El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

Se discute la construcción y operación de un complejo sistema no lineal óptico que utiliza ultrarrápida totalmente ópticas de conmutación para aislar Raman de las señales de fluorescencia. El uso de este sistema en el que son capaces de separar con éxito las señales de Raman y de fluorescencia utilizando las energías de pulso y potencias medias que permanecen biológicamente seguros.

El objetivo de este procedimiento es construir una marcha totalmente óptica que pase la luz dispersa Raman mientras rechaza las señales fluorescentes. Esto se logra primero excitando y polarizando la dispersión Raman. El segundo paso del procedimiento es preparar la viga de la bomba para operar la compuerta.

En tercer lugar, la bomba, el ariete y los pulsos deben ajustarse para que se superpongan. El paso final del procedimiento es adquirir espectros con defunción temporal. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cuantificación y clasificación bioquímica a través del análisis de señales de ramen con altas relaciones señal/ruido.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la eliminación por software del fondo de fluorescencia, es que el ruido de disparo producido por la fluorescencia se reduce significativamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biológico y biomédico, como la caracterización no invasiva de la composición química del flúor endógeno en células y tejidos bacterianos, la comprensión de los procesos celulares y enfermedades como el cáncer, las enfermedades vasculares o neurodegenerativas mediante el uso de marcadores intrínsecos. Este método también puede ayudar con el desarrollo de nuevas sondas que podrían usarse como marcadores de fluorescencia y RAM, así como para sensores médicos no invasivos para análisis de sangre.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los sistemas biológicos para la ingeniería biomédica. También se puede aplicar a otros campos como la industria de los biocombustibles, la investigación o las telecomunicaciones. Por lo general, las muestras biológicas se colocan en un cubreobjetos de espesor número uno montado en una cámara de celda de fluoruro ATO.

Las muestras líquidas, en particular las tóxicas para los seres humanos, se colocan en una pequeña botella de vidrio con un cubreobjetos cementado a la abertura por medio de epoxi de silicona, que luego se invierte para la medición. Coloque las muestras en la etapa secundaria montada en la parte superior de la etapa del microscopio que tiene su propio control de enfoque independiente para tomar espectros de ramen con control de tiempo. En primer lugar, el haz de excitación debe estar debidamente preparado. Comience con la luz que emerge de un láser de zafiro GI pulsado sintonizable de 2,4 vatios. Cada pulso en el tren de pulsos de 80 megahercios debe tener 30 nano julios de energía, un ancho temporal de 140 femtosegundos y un espectro centrado en 808 nanómetros con un ancho de banda espectral de alrededor de seis nanómetros para evitar que las reflexiones posteriores vuelvan a entrar en la cavidad del láser, la luz debe pasar a través de un lugar aislador de Faraday, una placa de media onda antes del aislador de Faraday para permitir el ajuste continuo de la potencia total enviada al sistema.

Debido a que seis nanómetros es un ancho de banda demasiado amplio para resolver la mayoría de los modos de ramen, el haz se envía a través de un filtro de paso de banda muy estrecho. Envíalo a 808 nanómetros. A continuación, utilice un doblete aromático para enfocar la luz en un orificio de bario beta de cinco milímetros.

Ocho cristales a la mitad de la longitud de onda de 808 nanómetros a 404 nanómetros. Coloque el cristal de beta bario bate en un soporte con controles de punta e inclinación montados en una etapa de traducción. Para maximizar la eficiencia de la conversión de longitud de onda, el cristal debe colocarse con precisión simétrico alrededor del foco del doblete y con su eje de cristal alineado con la polarización del haz entrante.

Debido a que la eficiencia de la conversión de longitud de onda depende de la polarización, el control sobre la cantidad de luz enviada a la muestra se puede obtener colocando una segunda placa de media onda después del aislador de Faraday. Al girar esta placa de onda, la intensidad de la luz enviada a la muestra se puede ajustar independientemente de la intensidad enviada en el haz de la bomba. A continuación, la luz convertida en longitud de onda es recolimada por un segundo doblete aromático elegido de tal manera que el haz excitante sea lo suficientemente grande como para llenar la abertura posterior del objetivo del microscopio y dirigido a un microscopio invertido por medio de dos espejos direccionales.

