Name: Glicol eficiente de polietileno (PEG) de la transformación mediada por Moss Physcomitrella patens /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Aprende a transformar protoplastos de Physcomitrella patens mediante PEG de forma eficiente. Este protocolo simplificado permite estudios de función génica en musgos con resultados consistentes en aproximadamente tres horas.

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1. Haciendo que el protoplastos <ol><li> Añadir 9 ml de 8% de manitol a una placa de Petri. </li><li> Usando una espátula, coloque siete días de edad musgo 2-3 PPNH4 placas de 5 - en la placa de Petri que contienen manitol. </li><li> Añadir 3 ml de 2% Driselase (Sigma D9515-25G) para la placa de Petri. </li><li> Incubar la placa de Petri a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora. </li><li> Filtrar la suspensión de protoplastos a través de una malla de 100 micras (BD Falcon 352 350). </li><li> Giro se filtró la suspensión a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender los protoplastos con mucha suavidad, con 500 l de 8% de manitol. </li><li> Añadir 9,5 ml de manitol al 8% en el tubo de la cultura. Asegúrese de protoplastos se suspendió totalmente. </li><li> Repita la filtración y la suspensión re-pasos (1.6, 1.7 y 1.8) dos veces más. </li><li> Tomar 10 l de la solución de protoplastos y el recuento de los protoplastos en un hemocitómetro. </li><li> Multiplicar el número de protoplastos en un área de 16 cuadrados por 10.000 para obtener el número de protoplastos por ml (ver Figura 1). </li></ol> 2. Transformación <ol><li> Haga girar la suspensión de protoplastos a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG en la concentración de 1,6 millones de protoplastos / ml. </li><li> Incubar la suspensión de protoplastos a temperatura ambiente durante 20 minutos. </li><li> Añadir 600 l de suspensión de protoplastos en un tubo de cultivo que contienen 60 mg de ADN. Agitar el tubo suavemente. </li><li> Añadir 700 L de PEG / Ca solución en la mezcla de protoplastos / ADN. Agitar el tubo suavemente hasta que la mezcla es homogénea todo. </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Durante este período de espera, la cubierta PRM-B placas con papel de celofán (80 mm de diámetro, los círculos, AA Embalaje Limited, Reino Unido), permitirá celofán para hidratar la superficie de la placa por lo menos durante 5 min. </li><li> Con una espátula, eliminar las burbujas de aire atrapado entre el celofán y la placa. </li><li> Diluir la mezcla con 3 ml de solución W5. </li><li> Haga girar la mezcla a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender los protoplastos en derretida 2 ml de PRM-T (antes de añadirla a los protoplastos se puede mantener esta solución líquida a 42 ° C). Placa 1 ml de volver a suspender los protoplastos por PRM-B plato cubierto por papel de celofán. Envuelva las placas con microporos (3M, Cuidado de la Salud). Mantener las placas a 25 ° C en cámara de crecimiento. </li><li> Por otra parte, los protoplastos se resuspendieron en 1 ml de medio de recubrimiento líquido y plateado 0,5 ml en una placa de PRM-B cubiertas con celofán. Esto permite una regeneración más rápida, pero el número de plantas de regeneración es baja. </li><li> Cámara de crecimiento está listo para una hora 16. luz y 8 horas. ciclo de oscuridad. </li><li> Mueva el celofán en una placa nueva selección cuatro días después de la transformación. </li></ol> 3. Los resultados representativos: Un ejemplo de la transformación se muestra en la Figura 2. El ADN utilizado en este ejemplo fue una superenrollado 7,8 kb plásmido que lleva una cinta de resistencia a higromicina. La cantidad de protoplastos plateado se redujo a 50% para la fotografía. Las fotos fueron tomadas dos semanas después de que las plantas fueron trasladadas a las placas de selección. La eficiencia de transformación no se ve afectada por la concentración de ADN de hasta 60 mg. Una mayor concentración de ADN son perjudiciales para la eficiencia de transformación. Los datos mostraron que este método proporciona resultados consistentes en un amplio rango de cantidades de ADN. Este método también puede generar transformantes estables efectivamente como se muestra en la Tabla 1, podemos obtener unos 4 transformantes estables por microgramo de ADN lineal, que es mucho mayor que lo reportado previamente 14. También hemos probado el efecto de choque de calor en la eficiencia de transformación mediante la transformación de un plásmido superenrollado portadores de un gen para una proteína fluorescente como un marcador. El choque térmico se llevó a cabo 10 minutos después de la incubación a temperatura ambiente (en el Paso 2.6) mediante la incubación de la mezcla en un baño de agua a 45 ° C durante 3 minutos. La mezcla se incubó en un baño en la habitación la temperatura del agua inmediatamente después de choque térmico durante 17 min. Los resultados se registraron 22 horas después de la transformación. Las proporciones de los transformantes obtenidos con y sin choque térmico son muy similares (~ 25%), pero se observó un efecto adverso de choque térmico sobre la viabilidad de los protoplastos (datos no mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista de protoplastos en hemocitómetro. La sección necesaria para el recuento de protoplastos se indica mediante un cuadrado rojo. Tenga en cuenta las 16 plazas necesarias para el recuento de protoplastos (ver 1.11), la imagen muestra un recuento de 24 de protoplastos (240.000 células / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fotos de 18 días transitoria transformantes de edad. Protoplastos se transformada con la cantidad indicada de plásmido superenrollado. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidad de ADN (g) </td><td> La eficiencia (tranformants ADN / mg) </td></tr><tr><td> 15 de plásmido superenrollado </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30 de plásmido superenrollado </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, plásmido superenrollado </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, plásmido superenrollado </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, plásmido linealizado </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Transformación de la eficiencia en diferentes cantidades de ADN.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

