Name: Ensayo clonigénicas: las células adherentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende el ensayo clonogénico para evaluar la viabilidad reproductiva celular en líneas adherentes tras tratamientos con radiación o agentes químicos. Esta técnica de 50 años permite estudiar la sensibilidad a la radiación y probar compuestos radioprotectores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). HR es apoyado por un australiano de post-grado y premios BakerIDI brillante chispa. Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd (CRC-BID), creado y apoyado en cooperación del gobierno australiano de investigación del programa de Centros. CO es el receptor de un australiano de post-grado de premios y una beca complementaria CRC-BID.

1. Cultivo de células y experimental puesta en marcha <ol><li> Queratinocitos humanos se mantienen como monocapas en 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 15 ml de queratinocitos-SFM (K-SFM) (GIBCO, medio libre de suero), complementado con L-glutamina (2 mM), factor de crecimiento epidérmico (5 ng / mL), extracto de pituitaria bovina (40 pg / ml) y gentamicina 20 mg / ml. Las células se cultivan en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C. </li><li> Se siembran las células en 12 x 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 5 ml de K-SFM medio. </li></ol> Suspensiones de células individuales son preparadas por tripsinización. Las células se lavan con tampón fosfato salino y se incubaron con un 0,05% de tripsina / EDTA durante 5-10 minutos. Cuando las células empiezan a ser redondeados y aproximadamente el 30% son separados, 3 volúmenes de Dulbecco modificado medio de Eagle con 10% de suero fetal bovino se agrega para neutralizar la tripsina. Las células se separan por pipeteando arriba y abajo (20 veces). Las células se contaron usando un hemocitómetro. Un número adecuado de células son clasificados de acuerdo con el tiempo de duplicación de la línea celular (aproximadamente 20 horas para el consumo humano FEP-1811 queratinocitos). El objetivo es lograr la confluencia de ~ 90% (~ 10 6 células por frasco) en el día del experimento. Un experimento que consta de 12 frascos es óptimo para un solo ensayo clonogénico (seis de control no irradiados y seis frascos irradiados) que puede ser completado en aproximadamente cuatro horas. 2. El tratamiento y la irradiación <ol><li> Tratamiento de las células durante el tiempo necesario con una relevante modificación de la radiación compuesto y exponer las células a las radiaciones ionizantes o γ-radiación o radiografías. </li></ol> Por lo general seis frascos servir como eficiencia de plaqueo (sin tratamiento) y los controles de drogas solamente. Los otros seis frascos son irradiados. En este ejemplo, los queratinocitos humanos son tratados con distintas concentraciones de Cinnulin PF (CPF; Nutracéuticos Internacional de Integridad, Spring Hill, TN, EE.UU., los datos representativos de 20 mg / ml se muestra a continuación), soluble en agua formulación antioxidante natural, durante 1 hora a 37 ° C. Las células son irradiadas con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). 3. Enchapado <ol><li> Después del tratamiento, suspensiones de células individuales se obtienen como se describió anteriormente. </li><li> El número de células en cada muestra se contó con cuidado utilizando un hemocitómetro y se diluye de tal manera que el número de células apropiadas se siembran en placas de Petri (cinco réplicas de cada uno en 15 mm platos). Las planchas de eficiencia y / o sobrevivientes fracción debe preverse la hora de decidir el número de células a las semillas por placa. El objetivo es alcanzar un rango de entre 20 a 150 colonias. </li> Placas de Petri están dispuestos en una caja de plástico de la clonación humidificado y se incubaron en un 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C para la formación de colonias. </ol> El tiempo de incubación para la formación de colonias varía de 1-3 semanas para las líneas celulares diferentes, se acepta que el tiempo debe ser equivalente a por lo menos seis divisiones celulares. En este ejemplo, los platos de control de los queratinocitos humanos requieren ocho días para formar clones lo suficientemente grande que consta de 50 o más células. 4. Fijación y tinción de las colonias Complete los siguientes pasos en una campana extractora. <ol><li> Retire con cuidado los medios de comunicación de cada una de las placas por aspiración. </li><li> Lave cada placa con 5 ml de solución salina al 0,9%. </li><li> Fijar las colonias con 5 ml de 10% neutral solución de formalina tamponada durante 15-30 minutos. </li><li> Mancha con 5 ml 0,01% (w / v) de cristal violeta en dH 2 O durante 30-60 minutos. </li><li> Lavar el exceso de cristal violeta con dH 2 O y deje que los platos se sequen. </li></ol> 5. Recuento de colonias Estereomicroscopio <ol><li> Las colonias que contienen más de 50 células individuales se cuentan utilizando un microscopio estereoscópico. </li></ol> La imagen digital y contar con software de imágenes <ol><li> Las imágenes digitales de las colonias se han obtenido utilizando una cámara o un dispositivo de escaneo </li><li> Se cuentan las colonias utilizando imágenes de los paquetes de software de análisis como se describe a continuación. </li></ol> Conteo de células con ImageJ (Fiji Versión 1.44a) <ol><li> Abra el archivo de imagen en Fiji, vaya a Archivo -&gt; Abrir. </li><li> Si es necesario convertir la imagen en formato de 8 bits, vaya a Imagen -&gt; Ajustar umbral ...-&gt;. </li><li> Ajuste de umbral para reducir los niveles de fondo no específica de manera que sólo las colonias se detectan. </li><li> Contar las colonias con lo siguiente: Ir al proceso - binario&gt; -&gt; Buscar máximos. </li></ol> Para este formato de imagen, la tolerancia al ruido puede ser ajustado a 0. Asegúrese de que la opción de fondo claro está marcada y vista previa de la máxima detectada para comprobar que todas las colonias de células se han registrado correctamente.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

