Las células de patrón indio electrodos ópticamente transparente de óxido de estaño

Hola, soy Isha. Soy estudiante de posgrado del segundo año en el laboratorio del Dr. Zen. Estamos aquí en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de California en Davis.

Hoy voy a mostrarle el control de Ian sobre electrodos de óxido de indio transparentes ópticamente microfabricados. En los esfuerzos de ingeniería de tejidos y regeneración se ha intentado imitar el microambiente del órgano. Con el fin de crear este microambiente in vitro, es esencial aislar espacial y temporalmente las células sobre un sustrato. Estamos interesados en diseñar superficies en las que podamos controlar la ubicación de diferentes tipos de células hepáticas.

En el experimento de hoy, utilizaremos modificación de superficies, microfabricación y electroquímica para formar una superficie que pueda cambiar de no adherente a adherente para las células. El primer paso es la fotolitografía. A continuación se muestra un diagrama de flujo de cómo se llevará a cabo ese proceso.

El azul es la luz de vidrio, el verde es el óxido de indio 10 que está recubierto encima de la luz de vidrio. Primero, lo que vamos a hacer es aplicar por centrifugación una capa de resistencia fotográfica roja, mostrada aquí, encima del vidrio con óxido de indio 10. Luego, pasaremos ese material a través de una máscara fotográfica expuesta a luz ultravioleta y las regiones expuestas se desarrollarán en una solución reveladora.

Las regiones de ITO que no están protegidas por la resistencia fotosensible serán eliminadas durante la etapa de grabado del ITO. Y finalmente, toda la resistencia fotosensible restante será eliminada en acetona para formar nuestros electrodos de ITO. A continuación se muestra el diagrama de flujo de los tres pasos restantes.

Primero, vamos a modificar toda la superficie con peg ciliar. Esto hará que la superficie sea no adherente y ninguna célula ni proteína se unirá a ella. A continuación, vamos a utilizar la electroquímica para absorber específicamente el peg ciliar a partir de los dos electrodos que preparamos anteriormente.

Y finalmente, vamos a incubar fibroblastos encima de la superficie y estos se unirán selectivamente solo a las regiones de las tiras. Así que ahora estamos listos para comenzar nuestro experimento. El primer paso consiste en la fotolitografía, que se llevará a cabo en una sala limpia.

Así que vamos a proceder a entrar en la sala limpia. Ahora estamos en nuestra sala limpia. Antes de comenzar nuestro experimento, lo que haremos será hornear nuestras muestras recubiertas con óxido de indio y estaño, o ITO, a 200 °C en nuestro horno.

De esta manera podemos deshidratar todas nuestras superficies. Y después de calentarla a 200 °C es cuando la colocaremos en nuestra centrífuga y aplicaremos efectivamente la resistencia fotosensible. Por lo tanto, tras deshidratar nuestro sustrato de ITO, lo tomaremos y lo colocaremos sobre el portamuestras de la centrífuga.

Este portabrocas es lo suficientemente grande como para sostener un cuarto de un vidrio luminoso. Luego, vamos a aplicar vacío. Después de eso, aplicamos una resistencia fotosensible de tono positivo sobre el sustrato.

Después de aplicar la resistencia fotosensible, simplemente procedemos a comenzar. Esto implica dos pasos. El primero es la distribución, y el segundo es el recubrimiento por centrifugado en el paso de distribución.

El portabrocas gira a 800 RPM y simplemente distribuye uniformemente la resina fotosensible sobre toda la superficie. Sin embargo, el siguiente paso es el de centrifugado, que se realiza a 4.000 RPM y, a esta velocidad, forma una capa muy delgada. Por delgada me refiero aproximadamente a un micrómetro.

Si se divide la palabra photo, resist, se separa en photo y resist. Se activa mediante la luz. Por lo tanto, trabajamos en sala blanca y utilizamos luz filtrada para que nuestro fotoresist no se active por la luz, y es resistente a los agentes, una propiedad que utilizaremos más adelante cuando realicemos el grabado.