El método aquí presentado permite una transformación de ADN directa y consistente en Physcomitrella patens protoplastos. Este método fue desarrollado originalmente para el 1 de Arabidopsis, pero aquí hemos demostrado que funciona bien con protoplastos de Physcomitrella patens, una planta simple y diferente. Por lo tanto, este método se puede aplicar a otras especies de plantas con modificaciones menores. Posibles modificaciones para la optimización incluyen la concentración de protoplastos en MMG, tiempo de incubación en la solución de MMG y PEG / Ca. Optamos por utilizar 60 mg de ADN en nuestros experimentos de rutina debido a que el número de transformantes se incrementa linealmente con la concentración de ADN hasta este momento (Tabla 1). Podríamos obtener unos 7.000 transformantes transitorios o 200 transformantes estables en una única de 60 mg la transformación del ADN, que permite la detección y análisis de una gran población de plantas. Los protoplastos transformados puede ser extendido con un medio líquido o placas PRM-T. Aunque la eficiencia de la regeneración es más baja cuando el medio de recubrimiento líquido se utiliza, se elige este método cuando los protoplastos se transformaron con plásmidos superenrollado. Como se muestra en la Tabla 1, las transformaciones de hecho con el ADN de plásmido superenrollado generar transformantes muchos más y por lo tanto, podemos obtener un gran número de plantas con el medio de recubrimiento líquido. Además, la difusión de protoplastos con el medio chapado líquido permite una regeneración más rápida, lo cual es importante para los experimentos con fenotipos transitoria, como RNAi tumbar experimentos 9,15. Además de la ausencia de agar para el aislamiento de la parte superior permite planta fácil de inmunotinción y RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Ingrediente </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM de Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM de tartrato de diamonio 54 M FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 M H 3 BO 3 1,97 M MnCl2 0,4 H 2 O 0,23 M CoCl 2 .6 H 2 O 0,19 M ZnSO4. 7H 2 O 0,22 M CuSO 4. 5H 2 O 0,10 M Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 M de KI Agregar 0,7% de agar para un medio sólido. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 con 6% de manitol y el 0,8% de agar. Agregar 10 ml de CaCl2 1M a 1 L antes de verter las placas. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 con 6% de manitol y el 0,6% de agar. Añadir 0,5 ml de CaCl2 1M a 50 ml antes de su uso. </td></tr><tr><td> Media Revestimiento líquido </td><td> PPNH 4 con el 8,5% de manitol, sin agar. Añadir 0,5 ml de CaCl2 1M a 50 ml antes de su uso. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Añadir 4 g de Driselase (Sigma D9515-25G) a 200 ml de 8% de manitol. Revuelva suavemente durante 30 minutos. a temperatura ambiente, incubar 30 min. a 4 ° C, y agite suavemente durante 5 minutos. a temperatura ambiente. Girar 2.500 g durante 10 minutos, descartar pellet. Filtro de 0,22 micras, con y almacenar congelados alícuotas de 10 ml. Descongelar en un baño en la habitación la temperatura del agua antes de su uso. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M manitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5.7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 ml de H 2 O 2,5 ml de 0,8 M de manitol 1 ml de CaCl2 1M </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM de CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) </td></tr></tbody></table>

glicol eficiente de polietileno (peg) de la transformación mediada por moss physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Un método simple y eficiente para transformar<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplastos se describe. Este método es una adaptación de los protocolos para<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastos y<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesófilo de transformación de protoplastos<sup&gt; 1</sup&gt;. Debido a su capacidad para someterse a mitótico eficiente recombinación homóloga<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; Se ha convertido en un importante sistema modelo en los últimos años<sup&gt; 2</sup&gt;. Esta capacidad permite a las altas frecuencias de genes de la orientación<sup&gt; 3.9</sup&gt;, Que no se ve en las plantas de otro modelo, como<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Para sacar el máximo provecho de este sistema, necesitamos un método eficaz y fácil de introducir ADN en las células de musgo. Las formas más comunes para transformar este musgo son bombardeo de partículas<sup&gt; 10</sup&gt; Y PEG-ADN mediada por la captación<sup&gt; 11</sup&gt;. Aunque el bombardeo de partículas puede producir una alta eficiencia de transformación<sup&gt; 12</sup&gt;, Pistolas de genes que no están disponibles para muchos laboratorios y el protocolo es difícil de estandarizar. Por otro lado, la transformación mediada por PEG no requiere de equipos especializados, y se puede realizar en cualquier laboratorio con una campana estéril. Aquí mostramos un método sencillo y altamente eficiente para la transformación de protoplastos de musgo. Este método puede generar más de 120 transformantes transitorios por microgramo de ADN, que es una mejora del protocolo más eficiente ya se ha informado<sup&gt; 13</sup&gt;. Debido a su simplicidad, eficacia y reproducibilidad, este método puede ser aplicado a los proyectos que requieren gran número de transformantes, así como para la transformación de rutina.</p

