Name: Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a registrar ópticamente cambios de potencial de membrana e interacciones sinápticas en el ganglio estomatogástrico de cangrejo usando tintes sensibles al voltaje. Esta técnica permite estudios de redes neuronales sin daño celular.

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Reconocemos el apoyo de la Facultad de Ciencias de la Computación y la Facultad de Ciencias, Agricultura e Ingeniería de la Universidad de Newcastle, por la Universidad de Ulm, y por el SciMedia Ltd (Tokio, Japón).

1. Preparación del cangrejo del Sistema Nervioso Stomatogastric Adultos Cancer pagurus L. fueron obtenidos de fuentes locales (Universidad de Newcastle, Paloma Marina de Laboratorios) y se mantienen en filtrada, el agua de mar aireada (10 - 12 ° C). Los animales fueron anestesiados por el embalaje en hielo durante 20 - 40 min antes de la disección. Hemos utilizado los sistemas aislados stomatogastric nervioso (STNS) 1. El STNS fue precisado en un elastómero de silicona forrada (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munich, Alemania), placa de Petri y superfused continua (7 - 12 ml / min) con solución salina fría (10-13 ° C). Solución salina fisiológica consistió en (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; trisma base, 10; ácido maleico, 5. Solución salina se mantiene a una temperatura constante de 11 a 13 ° C y un pH de 7,4 a 7,6. Los pasos detallados de la disección STNS y preparación, incluyendo el desheathing del ganglio stomatoastric (STG), se presentan en el artículo JoVe por Gutiérrez y Grashow 1. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva Europea del Consejo de Comunidades º 24 de noviembre 1986 (86/609/CEE). La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la STNS y Figura 1B muestra una típica STG desheathed que sus neuronas dispuestas en un semicírculo plana en la parte posterior del ganglio. La placa de Petri con la STNS se fija a la plataforma operativa del microscopio de imagen (BW51 WI, Olympus, Tokio, Japón) con plastilina. Tanto, la platina del microscopio, el microscopio se montan sobre una mesa de vibración aislada (Scientifica, Uckfield, Reino Unido) para evitar que los artefactos movimiento durante la grabación óptica. Los patrones motores generados en el ganglio stomatogastric (STG) se determinan con grabaciones extracelular 2-4. Esto se hace a través de los siguientes pasos: <ol><li> Un compartimiento de vaselina basado cilíndrico está construido alrededor de una sección del nervio motor principal (LVN) para aislar eléctricamente el nervio del baño (esto se hace en el escenario antes de la disección de la placa de Petri se coloca en la plataforma de funcionamiento del microscopio de imagen ). </li><li> Uno de los dos alambres de acero inoxidable electrodo se coloca en este compartimiento, y el otro en el baño como un electrodo de referencia. </li><li> La señal diferencial se registra, se filtra y amplifica con un amplificador diferencial AC (Universidad de Kaiserslautern, Alemania). </li><li> La actividad motora del ganglio se controla mediante un osciloscopio (DL708E, Yokogawa, Tokio, Japón) y es, además, grabado con una tarjeta de adquisición de datos (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) y la Espiga de 2 v6.10 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Los archivos son analizados mediante el de Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Preparación de la solución de colorante Se utilizaron los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, que tiene una doble carga positiva que facilita la carga de la tinta a través de microelectrodos positivos mediante el uso de pulsos de corriente. La solución de colorante debe ser protegido de la luz tanto como sea posible. La solución colorante se prepara de la siguiente manera: <ol><li> 5 mg de tintura se mezcla con 1 ml de ácido Pluronic F-127 en DMSO (Invitrogen) solución. </li><li> El vial de plástico que contienen el colorante disuelto se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 rotaciones / minuto en una microcentrífuga 01.14 Sigma (Sigma, Osterode, Alemania) para separar las partículas más grandes tintes que pueden obstruir los microelectrodos. </li><li> El sobrenadante (top 200 l) de la solución de colorante se separa mediante una pipeta y se almacena en un frasco de plástico por separado. Ambos viales se envuelven