Las células de patrón indio electrodos ópticamente transparente de óxido de estaño

Hola, soy Isha. Soy un estudiante de posgrado de segundo año en el laboratorio del Dr. Zen. Estamos aquí en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de California Davis.

Hoy voy a mostrarles el control de Ian en electrodos de óxido de indio 10 ópticamente transparentes microfabricados en ingeniería de tejidos y se han realizado esfuerzos de regeneración para imitar el microambiente del órgano. Para crear este microambiente in vitro, es esencial aislar espacial y temporalmente las células en un sustrato. Estamos interesados en diseñar superficies en las que podamos controlar la ubicación de diferentes tipos de células hepáticas.

En el experimento de hoy, utilizaremos la modificación de la superficie, la microfabricación y la electroquímica para formar una superficie que se pueda cambiar de no adhesiva de celda a adhesiva de celda. El primer paso es la fotolitografía. Aquí hay un diagrama de flujo de cómo se va a trabajar ese proceso.

El azul es la luz del vidrio, el verde es óxido de indio 10 que está recubierto sobre la luz del vidrio. Primero, lo que vamos a hacer es girar la capa de color rojo que se muestra aquí encima de la luz de vidrio recubierta de óxido de indio 10. Luego vamos a pasar eso a través de una fotomáscara a la luz ultravioleta y las regiones expuestas se desarrollarán en una solución en revelado.

Las regiones ITO que no estén protegidas por fotorresistencia se eliminarán en IT oing. Y luego, finalmente, toda la fotorresistencia restante se eliminará en acetona para formar nuestros electrodos ITO. Este es el diagrama de flujo de los tres pasos restantes.

En primer lugar, vamos a modificar toda la superficie con cilindro de clavija. Esto hará que la superficie no se ensucie y ninguna célula o proteína se unirá a ella. A continuación, vamos a usar la electroquímica para absorber específicamente el cilindro de clavija de los dos electrodos que hicimos anteriormente.

Y finalmente, vamos a incubar fibroblastos en la parte superior de la superficie y se unirán selectivamente solo a las regiones de la tira. Así que ahora estamos listos para comenzar nuestro experimento. El primer paso consiste en la fotolitografía, que se va a realizar en una sala blanca.

Así que sigamos adelante y entremos en la sala limpia. Así que ahora aquí estamos, en nuestra sala limpia. Antes de comenzar nuestro experimento, lo que vamos a hacer es tener nuestras muestras recubiertas de óxido de indio y estaño o ITO horneadas a 200 C en nuestro horno.

De esa manera podemos deshidratar todas nuestras superficies. Y después de hornearlo a 200 C es cuando vamos a colocarlo en nuestra tecnología de centrifugado y aplicar la fotorresistencia. Así que después de deshidratar nuestro sustrato ITO, vamos a cogerlo y colocarlo en el mandril de la tecnología de centrifugado.

Este mandril es lo suficientemente grande como para contener un cuarto de luz de vidrio. Luego vamos a, vamos a aplicar vacío. Después de eso, aplicamos tono positivo, fotorresistencia sobre el sustrato.

Después de la aplicación de la fotorresistencia, simplemente seguimos adelante y comenzamos. Esto implica dos pasos. El primero es el esparcimiento y el segundo es el recubrimiento de rotación en el paso de esparcimiento.

El mandril gira a 800 RPM y eso distribuye uniformemente la fotorresistencia en toda la superficie. Sin embargo, el siguiente es el paso de giro, que está a 4.000 RPN y a 4.000 RPM, forma una capa muy fina. Por delgado me refiero a aproximadamente una micra.

Si rompes la palabra foto, resiste, se convierte en foto y resiste. Se activa con la luz. Por lo tanto, trabajamos en la sala limpia y utilizamos luz filtrada para que nuestra puerta fotográfica no se active con la luz y sea resistente a los activos, que utilizaremos más adelante cuando realicemos el grabado.