En este ejemplo humano FEP-1811 queratinocitos fueron tratadas con diferentes concentraciones de hasta 100 mg / mL ACB, se muestran los datos de 20 mg / ml ACB durante 1 hora a 37 ° C. Después de celdas de tratamiento fueron irradiados con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para los tratamientos de control no tratado sólo de drogas y 100 células fueron sembradas en cada placa de Petri y 1000 células por placa se colocaron pa...

<table><tbody><tr><td>Medio libre de suero para queratinocitos</td><td>Medio de crecimiento</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Suplementado con 2 mM de L-glutamina, 20&amp;#x03BC;g/ml de gentamicina, factor de crecimiento epidérmico y extracto de hipófisis bovina.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Tripsina al 0,05 % / EDTA para desprender células adherentes; stock 10x diluido en PBS sin Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Medio esencial modificado de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Medio de crecimiento</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Suplementado con 10 % de SFB y 20&amp;#x03BC;g/ml de gentamicina; utilizado para neutralizar la tripsina/EDTA.</td></tr><tr><td>Solución salina al 0,09 %</td><td>Solución</td><td></td><td></td><td>Utilizada para lavar colonias.</td></tr><tr><td>Solución de formalina tamponada neutra al 10 %</td><td>Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4 % de formaldehído; utilizada para fijar colonias.</td></tr><tr><td>Violeta de cristal</td><td>Polvo</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>Solución al 0,01 % de violeta de cristal, preparada en dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, utilizada para teñir colonias.</td></tr><tr><td>Iradiador Gammacell 1000 elite</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Caja de clonación</td><td></td><td></td><td></td><td>Caja de plástico con orificios perforados en lados opuestos de la tapa; para almacenar placas de Petri durante la incubación prolongada para la formación de colonias.</td></tr><tr><td>Stereo microscopio</td><td>Tipo 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Utilizado para contar colonias compuestas por &amp;gt;50 células.</td></tr></tbody></table>

ensayo clonigénicas: las células adherentes

Clonogenic Assay: Adherent Cells

El clonigénicas (o formadoras de colonias) de ensayo se ha establecido desde hace más de 50 años, el documento original que describe la técnica se publicó en 1956 1. Aparte de la documentación del método, el estudio de referencia inicial generó la primera dosis de radiación curva de respuesta de rayos X irradiados mamíferos (HeLa) las células en cultivo 1. Básicamente, el ensayo clonogénico permite una evaluación de las diferencias en la viabilidad de la reproducción (la capacidad de las células para producir descendencia, es decir, una sola célula para formar una colonia de 50 o más células) entre las células control no tratadas y las células que han sido sometidos a diversos tratamientos, como la exposición a las radiaciones ionizantes, diversos compuestos químicos (por ejemplo, agentes citotóxicos) o en otros casos la manipulación genética. El ensayo se ha convertido en la técnica más ampliamente aceptada en biología de la radiación y ha sido ampliamente utilizada para evaluar la sensibilidad a la radiación de las diferentes líneas celulares. Además, el ensayo clonogénico se utiliza comúnmente para controlar la eficacia de los compuestos de la radiación y la modificación para determinar los efectos de los agentes citotóxicos y otras terapias contra el cáncer en la capacidad de formación de colonias, en diferentes líneas celulares. Un típico experimento clonigénicas supervivencia utilizando líneas de células adherentes consta de tres componentes distintos: 1) el tratamiento de la monocapa celular en frascos de cultivo de tejidos, 2) la preparación de suspensiones de células individuales y las planchas de un número adecuado de células en placas de Petri y 3) la fijación y la tinción de las colonias después de un período de incubación correspondiente, que podría oscilar entre 1-3 semanas, dependiendo de la línea celular. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con líneas de células adherentes con el uso de un inmortalizado línea celular humana de queratinocitos (FEP-1811) 2. Además, nuestros objetivos son describir las características comunes de los ensayos clonogénicos incluyendo el cálculo de la eficiencia de plaqueo y las fracciones de la supervivencia después de la exposición de las células a la radiación, y para ejemplificar la modificación de la radiación de respuesta con el uso de una formulación antioxidante natural.