El objetivo del microscopio define el eje óptico para alinear el haz de excitación con este eje. Coloque un espejo en el plano de muestra del microscopio. A continuación, los dos espejos de dirección se ajustan de forma iterativa mientras se observa el rayo láser reflejado en la parte posterior de una cámara CCD conectada al puerto de imagen del microscopio.

Suponiendo que la imagen de la cámara está centrada en el campo de visión del microscopio, el haz está en el eje. Cuando el punto focal está centrado en el chip del microscopio y la traslación del objetivo a lo largo del eje Z no cambia. El punto central de la dispersión del ramen del haz desenfocado se produce cuando la muestra se coloca en el plano de la muestra y se irradia con luz láser.

Un filtro dicroico colocado debajo del objetivo del microscopio separa la onda desplazada. El ramen dispersó la luz del haz de excitación dirigiendo la luz dispersada del ramen al puerto lateral del microscopio. El microscopio se ha modificado para eliminar cualquier lente dentro de este camino, de modo que la luz de señal emerge del microscopio recubierta porque el haz de señal que emerge del microscopio es mayor que la apertura clara de la glándula.

Los polarizadores Thompson, un telescopio de 0,47 veces construido con dos dobletes aromáticos, se utilizan para reducir el haz. A continuación, la luz de señal es polarizada por un polarizador Thompson orientado a cero grados con respecto a la vertical en el marco del laboratorio y dirigido a un espejo dicroico donde se recombina con el haz de la bomba. El haz de la bomba se envía a una línea de retardo compuesta por dos espejos en ángulo recto entre sí, ambos colocados en una etapa de traslación lineal que se puede ajustar para garantizar la superposición temporal de la bomba y los pulsos de señal.

Después de la línea de retardo, el haz se envía a través de una placa intermedia y un polarizador orientado a 45 grados con respecto a la vertical en el marco del laboratorio. Esto asegura el estado de polarización adecuado del haz de la bomba cuando alcanza el medio no lineal. A continuación, la luz se refleja en dos espejos de dirección, uno de ellos con controles piezoeléctricos, que deben utilizarse para ajustar finalmente la posición del haz de la bomba de modo que se superponga espacialmente con el haz de señal.

Para obtener esta superposición, observe la bomba y los haces de señal en dos ubicaciones, una cercana y otra lejos del espejo dicroico donde los haces se combinan utilizando el primer espejo de dirección para superponer los dos haces en el punto cercano y el espejo pizo para superponer los haces en el punto lejano, el haz de la bomba se puede hacer exactamente colineal con los haces de señal. A continuación, el cartón corrugado y el sistema de recolección deben configurarse para maximizar la señal de tiempo recopilada. Para hacer esto, la bomba y los haces de señal primero pasan a través de un filtro diic que tiene un diámetro exterior de seis a 404 nanómetros para evitar que cualquier luz de excitación residual se excite y se disperse dentro del medio no lineal.

A continuación, la bomba y los haces de señal se enfocan mediante un doblete aromático en una longitud de camino de un centímetro de cuarzo que contiene el material no lineal, se puede utilizar cualquier material no lineal, que tenga un índice no lineal adecuadamente alto y una respuesta temporal adecuadamente corta. Aquí. Para estos experimentos, utilizamos disulfuro de carbono. A continuación, la luz es recolimada por un segundo doblete con una distancia focal idéntica al primero.

Luego, los haces pasan a través de un analizador Thompson de glándulas en un soporte giratorio y luego a través de un conjunto de filtros de absorción e interferencia que, combinados, tienen un diámetro exterior de 10 a 808 nanómetros. Finalmente, la luz de señal se enfoca mediante un doblete aromático en una fibra óptica multimodo de 50 micras, donde la fibra se monta en una etapa que permite la traducción en X, Y y Z. Luego, la fibra se acopla a un espectrógrafo de imágenes comercial con cámara CCD adjunta para alinear el sistema de recolección para maximizar la señal recopilada, configure el analizador a cero grados y coloque una muestra de prueba de tolueno en el plano de la muestra, optimice la señal Raman recopilada ajustando los controles X, Y y Z del montaje de fibra para garantizar la superposición espacial y temporal adecuada de la bomba y los haces de señal. Coloque un espejo en el plano de muestra del microscopio.

