celular que contenga DMEM sin suero a temperatura ambiente.Coloque el recipiente bajo el microscopio de disección mientras sostiene la cabeza con pinzas. Utilice tijeras de resorte para diseccionar groseramente la mandíbula superior y el lagon del resto de la cabeza. Luego, usando un portacuchillas con una cuchilla de afeitar afilada, corte el proceso nasal frontal de la mandíbula superior.Utilice una pipeta para transferir el proceso nasal frontonasal a una placa de Petri de 30 milímetros que contenga un volumen suficiente de disolución en PBS e incube en hielo durante 20 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspire la solución sin perturbar el tejido. A continuación, cubra completamente los tejidos con DMEM que contenga 1 % de BSA.Para detener la digestión, transfiera el tejido a una nueva placa de cultivo. A continuación, trabaje bajo un microscopio estereoscópico. Sujete el tejido con una aguja de tungsteno no afilada utilizando una aguja de tungsteno afilada.Se pare el ectodermo separándolo de los demás tejidos. Una vez preparado, almacene el tejido de injerto en DMEM con BSA sobre hielo hasta que el huésped esté listo para el trasplante. Utilizando el método previamente demostrado, cree una ventana en el huevo de pollo.Coloque el huevo que contiene el embrión bajo el microscopio estereoscópico utilizando dos pares de pinzas. Sujete la membrana IGN y el amnios y desgarre suavemente para hacer un orificio y exponer el embrión huésped. Gire la cabeza colocando un par de pinzas sobre el ojo derecho y aplicando presión mientras mantiene la cabeza firme.Utilice una pinza y una aguja para retirar la dermis del huésped y así acomodar el injerto. Añada dos microlitros de rojo neutro a la placa de Petri que contiene los injertos preparados. Utilice una pipeta de vidrio para transferir el injerto al huésped.Coloque el injerto en posición para reemplazar el ectodermo eliminado. Inserte una aguja de vidrio en cada esquina del tejido injertado para fijar el injerto en su lugar tras el injerto. Cierre la ventana firmemente con cinta adhesiva.Devuelva el embrión al incubador hasta alcanzar la etapa de desarrollo requerida para el análisis. Esta imagen muestra tejido de un embrión de codorniz URA que ha sido teñido con el anticuerpo específico para codorniz anti Q-C-P-N-A. El tejido injertado se encuentra entre las dos flechas. No hay evidencia de tinción QCPN en el tejido meen kind de una quimera de ratón-codorniz que se observa aquí. Nuevamente, el tejido injertado se localiza entre las dos flechas en C, dos hibridaciones con secuencias repetitivas específicas para la señal B.El análisis de los genes de clase uno revela que la expresión del marcador B2 está restringida al ome que comprende el injerto mostrado aquí como una imagen de un quimérico de codorniz y pollo, cuya tinción tricrómica colorea en azul el colágeno y el hueso. Se observa la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior, tal como indica la flecha. Esta imagen muestra un quimérico de ratón y pollo, nuevamente teñido con tinción tricrómica.Se observa la duplicación del esqueleto de la mandíbula superior. Esta imagen muestra la hibridación por radioactividad en C dos de la expresión normal de BMP siete en el mequi de un embrión de pollo injertado, mostrado aquí como tejido de un quimérico ratón-pollo espejo. Puede observarse que la expresión de BMP siete se induce en el mequi adyacente al injerto, como indica la flecha.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular embriones de pollo para evaluar los mecanismos que regulan el desarrollo del proceso frontal y nasal.

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Investigación

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Biología

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