en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> La solución colorante se congela a -20 ° C. </li><li> Antes de utilizar la solución de colorante que se derrita, colocando el frasco cerrado y envuelto en agua tibia (25 ° C) durante 10-15 minutos. </li></ol> 3. Colorante de carga por inyección intracelular con microelectrodos de Sharp Hemos utilizado microelectrodos fuerte para cargar las neuronas con el tinte. Para comprobar la carga de tintes que utilizamos el sistema de imágenes MiCAM02 (SciMedia, Tokio, Japón) 6. El sistema de imágenes cuenta con dos cámaras CCD: la cámara de recursos humanos tiene un chip sensor de mayor tamaño (6,4 mm x 4,8 mm) proporciona una mejor resolución espacial con la mejor resolución temporal que 1,4 ms, la cámara del SA, tiene un menor (2,9 mm x 2,1 mm), pero más rápido chip sensor que permite más rápido de imágenes que tengan 0,7 ms como su mejor resolución temporal. Los pasos de la carga de tintes son los siguientes: <ol><li> Microelectrodos se tira con un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.), extractor de electrodo con 10 cm de largo, 1 mm de diámetro exterior de los tubos de vidrio de filamento (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Alemania). Los electrodos se retiró para tener una resistencia en elrango de 25 a 40 MOhm en KCl 3M (para tirar adecuada configuración de los parámetros siguen el libro de cocina pipeta provista por el fabricante del extractor de electrodos). </li><li> La solución de colorante congelado es fundido y una cantidad muy pequeña de la que es absorbida en una aguja Microfil (Microfil - 34G, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.) - el colorante absorbido llena alrededor de RD 2 / 3 de la aguja Microfil . </li><li> La solución de colorante en la aguja Microfil se inyecta en la punta de un microelectrodo. El micro se coloca en una caja oscura durante 15 minutos. </li><li> El micro se rellena con solución de KCl 3M. El electrodo se coloca de nuevo en una caja de almacenamiento de electrodo oscuro para otros 10-20 minutos para permitir que la solución de colorante para llegar a la fina punta del electrodo por la succión de la fuerza capilar que en el microelectrodo. </li><li> El micro listo se coloca en un porta-electrodo y se fija en el headstage del amplificador intracelular (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, EE.UU.). </li><li> El amplificador intracelular está conectado a la tarjeta de adquisición de datos que proporciona una señal de pulso para conducir impulsos de corriente en el microelectrodo. </li><li> El micro se coloca suavemente en la membrana de una neurona STG utilizando un manipulador de microelectrodos (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Reino Unido). Desde la distancia de trabajo de los objetivo de 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) del microscopio de imagen es muy pequeña, el microelectrodo se debe colocar en posición oblicua (alrededor de 30 °) y el movimiento de los microelectrodos en la posición correcta requiere de varios pasos de la reorientación de los objetivos del microscopio y el movimiento de microelectrodos. Para iniciar el microelectrodo se mueve en una posición tal que la punta está por encima del STG. El objetivo del microscopio se baja hasta que la punta del electrodo aparece en foco. Luego de que se baje aún más, pero no tanto para tocar el microelectrodo. El micro se baja hasta que vuelva a aparecer en el foco del objetivo. Estos pasos se repiten hasta que las neuronas aparecen claramente en el plano de enfoque del objetivo. A continuación, el microelectrodo se baja hasta que toque suavemente y penetra en la membrana de la neurona STG seleccionado. Este control se ejerce mediante el osciloscopio. </li><li> El electrodo intracelular se utiliza para registrar la actividad de la neurona STG seleccionados con el fin de identificar las neuronas debido a su perfil de actividad y la relación entre su actividad y la actividad STG registrado desde el electrodo extracelular 2,3,7. </li><li> El amplificador intracelular pasa a modo de inyección de corriente y se utiliza durante 30 minutos para inyectar 10 nA pasos positivos actuales en el microelectrodo que duran un segundo y están separados por un segundo vacíos sin corriente inyectada en el microelectrodo. Las unidades de la corriente inyectada moléculas cargadas positivamente medio de contraste en