A continuación, retire el filtro de 404 nanómetros del sistema. Gire el analizador a 90 grados para que el haz retrorreflejado de 404 nanómetros se envíe al espectrógrafo con la intensidad ajustada de modo que no sature la cámara. Ahora, con el haz de la bomba apagado, gire el analizador para minimizar la señal transmitida de 404 nanómetros.

A continuación, vuelva a encender el haz de la bomba y ajuste lentamente la etapa de retardo hasta que la transmisión de la luz de 404 nanómetros comience a aumentar. A continuación, gire iterativamente la etapa de retardo, el espejo piezoeléctrico y los controles X, Y y Z de la fibra para maximizar la señal porque el haz retrorreflejado de 404 nanómetros y la luz dispersa Raman pueden tomar caminos ligeramente diferentes a través del sistema. Realice los ajustes finales colocando un dispersor Raman fuerte como el tolueno en la etapa de muestra, reemplazando el filtro Raman y ajustando ligeramente la alineación cambiando la etapa de retardo, el espejo eléctrico pizo y los controles X, Y y Z de la fibra para optimizar la señal Raman.

Ahora el sistema está listo para recopilar espectros. En primer lugar, esto requiere la adquisición de varias curvas de fondo para corregir los artefactos del sistema. Primero, con el analizador configurado a cero grados, el haz de excitación encendido y el haz de la bomba apagado.

Obtenga un espectro no codificado, luego configure el analizador a 90 grados y recopile un espectro de fondo que represente la luz parásita que se filtra a través de los polarizadores. A continuación, con el analizador permaneciendo a 90 grados, apague el haz de ramen y encienda el haz de la bomba. Recoja un segundo espectro de fondo que represente la cantidad de luz de la bomba que se filtra a través de los filtros dicroicos.

Finalmente, con todos los láseres apagados, recoja un espectro oscuro de referencia que represente el nivel de corriente oscura de la cámara y la electrónica. Finalmente, encienda todos los haces y recoja un espectro cerrado. Para obtener el espectro verdadero de la luz a través de la puerta, los dos espectros de fondo y el espectro oscuro deben restarse de este espectro cerrado.

Aquí vemos un diagrama esquemático del sistema de corrugado. La trayectoria del haz de la bomba se muestra como una línea roja continua, mientras que la trayectoria del SHG se muestra como una línea azul marino sólida. El camino donde el ramen y la fluorescencia se superponen se muestra en verde.

Mientras que la ruta donde la fluorescencia se ha filtrado temporalmente se muestra en amarillo. Aquí vemos los espectros crudos de cumarina disueltos en aceite de inmersión. La curva roja muestra el espectro tomado con la compuerta abierta, con la curva negra muestra el espectro tomado con el analizador alineado para una transmisión mínima y un haz de bomba aplicado.

La curva azul muestra el espectro tomado con el analizador alineado para una transmisión mínima y sin haz de bomba aplicado, y la curva verde muestra el espectro tomado con solo el haz de bomba aplicado. Todos los espectros han sido suaves con un filtro KY gole de tercer orden de 11 puntos. Las líneas discontinuas de color magenta indican la región espectral que se muestra en el siguiente gráfico.

Aquí vemos espectros de cumarina disueltos en aceite de inmersión después de la sustracción del fondo de fluorescencia. La curva roja es el espectro con la puerta abierta, y la curva azul es el espectro cerrado. El espectro cerrado muestra claramente el enrevesado número de onda alto, característica máxima de los aceites.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el láser primero debe tener suficiente energía de pulso para impulsar el ga, y que el sistema requiere una exquisita superposición espacial y temporal de los dos pulsos. Después de ver este video y leer el protocolo adjunto, debe tener una buena comprensión de cómo separar el rayo láser en un haz de excitación y curva. Cómo superponer esas dos vigas, tanto espacial como temporalmente.

Cómo registrar una señal de ramen a través de un espectrógrafo y C, C, D, y también cómo visualizar y analizar la señal de ramen. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas láser al intentar este procedimiento. Se aplican reglas de seguridad adicionales para el uso del material no lineal y para el uso de su muestra específica.