La aplicabilidad del ensayo para evaluar la viabilidad clonigénicas reproductiva se ha establecido desde hace más de 50 años. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con células adherentes.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

El ensayo clonogénico (o de formación de colonias) se estableció hace más de 50 años; el artículo original que describe la técnica se publicó en 19561. ...

Hola, mi nombre es Lum y actualmente estoy realizando mi doctorado en el Instituto del Corazón y la Diabetes BE IDI bajo la supervisión del Dr. Tom Carianne, quien es el jefe del Laboratorio de Medicina Epigenómica. En este video, demostraré el procedimiento conocido como ensayo de supervivencia clonogénica. Esta es una técnica de 50 años de antigüedad, que permite evaluar el impacto de diferentes tratamientos, como la exposición a radiación o agentes químicos, sobre la viabilidad reproductiva celular.El ensayo de supervivencia congénico es una técnica fundamental en biología de la radiación para evaluar la sensibilidad a la radiación de diferentes líneas celulares y probar la eficacia de diversos compuestos radioprotectores o radiosensibilizantes. Al utilizar una línea celular adherente, el ensayo de supervivencia criogénico consta de tres fases. Primero, el tratamiento de una monocapa de células adherentes.En segundo lugar, la preparación de una suspensión de células individuales y la siembra de un número conocido de células en placas marcadas, y en tercer lugar, la tinción, el recuento y las colonias formadas tras un período de incubación. En este video, utilizaré células de linaje inmortalizado de origen humano para demostrar cómo el ensayo de capacidad clonogénica puede emplearse para determinar las propiedades radioprotectoras del antioxidante natural. Se siembran 1225 matraces con células en cinco mililitros de medio previamente, de modo que el día del experimento haya un millón de células por matraz.Se agregan 50 microlitros del fármaco a diferentes concentraciones a los cinco mililitros de medio en cada matraz debidamente etiquetado para alcanzar la concentración requerida; se utilizan cinco concentraciones, así como un control de vehículo en este caso, PBS. Después de añadir el fármaco, las células se incuban durante una hora en las condiciones adecuadas para la línea celular utilizada. Tras la incubación, los grupos experimentales, excluyendo el grupo control, se irradian a la dosis elegida, que en este caso es cuatro grays producidos por una fuente de cesio emisora de rayos gamma.Después de la irradiación, se eliminan los medios y cada frasco se lava con dos mililitros de PBS durante cinco minutos. Después de verter el PBS, se añaden dos mililitros de tripsina al 0,05% a cada frasco para desprender las células adherentes A del frasco. Luego se añaden cinco mililitros inferiores de DMEM que contienen suero bovino fetal al 10% a cada frasco para desactivar la tripsina.A continuación, se transfiere todo el contenido del fascículo a tubos cónicos de 10 mililitros etiquetados. Una vez finalizado, estos tubos se centrifugan durante cinco minutos, tras lo cual se descarta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y se añaden cinco mililitros de medio crecy a cada tubo. Se calcula la concentración de células de cada muestra, así como el volumen necesario de cada muestra para alcanzar la concentración final de células que se sembrarán en cinco placas de Petri por muestra, con cinco mililitros de medio cada una.Por ejemplo, para el grupo control, se siembran 100 células por placa, por lo que se calcula el volumen necesario para obtener 500 células por 25 mililitros; para muestras más concentradas, realice una dilución 10 veces o una dilución seriada 100 veces para minimizar el error asociado al uso de volúmenes menores a 100 microlitros. Ahora, el volumen previamente calculado se prepara en un tubo Falcon que contiene 25 mililitros de medio para cada muestra. Las muestras ya pueden transferirse a placas previamente etiquetadas, añadiendo cinco mililitros a cada placa para facilitar su manipulación y transporte.Guarde los cultivos en un recipiente grande, estéril o desinfectado. A continuación, coloque los cultivos en una incubadora humectada en las condiciones adecuadas e incube durante ocho días. Si se van a utilizar queratinocitos después de ocho días, retire cuidadosamente los cultivos de la incubadora y colóquelos uno por uno dentro de una campana extractora.Tenga cuidado de manipular el lugar con suavidad para no perturbar las colonias que se hayan formado. Retire las tapas y agregue cinco ml de solución salina al 0,9 % a cada placa para lavarlas. Dirija la punta del preparado hacia la esquina de la placa y evite tocar el fondo para no desprender accidentalmente las colonias.Después de cinco minutos, aspire cuidadosamente la salina. Ahora, las colonias se fijan con tres mililitros de 4%formula, y los tapones deben reemplazarse para evitar la evaporación. Después de 15 minutos a media hora, se aspira y se desecha adecuadamente la formula.Las colonias ya están listas para ser teñidas con violeta de cristal al 0,1 %; se añaden cinco mililitros a cada placa y las tapas se reponen tras media hora a una hora. El colorante luego se elimina con agua destilada y las placas se invierten y se dejan secar durante la noche. Las colonias ya están listas para ser contadas.Las colonias pueden contarse manualmente utilizando un microscopio estereoscópico. Cualquier agrupación de células que contenga 50 o más células se considera una colonia. Y eso concluye nuestra demostración del ensayo de supervivencia congénico.La principal ventaja de este ensayo frente a otras técnicas es que es extremadamente sensible y puede detectar supervivencia en un rango amplio incluso tras una reducción de seis órdenes de magnitud en el número de células. Esta sensibilidad se logra sembrando números mayores de células. Este ensayo puede utilizarse fácilmente para otros fines, como evaluar la citotoxicidad.Gracias por ver.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo de vídeo se muestra cómo se discrimina y enumerar bona fide las células madre neurales en una población mixta de células precursoras neurales con el neuronales formadoras de colonias de células de ensayo.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Este video describe el ensayo de formación de colonias, que ayuda a determinar la capacidad de las células de cáncer de pulmón para proliferar indefinidamente y formar colonias individuales. Podemos analizar el efecto de un agente anticancerígeno sobre las células formadoras de colonias mediante el análisis de los cambios en el número y/o tamaño de las colonias resultantes.