Así que ahora hemos terminado con el recubrimiento de giro, la fotorresistencia en la superficie, y simplemente vamos a sacarlo y pasar a nuestro siguiente paso. Entonces, después de hornear la muestra durante un minuto y 45 segundos, la tomaremos de la placa calefactora y la pasaremos a nuestro revestimiento de máscara de cañón. Aquí tomamos una mascarilla que necesitamos y luego colocamos la mascarilla encima de nuestro sustrato para tener una impresión de contacto entre nuestro sustrato con puerto resistente y la mascarilla, la colocamos con una oblea de vidrio de cuatro pulgadas solo para agregarle peso.

Y una vez que terminamos con eso, simplemente volvemos a poner el obturador y luego exponemos la muestra a la luz ultravioleta. Una vez completada la exposición, simplemente alejamos la tapa en orden inverso. Sacamos nuestra oblea de vidrio, sacamos nuestra mascarilla y luego retiramos nuestro sustrato y lo llevamos para su desarrollo.

Después de exponer la muestra, la colocamos en una solución de desarrollador. Cuando la muestra se expuso a la luz ultravioleta, se formaron iones de hidrógeno, que se neutralizaron con la base y la solución reveladora y se eliminaron de la superficie. Así que ahora quieres asegurarte de que cuando estés haciendo la muestra, estés constantemente desviando el sustrato.

Y cuando haces eso, puedes ver que en aproximadamente el primer minuto o minuto y medio, las regiones expuestas se desarrollan y se eliminan de la superficie. Pero para que se produzca el desarrollo completo, lo dejamos reposar en la solución para desarrolladores durante unos cinco minutos. Una vez que se complete el desarrollo, lo vamos a sacar, lo vamos a lavar y regar y luego lo secaremos con una pistola de nitrógeno.

Una vez que hayamos secado nuestra muestra, vamos a tomarla y visualizarla bajo nuestro microscopio. Aquí estamos mirando la muestra bajo un microscopio. Lo sacamos después de revelarlo durante cinco minutos.

Hay dos regiones que puede ver aquí, una región más oscura que está cubierta por la fotorresistencia y la región más clara donde se ha eliminado la fotorresistencia. En relación con la máscara que usamos antes, las regiones más oscuras de la máscara eran las regiones más oscuras que vemos ahora mismo bajo el microscopio, mientras que las regiones claras que vemos aquí eran transparentes en la máscara. Uno de los diseños que se muestra aquí son matrices de diferentes tamaños que van desde 500 hasta 50 micras, mientras que el otro diseño es un círculo de 1000 micras que simplemente están interconectados.

Así que aquí tenemos un diseño diferente que se hizo utilizando el mismo procedimiento. Aquí tenemos electrodos direccionables individualmente. Lo que quiero decir con esto es que las diferentes regiones de ITO están interconectadas y se pueden activar de manera diferente.

Por ejemplo, aquí, las regiones circulares centrales, están conectadas a una almohadilla eléctrica, mientras que las regiones rectangulares más externas, están conectadas a una almohadilla eléctrica diferente. De esta manera podemos estimular estas dos superficies diferentes en diferentes momentos temporales. Después de mirar nuestras muestras, el siguiente paso al que pasamos es grabar la muestra.

Las regiones que no estén protegidas por las fotos se grabarán en un grabado IT. Antes de hacerlo, tenemos que asegurarnos de que nos ponemos la ropa adecuada, ya que el grabado ITO contiene ácidos. Y ahora, después de ponerme mi bata protectora contra el ácido, me voy a poner un poco de grabado ITO en un vaso de precipitados de vidrio.

El grabado ITO está compuesto por un 20% de cloruro de hidrógeno, un 5% de ácido nítrico y el resto es agua desionizada. Y luego trae mi muestra y colócala en el grabado. Anteriormente, en el microscopio, vimos que había algunas regiones que no estaban protegidas por fotoelevaciones.

Los ácidos en el grabado de ITO atacaron esas regiones y causaron que el ITO de esas regiones fuera grabado. A medida que el ITO se degrada lentamente desde la superficie, cambia de color. Aquí se puede ver que cambió de un cambio azulado que tenía originalmente a este cambio violáceo y ahora está pasando al cambio amarillo.