las neuronas registradas. Si se dispone de equipos múltiples neuronas puede ser inyectado al mismo tiempo. </li><li> Diez minutos en el período de inyección y después de la final de la inyección de la propagación de tinte dentro de la neurona está activada. Para ello se utiliza el sistema MiCAM02 imágenes (SciMedia Ltd, Tokio, Japón) con el objetivo de 10x e iluminación de la fuente de luz ultra-baja ondulación halógenas (HL-151; Moritex, Tokio, Japón) a través de la MSWG2 cubo de filtro (con 480-550 nm de excitación filtro, Olympus Corporation, Tokio, Japón). El sistema de imagen está configurado para usar la cámara de recursos humanos con 192 píxeles de resolución x 128, 40 ms de tiempo de imágenes, el modo de "hbin ', y 10 cuadros por sesión de imágenes. Si el relleno colorante es el éxito de la imagen debe mostrar un parche coloreado en la neurona torno a la ubicación de los microelectrodos, y este parche teñido debe crecer entre las imágenes tomadas después de 10 minutos y después de 30 minutos. Si la difusión del colorante es insuficiente después de 30 minutos, más tiempo de inyección se concede. Por otra parte, un electrodo nuevo colorante puede ser utilizado. </li><li> El electrodo se sacó de la neurona y la neurona se deja descansar por lo menos 20-30 minutos. Dentro de este tiempo, la siguiente neurona puede ser inyectado con tinta. </li></ol> 4. Imágenes de las neuronas teñidas La actividad de las neuronas individuales se pueden crear imágenes después de que el procedimiento de tintura de llenado. Por otra parte dos o más neuronas puede ser llenado con la imagen de la actividad simultánea de las neuronas STG varios. En principio muchas y posiblemente todas las neuronas STG puede ser llenado con medio de contraste. Las imágenes de las neuronas se hace con el 02 Micam sistema de imágenes con la cámara de recursos humanos. El procedimiento de la imagen es la siguiente: <ol><li> El objetivo del microscopio se cambia y una transmisión de luz de alta eficiencia objetivo 20x (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD de 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) se utiliza para la recolección de datos de imágenes. Este objetivo se acumula mucha más luz que el objetivo de 10x y también le da un mayor aumento, proporcionando una imagen más detallada de las neuronas. Bein g eficiente significa más luz que una pequeña cantidad de colorante de carga ya es visible con este objetivo y que podemos utilizar una menor intensidad de la luz de la imagen reduciendo el daño potencial de fotos que pueden ser causados ​​a las neuronas por el tinte. </li><li> Etapa del microscopio operativo se coloca de tal manera que las neuronas que están destinados a ser reflejado en el campo de visión del objetivo y el objetivo se centra en ellos. </li><li> Los datos de registro extracelular también se introduce en el sistema de imágenes de Micam 02 a través de su canal de entrada analógica. Esto permite que la relación relativamente fácil de las señales ópticas y los patrones correspondientes de motor o picos extracelularmente registradas en la fase de análisis. </li><li> El sistema de Micam 02 está configurado para utilizar 96 x 64 píxeles de resolución con 2,2 ms de tiempo de imágenes o 48 x 32 píxeles de resolución con 1,5 ms de tiempo de imágenes. En ambos casos el "hbin 'ajuste se puede utilizar si el teñido de las neuronas no es muy fuerte. </li><li> El nivel de luz se ajusta lo más bajo posible (es decir, el medio de contraste en las neuronas que generan fluorescencia todavía suficiente para que la imagen) para evitar la foto de la modulación y la foto daño de las neuronas registradas. </li><li> La iluminación de la habitación y todas las fuentes de luz que queda se apaga. Además, un telón negro se puede cerrar todo el equipo de grabación para evitar exposición a la luz de fuentes externas. </li><li> Las sesiones de formación de imágenes se fijan para ser entre 4 a 16 segundos de duración. </li><li> La actividad espontánea de las neuronas teñidas se registra durante las sesiones de imágenes varias. </li></ol> 5. El análisis de los datos de imagen óptico Para analizar los datos de imagen se utilizó el software BVAna (versión 10.08; SciMedia Ltd, Tokio, Japón) asociados con la MICAM 02 sistema de imágenes. El software es compatible con la visualización de los datos de imagen y ofrece una amplia gama de herramientas de análisis. Los