Ahora hemos terminado con el recubrimiento por centrifugado del fotoresist sobre la superficie, así que simplemente lo retiraremos y pasaremos a nuestro siguiente paso. Después de hornear la muestra durante un minuto y 45 segundos, la sacaremos de la placa calefactora y la llevaremos a nuestro alineador de máscaras de contacto. Aquí tomamos la máscara que necesitamos y la colocamos encima de nuestro sustrato para lograr una impresión por contacto entre nuestro sustrato con el fotoresist y la máscara; colocamos encima una oblea de vidrio de cuatro pulgadas simplemente para añadir peso.

Y una vez que terminamos con eso, simplemente volvemos a colocar el obturador y luego exponemos la muestra a luz UV. Una vez completada la exposición, retiramos la tapa en orden inverso. Sacamos nuestra oblea de vidrio, retiramos nuestra máscara y luego extraemos nuestro sustrato y lo llevamos a desarrollar.

Después de exponer la muestra, la colocamos en una solución reveladora. Cuando la muestra fue expuesta a luz ultravioleta, se formaron iones de hidrógeno, que se neutralizaron con la base en la solución reveladora y en realidad se eliminaron de la superficie. Por lo tanto, ahora debe asegurarse de que, al manipular la muestra, mueva constantemente el sustrato.

Y cuando se hace eso, se puede observar en aproximadamente el primer minuto o minuto y medio que las regiones expuestas realmente se desarrollan y se eliminan de la superficie. Pero para que ocurra un desarrollo completo, lo dejamos en la solución reveladora durante unos cinco minutos. Una vez completado el desarrollo, lo sacaremos, lo lavaremos con agua desionizada y luego lo secaremos utilizando una pistola de nitrógeno.

Una vez que hayamos secado nuestra muestra, la llevaremos para visualizarla bajo el microscopio. Aquí estamos observando la muestra bajo un microscopio. Acabamos de sacarla tras revelarla durante cinco minutos.

Hay dos regiones que puede observar aquí: una región más oscura cubierta por la resistencia fotosensible y una región más clara donde se ha eliminado la resistencia fotosensible. En relación con la máscara que utilizamos anteriormente, las regiones oscuras en la máscara corresponden a las regiones oscuras que vemos actualmente bajo el microscopio, mientras que las regiones claras que observamos aquí eran transparentes en la máscara. Uno de los diseños mostrados aquí consiste simplemente en matrices de diferentes tamaños que van desde 500 hasta 50 micrones, mientras que el otro diseño está formado por círculos de 1000 micrones que están interconectados.

Aquí tenemos un diseño diferente que fue elaborado utilizando el mismo procedimiento. Aquí contamos con electrodos individualmente direccionables. Con esto quiero decir que diferentes regiones del ITO están interconectadas y pueden activarse de manera distinta.

Por ejemplo, aquí, las regiones circulares centrales están conectadas a una almohadilla eléctrica, mientras que las regiones rectangulares más externas están conectadas a una almohadilla eléctrica diferente. De este modo, podemos estimular estas dos superficies distintas en diferentes momentos. Después de observar nuestras muestras, el siguiente paso al que pasamos es grabar la muestra.

Cualquier región que no esté protegida por la foto será eliminada mediante un ataque químico de ITO. Antes de hacerlo, debemos asegurarnos de usar la vestimenta adecuada, ya que el ataque químico de ITO contiene ácidos. Ahora, después de ponerme la bata protectora contra ácidos y colocarme el protector facial, voy a verter algo de disolución de ataque de ITO en un vaso de precipitados de vidrio.

La corrosión de ITO está compuesta por 20% de ácido clorhídrico, 5% de ácido nítrico y el resto es agua DI. Luego, tome la muestra y colóquela en la solución corrosiva. Anteriormente, en el microscopio, observamos que había algunas regiones que no estaban protegidas por los relevos fotográficos.

Los ácidos en la grabación de ITO atacaron esas regiones y provocaron que el ITO de esas zonas fuera eliminado por grabado. A medida que el ITO se degrada lentamente desde la superficie, cambia de color. Aquí puede observarse que pasó de un tono azulado que tenía originalmente a este tono púrpura, y ahora está pasando al tono amarillento.