El cambio de color indica que el ITO se está grabando. Así que ahora aquí estamos a 15 minutos. Todo el ITO, está completamente grabado.

Y lo que ves en este momento son las fotos están protegidas por las regiones ITO. Entonces, una vez que se completa el grabado, todavía quedan algunos ácidos en la superficie. Para eliminar estos ácidos, vamos a colocarlo en una solución de carbonato de sodio, que va a neutralizar todo el ácido.

Después de neutralizar los ácidos, lo sacaremos y lo limpiaremos con agua desionizada y luego lo secaremos con el nitrógeno hecho. Así que ahora hemos terminado con el grabado ácido. No más ácido, me he quedado sin mi bata caliente.

Vamos a sacarlo y transferirlo y visualizarlo bajo nuestro microscopio. Así que ahora estamos observando la muestra bajo el microscopio. Esto es después de que realizamos el grabado IT.

En este caso, las regiones más oscuras son regiones de vidrio de las que se extrajo el ITO. Y las regiones más claras son ITO que están protegidas por fotorresistencia en este caso. Una vez más, estos son los arrays de 500 a 50 micras y en el otro caso tenemos nuestros círculos interconectados de mil micras cada uno.

Así que miramos bajo el microscopio y vimos que había regiones de vidrio y regiones ITO, pero las regiones ITO estaban protegidas por fotorresistencia. Ahora tenemos que sacar este fotorresistente. Así que todo lo que vamos a hacer es tomar nuestro sustrato, ponerlo en acetona, y luego colocarlo en el sonicateto y simplemente sonicar durante 10 minutos.

Esto asegura que toda la fotorresistencia quitada, se podría usar como tonos por sí misma, pero mediante golpes sónicos, que utiliza ondas sonoras para golpear y que asegura que la fotorresistencia se elimine correctamente. Después de sacarlo del aire sónico, se lava en agua desionizada, se seca nuevamente en nitrógeno y ahora puede ver los patrones claramente en el sustrato de vidrio. Estos fueron los patrones que inicialmente estaban protegidos por la fotorresistencia.

Ahora que hemos examinado nuestras muestras y hemos encontrado o hecho nuestros patrones ITO, vamos a comenzar nuestra segunda fase del experimento. Esta fase consiste en la modificación de la superficie con una monocapa autoensamblada de ciclina PEG. Pero antes de hacer eso, tenemos que asegurarnos de que la superficie es reactiva.

Para ello, lo colocamos en un limpiador de plasma. Esto introduce grupos hidroxilo en la superficie y, por lo tanto, la hace reactiva. Para ello, simplemente colocamos nuestra muestra en el limpiador de plasma y luego encendemos nuestra bomba de vacío.

Encendemos el oxígeno, encendemos la energía principal. Esta energía se utiliza para convertir el gas oxígeno en plasma, que luego se introduce y así forma las ranuras de hidroxilo. Y una vez que encendemos la alimentación, seguimos adelante y le damos a start.

Así que ahora, una vez finalizado el proceso, sacamos nuestro sustrato, lo guardamos en un plato y nos dirigimos fuera de la bata de la sala limpia y pasamos al siguiente paso. Así que ahora que ya estamos fuera de la sala limpia y hemos terminado nuestro patronaje ideal, vamos a modificar la superficie que acabamos de modelar con polietilenglicol, CYLIN o PEG Cylin. Es clave saber que el cilindro peg es reactivo a la humedad.

Por lo tanto, todo lo que utilicemos madera tiene que estar libre de humedad. La cristalería que hemos utilizado aquí, los platos de las mascotas, se han horneado a cien grados centígrados durante toda la noche. Y la cuba que vamos a utilizar como disolvente también es anhidra.

No contiene humedad. Así que ahora voy a verter tun, tolu anhidro en estos dos altavoces de vidrio, uno de los cuales tiene nuestra muestra en él. Ahora tenemos que usar dos placas de Petri porque una de ellas es donde vamos a hacer la modificación.

