NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

El sistema de retención de muestras NanoDrop es una tecnología innovadora que utiliza la tensión superficial inherente de los líquidos para sostener y medir muestras de volumen microscópico entre dos pedestales ópticos, sin necesidad de usar QTS ni capilares. Tan solo un microlitro de muestra se pipetea directamente sobre la superficie óptica inferior. Al cerrar el brazo del espectrómetro, se forma una columna de líquido entre los pedestales ópticos superior e inferior.

Debido a la tensión superficial que forma un trayecto óptico vertical, la longitud del trayecto vertical puede cambiar automáticamente en tiempo real durante la medición. Acortar la longitud del trayecto permite medir concentraciones más altas, eliminando efectivamente la necesidad de realizar diluciones para la mayoría de las muestras de ácidos nucleicos. Además, el sistema de retención de muestras agiliza el proceso experimental con una limpieza rápida, que consiste simplemente en limpiar las superficies ópticas con una toallita de laboratorio.

Hoy demostraremos dos procedimientos para determinar la concentración de ácidos nucleicos utilizando instrumentación de microvolumen de Thermo Scientific. El primer protocolo es una medición directa de ácidos nucleicos mediante el espectrofotómetro NanoDrop 2000C. El segundo protocolo es una medición indirecta de ácidos nucleicos por fluorescencia utilizando el fluoroespectrómetro NanoDrop 3300.

Para comenzar, limpie las superficies ópticas superior e inferior del sistema de retención de muestra del espectrofotómetro de microvolumen pipeteando de dos a tres microlitros de agua desionizada limpia sobre la superficie óptica inferior. Cierre el brazo de palanca asegurándose de que el soporte superior entre en contacto con el agua desionizada. Levante el brazo de palanca y limpie ambas superficies ópticas con una toallita de laboratorio limpia, seca y sin pelusa.

A continuación, abra el software de NanoDrop y seleccione la aplicación para ácidos nucleicos. Utilice un pipeteador calibrado de pequeño volumen para realizar una medición en blanco, dispensando un microlitro de tampón sobre la superficie óptica inferior. Baje el brazo de palanca y seleccione blanco en la aplicación para ácidos nucleicos.

Una vez finalizada la medición del blanco, limpie ambas superficies ópticas con una toallita de laboratorio. Como antes, seleccione la constante adecuada para la muestra que se va a medir. A continuación, dispense un microlitro de la muestra de ácido nucleico sobre el pedestal óptico inferior y cierre el brazo de palanca.

Dado que la medición es independiente del volumen, la muestra solo necesita cubrir el espacio entre las dos superficies ópticas. Para realizar una medición, seleccione medir en el software de la aplicación; el software calculará automáticamente la concentración de ácidos nucleicos y las relaciones de pureza. Tras la medición de la muestra, revise la salida espectral. Una muestra típica de ácido nucleico presentará un perfil muy característico.

Los indicadores espectrales de una muestra de baja calidad incluyen picos en la región del valle y en el pico de 260 nanómetros. Las fuentes comunes de contaminantes asociadas con técnicas específicas de aislamiento de ácidos nucleicos incluyen fenol, triol y extracción por columna. En el caso de la extracción con fenol-triol, la contaminación residual con reactivo puede indicarse mediante espectros anormales entre 220 y 240 nanómetros, así como por desplazamientos en la región de 260 a 280 nanómetros.

Por el contrario, los residuos de guanidina de la extracción por columna pueden contribuir a un pico cercano a 230 nanómetros y a un desplazamiento del valle desde 230 nanómetros hasta aproximadamente 240 nanómetros. Para evaluar con precisión la pureza de la muestra, se debe analizar la relación 2 62 80 y 2 62 30 junto con la calidad espectral general. Los ácidos nucleicos puros suelen presentar una relación 2 62 80 de aproximadamente 1,8 para el ADN y de aproximadamente 2,0 para el ARN.

Esta proporción depende del pH y de la fuerza iónica del tampón utilizado para realizar las mediciones del blanco y de la muestra. El fluoroespectrómetro Banana Drop 3, 300 emplea el mismo sistema patentado de retención de muestra de microvolumen que el espectrofotómetro NanoDrop 2000 C. Al realizarse las mediciones de fluorescencia con tan solo un microlitro de muestra, el usuario elige uno de tres LED como fuente de excitación, que emite hacia la muestra en dirección horizontal.