El cambio de color indica que el ITO está siendo eliminado por ataque químico. Ahora estamos a los 15 minutos. Todo el ITO ha sido completamente eliminado por ataque químico.

Y lo que ven ahora son fotos de regiones de ITO protegidas. Entonces, después de que finaliza el atacado, aún quedan algunos ácidos sobre la superficie. Para eliminar estos ácidos, colocaremos el material en una solución de carbonato de sodio, que neutralizará todo el ácido.

Después de neutralizar los ácidos, vamos a retirar la muestra y limpiarla con agua desionizada y luego secarla con nitrógeno. Así que ahora hemos terminado con el ataque ácido. No más ácido, me quito mi bata térmica.

Vamos a sacarlo y transferirlo para visualizarlo bajo nuestro microscopio. Ahora estamos observando la muestra bajo el microscopio. Esto es después de haber realizado el grabado de ITO.

En este caso, las regiones más oscuras son zonas de vidrio de donde se eliminó el ITO. Y las regiones más claras son el ITO que están protegidas por la resistencia fotográfica en este caso. Una vez más, estas son las matrices de 500 a 50 micrones y, en el otro caso, tenemos nuestros círculos interconectados de mil micrones cada uno.

Así que acabamos de observar al microscopio y vimos que había regiones de vidrio y regiones de ITO, pero las regiones de ITO estaban protegidas por fotoresistente. Ahora necesitamos eliminar este fotoresistente. Entonces, todo lo que haremos es tomar nuestro sustrato, colocarlo en acetona y luego introducirlo en el ultrasonido, simplemente sonicando durante 10 minutos.

Esto garantiza que se elimine toda la resistencia fotolitográfica; se podría utilizar por sí sola como tonos, pero mediante sonicación, que emplea ondas sonoras para impactar, lo que asegura que la resistencia fotolitográfica se elimine correctamente. Después de sacarla del baño ultrasónico, se lava con agua desionizada, se seca nuevamente con nitrógeno y ahora se pueden ver claramente los patrones sobre el sustrato de vidrio. Estos eran los patrones que inicialmente estaban protegidos por la resistencia fotolitográfica.

Ahora que hemos examinado nuestras muestras y encontrado o creado nuestros patrones de ITO, vamos a comenzar la segunda fase del experimento. Esta fase implica la modificación de la superficie con una monocapa autoensamblada de ciclina PEG. Pero antes de hacerlo, debemos asegurarnos de que la superficie sea reactiva.

Para ello, lo colocamos en un limpiador de plasma. Esto introduce grupos hidroxilo en la superficie y, por lo tanto, la hace reactiva. Para hacerlo, simplemente colocamos nuestra muestra en el limpiador de plasma y luego encendemos nuestra bomba de vacío.

Encendemos el oxígeno, encendemos la energía principal. Esta energía se utiliza para convertir el gas oxígeno en plasma, que luego se introduce y forma así las ranuras hidroxilo. Y una vez que encendemos la energía, seguimos adelante y pulsamos inicio.

Entonces, ahora que el proceso ha finalizado, sacamos nuestro sustrato, lo guardamos en un recipiente y salimos del cuarto limpio desvistiéndonos del equipo de protección, para continuar con el siguiente paso. Ahora que estamos fuera del cuarto limpio y que hemos terminado nuestro patrón ideal, vamos a modificar la superficie que acabamos de patrones con polietilenglicol, CYLIN o PEG Cylin. Es fundamental saber que el PEG Cylin es reactivo a la humedad.

Por lo tanto, todo lo que usemos de madera debe estar libre de humedad. El material de vidrio que hemos utilizado aquí, las placas de Petri, se han secado en estufa a cien grados C durante toda la noche. Y el disolvente que vamos a utilizar también es anhidro.

No contiene humedad. Ahora voy a verter tolueno anhidro en ambos vasos de vidrio, uno de los cuales contiene nuestra muestra. Ahora debemos usar dos placas de Petri porque en una de ellas realizaremos la modificación.