Y el otro lo vamos a usar más adelante, cuando termine la modificación, para lavar nuestro sustrato. Entonces, después de poner nuestros platos de pizza de vidrio, voy a tomarlo y transferirlo a nuestra cámara de esclusa aquí en la guantera. Después de cerrar la cámara de la esclusa, vamos a introducir nitrógeno en la cámara.

Ahora la cámara principal ya está llena de nitrógeno. Por lo tanto, no queremos abrir esta cámara a menos que esté llena de nitrógeno. Una vez que ambas cámaras estén en nitrógeno, vamos a transferir todas nuestras muestras junto con una pipeta.

Vamos a tener nuestra clavija y una pinza que vamos a usar más adelante para transferir las muestras. Así que vamos a ponernos los guantes, abrir la cámara aquí y sacar lenta y cuidadosamente todo lo que tenemos en nuestra esclusa de aire y colocarlo en la cámara principal. Se trata de la placa de Petri con nuestro sustrato y la placa de Petri solo con tolueno que vamos a utilizar para el lavado.

El pxi que está presente fue empaquetado bajo nitrógeno y no debe abrir esta botella a menos que esté en un ambiente de nitrógeno. Por lo tanto, una vez que quieras sacar la muestra, la vuelves a meter en la bolsa. Así que sacas tu cilindro y la concentración que vamos a usar es un 2% en tolueno.

Así que lo sacas, lo pones en el alto y lo mezclamos. Pozo también cámara y asegúrese de que se mezcle bien y luego deje incubar la muestra en Toin durante dos horas. Así que ahora que han pasado dos horas, nuestra muestra ha estado en Pxi, vamos a sacar la muestra y transferirla a una solución fresca donde la lavaremos brevemente, la desviaremos y la moveremos a nuestra cámara de esclusa.

Una vez que esté en nuestra cámara de esclusa, simplemente vamos a abrir nuestra cámara y sacar nuestra superficie modificada y podemos conducir con la pistola de nitrógeno. Lo colocamos de nuevo en una placa de Petri limpia y seca y lo pasamos a colocar en un horno a cien grados C durante dos horas más. Así que ahora que las muestras se han horneado en el horno a cien grados centígrados durante dos horas, vamos a coger y conectar nuestros cables a los electrodos que hemos preparado.

Lo hacemos haciendo una mezcla uno a uno de epoxi de plata y un agente de curado. Así que este es el epoxi de plata, y ahora le añadimos la misma cantidad de curado. Queremos mezclarlo bien, y luego vamos a tomar esto y usarlo para conectar nuestros cables.

Así que colocamos nuestro cable en los electrodos que queremos usar y luego lo codificamos. La soldadura no funciona en ITO, por lo tanto, tenemos que usar epoxi de plata y el agente de curado. Y luego horneamos para que se elimine todo el agente de curado que usamos anteriormente y se endurezca y podamos usarlo como electrodo.

Así que ahora que terminamos dos fases, vamos a comenzar la tercera fase de un experimento, que es realizar la parte de electroquímica. Para ello, vamos a tomar una muestra y colocarla en nuestra celda electroquímica. Después de colocarlo en nuestra celda electroquímica, solo vamos a colocar una junta tórica encima.

Eso va a aislar la región donde va a ocurrir la electroquímica, y luego simplemente vamos a sellar la celda. Así que he colocado mi muestra con mi cable conectado en la celda electroquímica. Ahora estoy listo para usar la estadística de potencial para aplicar el voltaje.

Así que el cable blanco, lo voy a conectar aquí mismo al electrodo de referencia, el rojo, el contraelectrodo, y finalmente el verde que voy a conectar a nuestro electrodo de trabajo. Una vez que todos estos electrodos estén conectados, solo voy a agregar una solución x de solución salina de tampón de fosfato fosfato o PBS al electroquímico en sí. Ahora, solo para aclarar esto, la forma en que va a funcionar es que toda la superficie a partir de ahora, está modificada con pxi.

Por lo tanto, todos los electrodos, incluidas las regiones vítreas circundantes, se modifican con pxi. Una vez que aplico el voltaje en todas partes, donde está presente el ITO, que son los diseños de electrodos que hicimos, la isla de clavijas se va a desprender solo de esa superficie y no se va a afectar nada en las regiones circundantes. Por lo tanto, eliminamos selectivamente la isla de clavijas de nuestro sustrato.