pasos del análisis e interpretación de datos son los siguientes: <ol><li> En la región apropiada circular de interés se selecciona en cada neuronas registradas. Normalmente se utiliza 2-3 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 48 x 32 píxeles, y 6 - 8 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 96 x 64. </li><li> La suavización temporal de los datos puede ser necesaria, especialmente si el medio de contraste genera cantidad relativamente baja de fluorescencia (valor de fondo de baja en los datos indica que esto, puede ser debido a la baja el nivel de luz que se utiliza o carga de bajo nivel medio de contraste, por ejemplo en las neuritas de las neuronas registradas). Normalmente en estos casos se utilizó el suavizado temporal de 3 a 5 unidades de tiempo. </li><li> Además de las grabaciones ópticas también mostrar el registro extracelular de la selección para mostrar la entrada analógica del sistema de imagen. </li><li> Los parámetros para la visualización de los datos ópticos y de la entrada analógica debe ser un valor apropiado para poder ver todas las grabaciones en la pantalla del ordenador. </li><li> Teniendo en cuenta las grabaciones ópticas de las neuronas, el registro extracelular de la LVN, y la clasificación de la neurona sobre la base de la grabación antes intracelular, es posible determinar la identidad de la neurona y relacionar su actividad con las actividades neuronales grabados de la los nervios. </li><li> Se espera que las grabaciones ópticas muestran claramente, y sin la necesidad de un promedio de más de varios eventos similares, las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados extracelularmente y eventos subumbral como inhibidores potenciales postsinápticos causados ​​por la actividad de otras neuronas. </li><li> Las funciones de exportación de datos del software BVAna se puede utilizar para exportar las grabaciones ópticas calculadas para las regiones seleccionadas de interés y también la entrada analógica que contiene la grabación de la LVN. La exportación de datos pueden ser procesados ​​y analizados posteriormente con otros programas de análisis de datos, así (por ejemplo, en el caso más simple de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.) se puede utilizar para la visualización y procesamiento de datos adicionales). </li></ol> 6. Resultados representante La figura 2 muestra la grabación simultánea de dos neuronas (LP, lateral neurona pilórica, PD, pilórica dilatador neuronas) en el generador de patrones pilórica central de un cangrejo STG junto con la grabación de la LVN. Las grabaciones ópticas de las neuronas LP y EP identificados sobre la base de sus registros intracelulares muestran que, efectivamente, estos corresponden bien con las grabaciones correspondientes a las neuronas extracelular LP y EP. Hay un constante retraso de 12 ms entre las grabaciones ópticas y LVN de los picos de alza (ver recuadro de la Figura 2) debido a la demora en la transmisión axonal entre el ganglio y el sitio de registro extracelular. Los datos presentados también muestran que la actividad neuronal en el soma que corresponde a los picos de las neuronas registradas es claramente detectable. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/&gt; Figura 1. Un diagrama) Esquema del sistema nervioso stomatogastric (STNS). COG, el ganglio comisural, OG, ganglionares del esófago, STG, el ganglio stomatogastric, STN, los nervios stomatogastric; LVN, los nervios del ventrículo lateral. B) El ganglio cangrejo stomatogastric (STG) - La imagen muestra la disposición semicircular posterior de las neuronas STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Grabación simultánea de un solo barrido de un EP y un LP de neuronas junto con la grabación de la LVN. Los datos muestran que que las grabaciones ópticas y de los nervios partido muy bien y que podemos identificar las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados forman el nervio. El recuadro muestra una superposición de varios barridos de potenciales de acción LP - tanto óptica y eléctrica registrado - y su promedio de demostrar la correspondencia entre las actividades de óptica y eléctrica registrado. Debido al hecho de que nuestro método de grabación óptica no filtra los componentes de baja frecuencia de los datos que también son capaces de registrar cambios lentos potencial de membrana característica de la EP y LP neuronas 14.