Y el otro lo vamos a utilizar más adelante, cuando finalice la modificación, para lavar nuestro sustrato. Entonces, después de colocarlos en nuestros recipientes de vidrio, simplemente los llevaré y los transferiré a la cámara de esclusa de aire aquí dentro de la cabina de guantes. Después de cerrar la cámara de esclusa de aire, introduciremos nitrógeno en la cámara.

Ahora, la cámara principal ya está llena de nitrógeno. Por lo tanto, no queremos abrir esta cámara a menos que esté llena de nitrógeno. Una vez que ambas cámaras contengan nitrógeno, transferiremos todas nuestras muestras junto con una pipeta.

Vamos a tener nuestro pasador y una pinza que usaremos más adelante para transferir las muestras. Así que nos pondremos los guantes, abriremos la cámara aquí y sacaremos lentamente y con cuidado todo lo que tenemos en nuestra esclusa de aire, colocándolo en la cámara principal. Este es el plato de Petri con nuestro sustrato y el plato de Petri solo con tolueno que utilizaremos para lavar.

El pxi que está presente fue envasado bajo nitrógeno y no debe abrir esta botella a menos que se encuentre en un ambiente de nitrógeno. Por lo tanto, una vez que desee extraer la muestra, debe devolverla a la bolsa. Así que saca su cylin y la concentración que vamos a utilizar es del 2% en tolueno.

Así que se extrae, se coloca en el recipiente alto, se mezcla. También se introduce en la cámara y se asegura que se mezcle bien, y luego se deja que la muestra incube en Toin durante dos horas. Ahora que han pasado las dos horas, nuestra muestra ha estado en Pxi, vamos a sacar la muestra y transferirla a una solución fresca de toin donde la lavaremos brevemente, la moveremos circularmente y la llevaremos a nuestra cámara de esclusa de aire.

Una vez que esté en nuestra cámara de esclusa, simplemente abriremos la cámara y sacaremos nuestra superficie modificada, y podremos moverla utilizando la pistola de nitrógeno. La colocamos nuevamente en una placa de Petri limpia y seca y la llevamos a un horno a cien grados C durante otras dos horas. Ahora que las muestras han sido calentadas en el horno a cien C durante dos horas, vamos a tomar y conectar nuestros cables a los electrodos que preparamos.

Lo hacemos preparando una mezcla uno a uno de epoxi de plata y un agente de curado. Esto es el epoxi de plata, y ahora agregamos la misma cantidad de agente de curado. Queremos mezclarlo bien, y luego tomaremos esta mezcla y la usaremos para fijar nuestros cables.

Así que colocamos nuestro alambre sobre los electrodos que deseamos utilizar y luego lo conectamos. La soldadura no funciona sobre ITO, por lo tanto debemos usar epoxi de plata y el agente de curado. Luego, horneamos para que todo el agente de curado que usamos anteriormente se elimine, endurezca y podamos utilizarlo como electrodo.

Ya que ahora hemos terminado las dos fases, vamos a comenzar la tercera fase de un experimento, que consiste en realizar la parte de electroquímica. Para ello, tomaremos una muestra y la colocaremos en nuestra celda electroquímica. Después de colocarla en la celda electroquímica, simplemente colocaremos una junta tórica encima.

Eso va a aislar la región donde ocurrirá la electroquímica, y luego simplemente sellaremos la celda. He colocado mi muestra con el alambre conectado dentro de la celda electroquímica. Ahora estoy listo para usar el potenciostato y aplicar el voltaje.

Entonces, el cable blanco, lo voy a conectar aquí mismo al electrodo de referencia, el rojo, al electrodo contrarresto, y finalmente el verde, que voy a conectar a nuestro electrodo de trabajo. Una vez que todos estos electrodos estén conectados, simplemente añadiré una solución 1x de tampón salino de fosfato o PBS al sistema electroquímico. Ahora, para aclarar esto, el funcionamiento será de la siguiente manera: toda la superficie, tal como está ahora, está modificada con pxi.

Por lo tanto, todos los electrodos, incluidas las regiones de vidrio circundantes, se modifican con pxi. Una vez que aplico el voltaje en todas partes donde está presente el ITO, es decir, en los diseños de electrodos que creamos, la isla de peg se desprenderá únicamente de esas superficies, mientras que las regiones circundantes no se verán afectadas. De este modo, eliminamos selectivamente la isla de peg de nuestro sustrato.