Así que ahora voy a presionar reproducir y eso se iniciará y aplicará un voltaje de menos 1.4 voltios a nuestro electrodo de trabajo. Cuando se aplica el voltaje, hay un cambio de color que se puede ver en los electrodos. Cambia del tinte azul verdoso transparente que teníamos que marrón.

Sospechamos que podría haber una reacción de oxidación que podría estar ocurriendo en los electrodos que hace que se vuelvan marrones. Este es también uno de los indicadores de que el pxi de la superficie fue efectivamente despojado de la superficie. Y una vez más, dondequiera que veas marrón, de ahí es de donde se ha eliminado la isla de clavijas.

Y las regiones de vidrio circundantes todavía tienen PXI ensamblado en ellas. Así que aplicamos un voltaje de menos 1,4 vatios durante 60 segundos. Esto da tiempo suficiente para eliminar todos los pxi que estaban presentes en los electrodos.

También podemos utilizar este método para pelar electrodos que se direccionan individualmente. En este caso, había tres filas de círculos que se van a eliminar. Podemos seleccionar qué, cuáles queremos pelar utilizando los tres electrodos diferentes.

Así que ahora hemos terminado con éxito nuestra tercera parte de electroquímica en la que hemos eliminado selectivamente la sedimentación PG de nuestros electrodos ITO. Lo lavé brevemente, lo lavé con PBS y agua desionizada, quité el cable y coloqué las muestras en placas normales de seis pocillos. Ahora vamos a pasar a las células cultivadas en estos electrodos.

Así que ahora aquí estamos en la sala de cultivo de tejidos. Para la fase final del experimento, hoy vamos a utilizar fibroblastos, tres células T, tres células. La concentración que utilizamos para sembrar las células está entre 0,5 y 1,5 millones de células por mil.

Después de sembrar las células, dejamos que las células ingresen a nuestra muestra durante aproximadamente 20 minutos. Eso le daría tiempo suficiente para adjuntarlo a las regiones despojadas. Así que lo colocaremos en la incubadora.

Así que ahora han pasado 20 minutos y estamos listos para mirar las células que se han modelado en las regiones despojadas de ITO, las regiones marrones que vimos antes, y solo se unirían específicamente a esas regiones y no se adherirán a ningún lugar fuera de esas regiones. Aquí se puede ver que las regiones marrones eran regiones ITO a las que se les quitó pxi. Mediante el uso de la electroquímica, las células se han unido solo a estas regiones marrones y no a las regiones de vidrio circundantes.

En este otro fotograma, una vez más, vemos que el seltz se adhiere a las regiones despojadas. Esas son las regiones marrones, pero por encima de esas regiones marrones apenas se puede ver y el diseño ITO PEG no se eliminó de este diseño ITO, por lo tanto, no hay celdas adjuntas a él. Bien, eso es todo.

Hemos terminado con el protocolo y las celdas tienen un patrón en los electrodos ITO y eso es exactamente lo que queríamos. Acabo de mostrarles el control de la adhesión celular en electrodos de óxido de indio 10 ópticamente transparentes microfabricados. Hoy os he enseñado cómo modelar tres fibroblastos THREET en estos electrodos.

También hemos utilizado el mismo procedimiento para modelar las células Hep G dos, las células satélite y las células primarias de rata. Las técnicas actuales de modelado de células solo permiten el ensamblaje de dos tipos de células en la superficie. La flexibilidad de esta técnica permitirá el ensamblaje de múltiples tipos de células en la superficie que estén aisladas espacialmente en el futuro.

Planeamos utilizar esta técnica para aislar espacialmente tres tipos diferentes de células hepáticas en el sustrato ITO con el fin de imitar el microambiente in vivo. Al hacer esto, podemos aislar espacialmente células inmaduras o células madre junto con células maduras y células de soporte. Esto creará un entorno instructivo para que las células inmaduras crezcan y se diferencien.