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</ol>

El medio de contraste de imagen sensibles al voltaje de 8,9 STG las neuronas, en combinación con los métodos tradicionales de electrofisiología (grabaciones de electrodos intra y extracelular) permite una mejor comprensión de cómo funciona este pequeño, nervioso conocido y complejo aún el sistema. La STG es un prototipo de generador de patrones centrales (GPC) de las redes neuronales (que incluye las redes de planta de píloro gástrico y el ritmo), 10, 11, por lo tanto una mejor comprensión de las propiedades emergentes funcional de la STG también ayudará a entender cómo, en general, CPG generar redes de su funcionalidad a nivel de red. CPG redes juegan un papel crítico en el control motor 12 y también en las funciones cognitivas superiores 13, por lo tanto una mejor comprensión de sus propiedades emergentes pueden tener un gran impacto en muchas áreas de las neurociencias.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Sistema de imagen</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Software de análisis de datos para el sistema de imagen MiCAM 02</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokio, Japón</td><td></td><td>Fuente de luz halógena de ultra bajo rizado</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Microscopio invertido para imagen de epifluorescencia</td></tr><tr><td>Objetivo de imagen de 20x </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2.0 mm</td></tr><tr><td>Objetivo de imagen de 10x </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0.30, WD 3.3 mm</td></tr><tr><td>Cubo de filtro con filtro de excitación de 480-550 nm y filtro de emisión de 590 nm </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibración</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de electrodos PatchStar</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>Manipulador de microelectrodos</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Tarjeta de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Osciloscopio DL708E</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Amplificador intracelular</td></tr><tr><td>Amplificador diferencial de CA</td><td>Universidad de Kaiserslautern, Alemania</td><td></td><td>Amplificador extracelular</td></tr><tr><td>P-97 Flaming &amp;#8211; Brown tipo electrodo puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Extractor de electrodos</td></tr><tr><td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Genex Pipettors Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>Micropipeta de vidrio con filamento</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>Vidrio para micro&amp;#8211;electrodos</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Aguja Microfil</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Software de electrofisiología</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>Tinte fluorescente sensible al voltaje</td></tr><tr><td>Ácido F-127 Plurónico, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Disolvente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo, solución electrolítica</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo</td></tr><tr><td>Base de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo</td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Componente de la solución salina para cangrejo</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, Múnich, Alemania</td><td></td><td>Revestimiento de las placas de Petri</td></tr></tbody></table>

imagen óptica de neuronas en el ganglio cangrejo stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Sensibles al voltaje de imágenes tinte de las neuronas es una metodología clave para la comprensión de cómo las redes neuronales se organizan y cómo la actividad simultánea de neuronas que participan conduce a la aparición de la funcionalidad integral de la red. Aquí se presenta la metodología de aplicación de esta técnica a las neuronas generando patrón identificado en el ganglio de cangrejo stomatogastric. Se demuestra la carga de estas neuronas con los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ y nos muestran cómo la imagen de la actividad de las neuronas tinte cargado con la velocidad MiCAM02 alta y de alta resolución CCD sistema de cámara de imagen. Se demuestra el análisis de los datos de imágenes grabados con el software de imágenes BVAna asociados con el sistema de imágenes MiCAM02. La simultánea de imágenes sensibles al voltaje medio de contraste de la actividad detallada de múltiples neuronas en el ganglio de cangrejo stomatogastric aplicarse junto con las técnicas tradicionales de electrofisiología (registros intracelulares y extracelulares) abre radicalmente nuevas oportunidades para la comprensión del funcionamiento de centrales generador de patrones de las redes neuronales.

Aquí se presenta la metodología para la resolución rápida y de alta fluorescentes sensibles al voltaje de imágenes tinte de la actividad detallada de las neuronas en el ganglio stomatogastric cangrejo.

Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

La técnica de imagen con colorantes sensibles al voltaje de las neuronas es una metodología clave para comprender cómo se organizan las redes neuronales y cómo la simultaneidad...