Ahora voy a presionar reproducir, lo que iniciará y aplicará un voltaje de -1,4 voltios a nuestro electrodo de trabajo. Cuando se aplica el voltaje, se produce un cambio de color que pueden observar en los electrodos. Cambia del tono verde azulado transparente que teníamos a marrón.

Sospechamos que podría haber una reacción de oxidación que ocurra en los electrodos y que provoca que se vuelvan marrones. Esto también es uno de los indicadores de que el pxi de la superficie efectivamente fue eliminado de la superficie. Y una vez más, dondequiera que vea un color marrón, es ahí donde se ha removido la isla de peg.

Y las regiones circundantes de vidrio aún tienen PXI ensamblado sobre ellas. Por lo tanto, aplicamos un voltaje de menos 1,4 vatios durante 60 segundos. Esto proporciona tiempo suficiente para eliminar todo el PXI presente en los electrodos.

También podemos utilizar este método para desprender electrodos que están individualmente direccionados. En este caso, había tres filas de círculos que se van a desprender. Podemos seleccionar cuáles deseamos desprender utilizando los tres electrodos diferentes.

Así que ahora hemos terminado con éxito nuestra tercera parte de electroquímica, en la cual hemos eliminado selectivamente el PG silano de nuestros electrodos de ITO. Los lavé brevemente con PBS y agua DI, retiré el alambre y coloqué las muestras en placas de seis pocillos comunes. Ahora vamos a continuar y cultivar células sobre estos electrodos.

Ahora estamos en la sala de cultivo de tejidos. Para la fase final del experimento, utilizaremos hoy fibroblastos, células tres T tres. La concentración que usamos para sembrar las células está entre 0,5 y 1,5 millones de células por mililitro.

Después de sembrar las células, dejamos que se adhieran a nuestra muestra durante aproximadamente 20 minutos. Esto les proporcionará suficiente tiempo para unirse a las regiones desprovistas. Luego, colocaremos la muestra en el incubador.

Así que ahora han pasado 20 minutos y estamos listos para observar las células que se han dispuesto en las regiones despojadas de ITO, las regiones marrones que vimos anteriormente, y que solo se unirán específicamente a esas regiones sin adherirse en ninguna otra zona fuera de ellas. Aquí pueden ver las regiones marrones, que son áreas de ITO de las cuales se eliminó el pxi. Mediante el uso de electroquímica, las células se han adherido únicamente a estas regiones marrones y no a las regiones circundantes de vidrio.

En este otro marco, nuevamente, observamos que las seltz se adhieren a las regiones despojadas. Esas son las regiones marrones, pero por encima de esas regiones marrones apenas se puede ver y el diseño de ITO con PEG no fue eliminado de este diseño de ITO, por lo tanto, ninguna célula se adhirió a él. Bien, eso es todo.

Ya hemos terminado con el protocolo y las células presentan un patrón sobre los electrodos de ITO, que es exactamente lo que queríamos. Acabo de mostrarles el control de la adhesión celular sobre electrodos de óxido de indio transparentes ópticamente y microfabricados. Hoy les he mostrado cómo hacer un patrón de fibroblastos THREET tres sobre estos electrodos.

También hemos utilizado el mismo procedimiento para configurar células Hep G dos, células satélite y células primarias de rata. Las técnicas actuales de configuración celular solo permiten el ensamblaje de dos tipos celulares sobre la superficie. La flexibilidad de esta técnica permitirá en el futuro el ensamblaje de múltiples tipos celulares sobre la superficie que estén espacialmente aislados.

Planeamos utilizar esta técnica para aislar espacialmente tres tipos diferentes de células hepáticas sobre el sustrato de ITO con el fin de imitar el microentorno in vivo. Al hacer esto, podemos aislar espacialmente células inmaduras o células madre junto con células maduras y células de sostén. Esto creará un entorno instructivo para que las células inmaduras crezcan y se diferencien.