Ensayo de formación de colonias: evaluación de la eficacia de los agentes anticancerígenos en las células de cáncer de pulmón formadoras de colonias

En este video, realizamos un ensayo clonogénico de queratinocitos recolectados de ratones adultos para determinar la capacidad de las células individuales para proliferar y formar colonias. Esta técnica de recolección de queratinocitos es útil para estudiar otros aspectos posteriores de la carcinogénesis química cutánea y la promoción tumoral.

Ensayo de formación de colonias de queratinocitos: un ensayo in vitro para evaluar la capacidad de los queratinocitos para convertirse en colonias

Desarrollamos un modelo in vitro de latencia en la médula ósea para células de cáncer de mama sensibles al estrógeno. El objetivo de este protocolo es demostrar el uso del modelo para el estudio de la biología molecular y celular de la latencia y para la generación de hipótesis para su posterior ensayo in vivo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Latencia Modelo de cáncer de mama estrógeno-sensibles en la médula ósea: una herramienta de Estudios mecanismo molecular y Hipótesis Generación

Las células madre neurales (NSC) se refieren a células que pueden auto-renovarse y diferenciarse en los tres linajes neuronales. A continuación, se describe un protocolo para determinar la frecuencia NSC en una población celular dada usando neurosphere formación y diferenciación en condiciones clonales.

Enumeración de células madre neurales Usando ensayos clonales

Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando en sistemas de imágenes in vivo.

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

Detección de canales iónicos en células cancerosas

Fabricación y validación de una plataforma de extensión que ofrece un mayor control sobre la oxigenación espacial y temporal en una placa de 6 pocillos. El dispositivo se adapta a una serie de sistemas de cultivo y se puede utilizar para investigar los efectos del oxígeno en la cicatrización de heridas.

Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

Aprende el ensayo clonogénico para evaluar la viabilidad reproductiva celular en líneas adherentes tras tratamientos con radiación o agentes químicos. Esta técnica de 50 años permite estudiar la sensibilidad a la radiación y probar compuestos radioprotectores.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

Explorar más videos