El objetivo del siguiente experimento consiste en utilizar colorantes sensibles al voltaje para registrar ópticamente los cambios en el potencial de membrana y las interacciones sinápticas entre neuronas en los generadores de patrones centrales del ganglio somático asterisco de crustáceos. Esto se logra cargando neuronas identificadas con DD ocho y en PQ mediante inyección iónica utilizando microelectrodos afilados, y como segundo paso, registrando simultáneamente la actividad nerviosa motora extracelular. A continuación, la fluorescencia del colorante sensible al voltaje se excita con luz verde, lo que permite obtener imágenes de los cambios en la fluorescencia que corresponden a las variaciones del potencial de membrana celular. Posteriormente, los datos de imagen se analizan seleccionando una región de interés en la membrana neuronal y comparando la señal óptica con la actividad biciclo extracelular registrada, con el fin de identificar potenciales de acción y potenciales sinápticos.En los resultados de la imagen se obtienen neuronas que muestran que la grabación óptica de neuronas generadoras de patrones que interactúan sinápticamente puede complementar las técnicas tradicionales de registro y abrir nuevas oportunidades para comprender cómo funcionan las redes neuronales generadoras de patrones centrales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los registros extracelulares e intracelulares, es que tras el llenado por inmersión, se pueden lograr grabaciones ópticas de cambios en el potencial de membrana e interacciones sinápticas sin las restricciones estéricas impuestas por la colocación de electrodos y sin dañar más las neuronas durante grabaciones a largo plazo. Aunque este método puede proporcionar una mayor comprensión sobre la generación de patrones en el ganglio gástrico del estómago de crustáceos.También puede aplicarse a otros sistemas, como la locomoción y la respiración en vertebrados. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la inyección y preparación con selección D son complicadas, y los parámetros para el análisis de los datos de imagen deben ajustarse adecuadamente para detectar cambios en el potencial de membrana. Comience las preparaciones elaborando la solución del colorante fluorescente en un vial de plástico: mezcle cinco miligramos del colorante sensible al voltaje D ocho y FPQ con un mililitro de ácido F1 27 niónico en solución de DMSO.A continuación, centrifugue el colorante disuelto durante 20 minutos a 12.000 rotaciones por minuto. Con el fin de separar las partículas D más grandes que podrían obstruir el microelectrodo, tras la centrifugación, el usuario debe aspirar los primeros 200 microlitros del sobrenadante y expulsar el sobrenadante en un vial plástico separado. Envuelva el vial en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.Almacene la solución D en un congelador a menos 20 grados Celsius el día del experimento. Derrita la solución de colorante colocando el vial envuelto en agua a 25 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Para prepararse para las grabaciones, comience por aislar el sistema nervioso gástrico somático del STS de un cangrejo y desenfundar el ganglio gástrico somático.Aplique vaselina alrededor de un segmento del nervio ventricular lateral o LVN para crear un compartimento eléctricamente aislado. Utilice arcilla de modelar para fijar la placa de Petri a la plataforma de operación del microscopio de imagen. Coloque un cable de electrodo de acero inoxidable en el compartimento de vaselina para registrar del LVN, y coloque otro electrodo de acero inoxidable en el baño como electrodo de referencia.Cuando la solución D se haya descongelado, aspire suficiente cantidad de la solución D para llenar aproximadamente dos tercios de una aguja microfill. Inyecte la solución D desde la aguja microfill hacia la punta de un microelectrodo de vidrio. Cubra el electrodo cargado con colorante con una caja y espere 15 minutos.Luego, rellene el microelectrodo con una solución de cloruro de potasio tres molar. Coloque el microelectrodo nuevamente en una caja de almacenamiento de electrodos oscura durante 10 a 20 minutos para permitir que la acción capilar impulse la solución hacia la punta fina del electrodo. Después de 10 a 20 minutos, coloque el microelectrodo en un porta-electrodo y conéctelo al cabezal del amplificador intracelular.El amplificador intracelular está conectado a la placa de adquisición de datos que proporciona una