Un método simple y eficiente para transformar<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplastos se describe. Este método es una adaptación de los protocolos para<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastos y<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesófilo de transformación de protoplastos<sup&gt; 1</sup&gt;.

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Se describe un método sencillo y eficiente para transformar protoplastos de Physcomitrella patens. Este método está adaptado de protocolos para Physcomitrella...

El objetivo general de este procedimiento es transformar protoplastos de SCO Metre. Esto se logra primero digiriendo las plantas con Drizly. A continuación, los protoplastos se lavan con manitol para eliminar el Drizly y luego se incuban con ADN y PEG.Finalmente, los protoplastos transformados se siembran en placas e incubarán. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren protoplastos transformados expresando proteínas marcadas con fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia. Quien demostrará el procedimiento será Y. Lu, un posdoctorado de mi laboratorio.La principal ventaja de esta técnica es que es eficaz y genera de forma constante protoplastos que expresan la proteína de interés. Para aislar protoplastos de musgo, comience añadiendo nueve mililitros de manitol al 8 % en una placa de Petri utilizando una espátula. Coloque musgo de cinco a siete días de edad procedente de dos o tres placas PP NH cuatro en el manitol. Consulte el protocolo escrito adjunto para este y otros preparados de reactivos. A continuación, añada tres mililitros de Drizly al 2 % e incube a temperatura ambiente con agitación suave durante una hora.Filtre la mezcla a través de una malla de 100 micrones para obtener una suspensión homogénea verde. Luego, centrifugue el filtrado a 250 G durante cinco minutos. Descarte el sobrenadante con mucho cuidado.ReSuspender los protoplastos en 500 microlitros de manitol al 8%. Luego, añadir 9,5 mililitros adicionales de manitol al 8%. Asegurarse de que los protoplastos queden completamente suspendidos.Realice los pasos de lavado otras dos veces, centrifugando nuevamente la solución a 250 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda los protoplastos primero en 500 microlitros.Luego, 9,5 mililitros de manitol al 8 % utilizando un hemocitómetro. Cuente el número de protoplastos en 10 microlitros de la suspensión para transformar el ADN en los protoplastos aislados. Primero, centrifugue la mezcla de protoplastos a 250 G durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y resuspenda los protoplastos a 1,6 millones por mililitro en solución MMG. Incube la suspensión a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, agregue 600 microlitros de la solución de protoplastos a un tubo de cultivo que contenga 60 microgramos de ADN. Agite.Añada suavemente 700 microlitros de solución de PEG con calcio y agite. Incube adecuadamente la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos en este período de espera. Cubra las placas PRMB con papel de celofán.Luego, diluya la suspensión con tres mililitros de solución W5 y centrifugue a 250 ×g durante cinco minutos. Para eliminar el PEG, re suspenda los protoplastos en dos mililitros de medio PRMT y plaque un mililitro por placa PRMB recubierta con celofán. Mantenga las placas a 25 grados Celsius en una cámara de crecimiento.Finalmente, cuatro días después de la transformación, transfiera el celofán a placas de selección frescas. Esta figura muestra un ejemplo de plantas de 18 días de edad regeneradas a partir de protoplastos, transformados con 15 microgramos de ADN plasmídico superenrollado, que portan un casete de resistencia a higromicina. Aquí, 30 microgramos del mismo plásmido superenrollado, ADN, fueron transformados en protoplastos.Se transformaron 60 microgramos de ADN de tipo plásmido en esta muestra. Y finalmente, estas plantas se regeneraron a partir de protoplastos que fueron transformados con 120 microgramos del mismo ADN plasmidial superenrollado que portaba el casete de resistencia a higromicina. La eficiencia de transformación no se ve afectada por concentraciones de ADN de hasta 60 microgramos.Sin embargo, concentraciones más altas de ADN son perjudiciales para este procedimiento. Los datos indican que este método proporciona resultados consistentes en un amplio rango de cantidades de ADN Una vez por semestre. Esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales como el ARNi transitorio y las eliminaciones génicas para responder preguntas adicionales sobre la función génica.

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