Posteriormente, la fluorescencia de la muestra se recoge en un ángulo de 90 grados verticalmente hacia un espectrómetro interno. Para demostrar la cuantificación de ácidos nucleicos en volumen micro con alta sensibilidad utilizando el NanoDrop 3300, se emplea un kit de fluorescencia Pico Green para comenzar a equilibrar las normas del kit y todas las muestras de ácidos nucleicos a temperatura ambiente. Las muestras fluorescentes son sensibles a la luz y deben mantenerse en tubos de color ámbar o envueltos en aluminio.

Prepare suficiente tampón 1X TBE para todos los patrones y muestras que se van a medir, así como para la solución de trabajo de pico verde que se necesite. Prepare el tampón 1X TBE diluyendo el tampón 20X TBE proporcionado con agua libre de núcleos según el protocolo del fabricante. Los volúmenes de reacción pueden variar desde 200 microlitros hasta tan poco como 10 microlitros.

En este ejemplo, prepararemos volúmenes de reacción de 10 microlitros. A continuación, prepare estándares de ADN bicatenario diluidos en serie y viales o tubos libres de nucleasas. Esto cubrirá el rango de concentración esperado de las muestras de ADN desconocidas.

Transfiera cinco microlitros de cada uno de los patrones de ADN bicatenario diluidos a un tubo individualmente etiquetado, libre de nucleasas y de color ámbar o cubierto con papel de aluminio. Luego, alícuota cinco microlitros de cada muestra de ADN bicatenario de interés en el tubo correspondiente protegido de la luz. Después de preparar la solución de trabajo de Pico Green según el protocolo del fabricante, transfiera un volumen igual de la solución a cada tubo que contenga ya sea el patrón de ADN bicatenario o la muestra de ADN bicatenario, en este caso cinco microlitros.

Combine volúmenes iguales de un tampón XTE y la solución de trabajo de Pico Green. Para preparar el control negativo, que sirve como solución de referencia. Mezcle bien el contenido de cada tubo mediante pipeteo suave y deje incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Todos los patrones y muestras deben equilibrarse a la misma temperatura antes de la medición, ya que la señal fluorescente se ve afectada por la temperatura. Para preparar el instrumento y realizar las mediciones, primero limpie las superficies inferior y superior del sistema de retención de muestras, pipetee de dos a tres microlitros de agua desionizada sobre la superficie óptica inferior cercana. Luego abra el brazo de palanca y seque los pedestales superior e inferior con una toallita de laboratorio limpia y libre de pelusas.

Asegúrese de que las superficies estén libres de pelusas antes de continuar, ya que las pelusas pueden exhibir fluorescencia en presencia de una fuente de excitación y pueden interferir con la medición. Abra el software del instrumento.

Seleccione la aplicación de ácidos nucleicos y elija la opción de ADN bicatenario con pico verde. Pipete dos microlitros de XTE 1X hacia el pedestal inferior. Cierre el brazo de palanca y seleccione "blanco" en el campo de software del instrumento. Una vez finalizado el blanco, retire mediante absorción la solución del blanco de ambas superficies del sistema de retención de muestra.

A continuación, mezcle la solución de referencia mediante pipeteo suave utilizando puntas de baja retención. Pipete dos microlitros de la solución de referencia sobre el pedestal inferior y cierre el brazo de palanca. Seleccione referencia en la pestaña de estándares y seleccione las unidades deseadas.

Haga clic en medir para iniciar el ciclo de medición. Cuando el ciclo de medición esté completo, abra el brazo de palanca y seque completamente las superficies del sistema de retención de la muestra. Mida hasta cinco réplicas del material de referencia utilizando un Eloqua nuevo para cada réplica.

Repita el proceso para los estándares adicionales con el fin de construir una curva patrón. Pueden utilizarse hasta siete estándares. El software está diseñado para almacenar hasta cinco réplicas de cada estándar.

Se promedian las réplicas de los patrones para generar una curva patrón a partir de la cual se determinan automáticamente las concentraciones de las muestras. Una vez completada la curva patrón, seleccione la pestaña de muestras, ingrese la información correspondiente a los identificadores de las muestras y mida cada muestra desconocida. Una curva válida indica que se ha alcanzado el número mínimo de patrones requeridos.

La concentración de ADN se determina automáticamente en función de la curva estándar. La instrumentación de volumen microNanoDrop puede determinar la concentración de ácidos nucleicos mediante mediciones directas de A260 o métodos fluorométricos indirectos. Los espectrofotómetros NanoDrop también pueden utilizarse para cuantificar proteínas mediante la absorbancia directa a A280 o mediante ensayos colorimétricos de proteínas.