señal de pulso para inducir pulsos de corriente en el microelectrodo. A continuación, ajuste el microelectrodo a un ángulo oblicuo y coloque su punta por encima del ganglio gástrico somático. Baje el objetivo del microscopio hasta que la punta del electrodo esté enfocada.Luego, baje el objetivo, teniendo cuidado de detenerse antes de tocar el microelectrodo. A continuación, baje el microelectrodo hasta que vuelva a aparecer. Enfocando mediante el objetivo y monitoreando el progreso en el osciloscopio, penetre suavemente la membrana del neurona somática seleccionada del ganglio gástrico.En este momento, compare los potenciales de acción registrados intracelular y extracelularmente. Con el fin de identificar la neurona empalada, inicie la inyección del colorante cambiando el amplificador intracelular al modo de inyección de corriente e inyectando 10 pasos de corriente positiva de nanoamperios en el microelectrodo. Cada paso de corriente debe durar un segundo, separado por intervalos de un segundo sin corriente.Continúe esta inyección de corriente durante 30 minutos. Después de 10 minutos de inyección del colorante, utilice el sistema de imagen MYCA zero two para verificar la difusión del colorante dentro de la neurona. Repita esto, verifique después de 30 minutos.Si la carga con colorante es exitosa, la mancha teñida alrededor del microelectrodo debe crecer entre las imágenes tomadas a los 10 y a los 30 minutos. Retire el electrodo de la neurona y permita que la neurona se relaje durante al menos 20 a 30 minutos para que el colorante se difunda más dentro de la célula. Durante este tiempo, se puede inyectar colorante en otra neurona.Cambie al objetivo de 20 aumentos para la eficiencia de transmisión de luz en el sistema de imagen MYAM zero two. Reposicione la platina del microscopio según sea necesario y enfoque la neurona del campo D. Introduzca los datos de grabación extracelular en el sistema de imagen a través de su canal de entrada analógica.Apague la iluminación de la habitación y todas las fuentes de luz restantes. Además, cierre una cortina negra alrededor del equipo de grabación para evitar la exposición a la luz proveniente de fuentes externas. Configure el sistema de adquisición de imágenes en la resolución de píxeles y el tiempo de adquisición adecuados indicados en la tabla.Si el tinte en las neuronas no es muy intenso, utilice la configuración del bin H. Ajuste el nivel de luz del microscopio lo más bajo posible para evitar la modulación fotónica y el daño fotónico de las neuronas registradas. Establezca las sesiones de adquisición de imágenes entre cuatro y 16 segundos de duración.Luego registre la actividad espontánea de las neuronas DY durante varias sesiones de obtención de imágenes. Para comenzar el análisis de las respuestas ópticas utilizando el software de imagen BV A NA, seleccione una región circular apropiada en cada neurona registrada si es necesario suavizar temporalmente los datos. Por ejemplo, si la D genera una cantidad relativamente baja de fluorescencia, utilice el software para aplicar un suavizado temporal con tres a cinco unidades de tiempo.Las dos neuronas inyectadas con colorante en la parte superior izquierda de esta figura se identifican como una neurona PD y una neurona LP según sus registros intracelulares. Las trazas de voltaje a su derecha muestran las respuestas ópticas espontáneas de cada neurona. El registro extracelular del LVN se muestra en la parte inferior de la figura.Las neuronas LP y PD forman parte del generador de patrones centrales pilóricos del ganglio gástrico somático de un cangrejo y se inhiben mutuamente. Sus registros ópticos pueden coincidir bien con los registros extracelulares del LVN. El recuadro inferior muestra una superposición de varios trazos de potenciales de acción de LP y su promedio, que demuestra la concordancia entre las actividades registradas ópticamente y eléctricamente.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora y media si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotinción para responder preguntas adicionales, tales como qué tipo de sinapsis estuvo implicado en provocar los cambios observados en el potencial de membrana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar ópticamente múltiples neuronas identificadas y que interactúan de forma ética en los ganglios gástricos estomacales.

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Neurociencia

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