Ensayo clonigénicas: las células adherentes

Hola, mi nombre es Lum y actualmente estoy realizando mi doctorado en el Instituto del Corazón y la Diabetes BE IDI bajo la supervisión del Dr. Tom Carianne, jefe del Laboratorio de Medicina Epigenómica. En este video, demostraré el procedimiento conocido como Ensayo de Supervivencia Génica de Clon. Se trata de una técnica con 50 años de antigüedad, que permite evaluar el impacto de diferentes tratamientos como la exposición a radiaciones o agentes químicos sobre la viabilidad reproductiva celular.

El ensayo de supervivencia congénita es una técnica central en biología de la radiación para evaluar la sensibilidad a la radiación de diferentes líneas celulares y probar la eficacia de diferentes compuestos radioprotectores o radiosensibilizantes. Cuando se utiliza una línea celular adherente A, el ensayo de supervivencia criogénica consta de tres fases. En primer lugar, el tratamiento de una monocapa de células adherentes.

En segundo lugar, la preparación de una suspensión de una sola célula y el recubrimiento de un número conocido de células y platos pintados, y en tercer lugar, la tinción, el conteo y las colonias formadas después de un período de incubación. En este video, usaré células de sitio cino humano inmortalizadas para demostrar cómo se puede usar el ensayo bíblico poligénico para determinar las propiedades de protección de radio del antioxidante natural. Se siembran 1225 M de células en cinco milésimas de pulgada de medio de antemano, de modo que el día del experimento hay 1 millón de células por matraz.

Se añaden 50 microlitros del fármaco a diferentes concentraciones a las cinco milésimas de pulgada de medio en cada matraz debidamente etiquetado para lograr la concentración requerida, se utilizan cinco concentraciones, así como un vehículo de control en este caso, PBS. Después de agregar el fármaco, las células se incuban durante una hora en las condiciones adecuadas para la línea celular utilizada después de la incubación. El flujo, excluyendo el grupo de control, se irradia a la dosis elegida, que en este caso es de cuatro grises producidos por una fuente de cesio emisora de rayos gamma.

Después de la irradiación, los medios se vierten y cada matraz se lava con dos milésimas de pulgada de PBS durante cinco minutos. Después de verter el PBS, se añaden dos milésimas de pulgada de tripsina al 0,05% a cada matraz para separar las células adherentes A del matraz. A continuación, se añaden a cada matraz cinco mililitros inferiores de DMEM que contiene un 10% de suero bovino fetal para desactivar la tripsina.

A continuación, el contenido completo del fasc se transfiere a tubos falcon de 10 mililitros etiquetados. Una vez completados, estos tubos se centrifugan durante cinco minutos, después de lo cual el supinador se desecha cuidadosamente sin perturbar el paladar, y se agregan cinco milésimas de pulgada de medio de crecy a cada tubo. Se calcula la concentración de células para cada muestra, así como el volumen necesario de cada muestra para lograr la concentración final de células que se colocarán en cinco placas de Petri por muestra con cinco mililitros de medio cada una.

Por ejemplo, para el grupo de control, se siembran 100 celdas por plato, por lo que el volumen necesario para lograr 500 celdas por 25 mililitros se calcula para muestras más concentradas, realice una dilución de 10 veces o una dilución en serie de 100 veces para minimizar el error involucrado cuando se usan volúmenes inferiores a 100 microlitros. Ahora el volumen previamente calculado se prepara en un tubo Falcon que contiene 25 mililitros de medio para cada muestra. Las muestras ahora se pueden transferir a platos previamente etiquetados, agregando cinco mililitros a cada plato para facilitar su manejo y transporte.

Guarde los platos en un recipiente grande, estéril o desinfectado. A continuación, las placas se colocan en una incubadora humidificada en las condiciones adecuadas y se incuban durante ocho días. Si usa queratinocitos después de ocho días, retire con cuidado los platos de la incubadora y colóquelos todos uno por uno dentro de una campana extractora.

Tenga cuidado de manipular el lugar con cuidado para que no se moleste a las colonias que se hayan formado. Retira las tapas y añade cinco ml de solución salina al 0,9% a cada plato para lavarlos. Apunte la punta de preparación en la esquina del plato y evite tocar el fondo del plato para que no se raspen accidentalmente las colonias.

Después de cinco minutos, aspire cuidadosamente la solución salina. Ahora, las colonias se fijan con tres mililitros de fórmula al 4%, y se deben reemplazar los cables para evitar la evaporación. Después de 15 minutos a media hora, la fórmula se aspira y se desecha adecuadamente.

Las colonias ahora están listas para ser teñidas con 0.1% de violeta cristalino, se agregan cinco mililitros a cada plato y las tapas se reemplazan después de media hora a una hora. A continuación, el tinte se lava con agua destilada y los platos se invierten y se dejan secar durante la noche. Las colonias ya están listas para ser contadas.

Las colonias se pueden contar manualmente con un microscopio de disección. Cualquier grupo de células que contenga 50 o más células se considera una colonia. Y con esto concluye nuestra demostración del ensayo de supervivencia congénita.

La principal ventaja de este ensayo sobre otras técnicas es que es increíblemente sensible y puede detectar la supervivencia en un amplio rango incluso después de seis registros de muerte celular. Esto, esta sensibilidad se logra mediante la colocación de placas en números de celdas más grandes. Este ensayo se puede utilizar fácilmente para otros fines, como la prueba, como la prueba de citotoxicidad.

Gracias por mirar.