El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

El objetivo de este procedimiento es construir una compuerta completamente óptica que permita el paso de la luz dispersada por Raman mientras rechaza las señales fluorescentes. Esto se logra primero excitando y polarizando la dispersión Raman. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el haz de bombeo para operar la compuerta.

En tercer lugar, es necesario ajustar la bomba, el rayo y los pulsos para que coincidan. El paso final del procedimiento consiste en adquirir espectros con compuerta temporal. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la cuantificación y clasificación bioquímicas mediante el análisis de las señales de Raman con altas relaciones señal-ruido.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la eliminación por software del fondo de fluorescencia, es que el ruido de disparo producido por la fluorescencia se reduce significativamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biológico y biomédico, como la caracterización no invasiva de la composición química de fluoróforos endógenos en células bacterianas y tejidos, la comprensión de procesos celulares y enfermedades como el cáncer, enfermedades vasculares o neurodegenerativas mediante el uso de marcadores intrínsecos. Este método también podría contribuir al desarrollo de nuevas sondas que podrían utilizarse tanto como etiquetas de fluorescencia como de RAM, así como sensores médicos no invasivos para el análisis de sangre.

Aunque este método puede proporcionar información sobre sistemas biológicos para la ingeniería biomédica, también puede aplicarse a otros campos, como el biofuel, la investigación o la industria de telecomunicaciones. Las muestras biológicas suelen colocarse sobre un cubreobjetos de espesor número uno montado en una cámara de células ATO Fluor.

Las muestras líquidas, particularmente aquellas tóxicas para los seres humanos, se colocan en un pequeño frasco de vidrio con una lámina cubreobjetos cementada a la abertura mediante epoxi de silicona, que luego se invierte para la medición. Coloque las muestras en la platina secundaria montada encima de la platina del microscopio, la cual tiene su propio control de enfoque independiente. Para obtener espectros Raman con compuerta temporal, primero debe prepararse adecuadamente el haz de excitación. Comience con la luz que emerge de un láser de zafiro pulsado y sintonizable de 2,4 vatios. Cada pulso en el tren de pulsos de 80 megahercios debe tener 30 nanojulios de energía, una anchura temporal de 140 femtosegundos y un espectro centrado a 808 nanómetros con un ancho espectral de aproximadamente seis nanómetros. Para evitar que los reflejos regresen al interior de la cavidad láser, la luz debe pasar a través de un aislador de Faraday. Coloque una placa de media onda antes del aislador de Faraday para permitir el ajuste continuo de la potencia total enviada al sistema.

Dado que seis nanómetros es un ancho de banda demasiado amplio para resolver la mayoría de los modos Raman, el haz se envía a través de un filtro de paso de banda muy estrecho. Envíelo a 808 nanómetros. A continuación, utilice un doblete aromático para enfocar la luz sobre un borato de bario beta de cinco milímetros.

Ocho cristales a la mitad de la longitud de onda, desde 808 nanómetros hasta 404 nanómetros. Coloque el cristal de beta barioborato (BBO) en un soporte con controles de inclinación y cabeceo montado sobre una etapa de traslación. Para maximizar la eficiencia de la conversión de longitud de onda, el cristal debe colocarse simétricamente con precisión respecto al foco del doblete y con su eje cristalino alineado a la polarización del haz entrante.

Dado que la eficiencia de la conversión de longitud de onda depende de la polarización, se puede controlar la cantidad de luz enviada a la muestra colocando una segunda placa de media onda después del aislador Faraday. Al girar esta placa, la intensidad de la luz enviada a la muestra puede ajustarse independientemente de la intensidad enviada en el haz de bombeo. Luego, la luz convertida en longitud de onda se recolima mediante un segundo doblete aromático elegido de modo que el haz de excitación sea lo suficientemente amplio como para llenar la abertura trasera del objetivo del microscopio, y se dirige hacia un microscopio invertido mediante dos espejos de orientación.

El objetivo del microscopio define el eje óptico para alinear el haz de excitación con este eje. Coloque un espejo en el plano de la muestra del microscopio. Luego, se ajustan iterativamente los dos espejos de orientación mientras se observa el haz láser reflejado hacia atrás en una cámara CCD conectada al puerto de imagen del microscopio.

Suponiendo que la imagen en la cámara está centrada en el campo de visión del microscopio, el haz está en el eje. Cuando el punto focal está centrado en el chip del microscopio y la traslación del objetivo a lo largo del eje Z no cambia. El punto central del haz desenfocado de dispersión Raman ocurre cuando la muestra se coloca en el plano de la muestra y se irradia con luz láser.

Un filtro dicróico colocado debajo del objetivo del microscopio separa la luz dispersada Raman, desplazada en longitud de onda, del haz de excitación, dirigiendo la luz dispersada Raman hacia el puerto lateral del microscopio. El microscopio ha sido modificado para eliminar cualquier lente dentro de este recorrido, de modo que la luz de la señal emerge del microscopio recubierta porque el haz de señal que emerge del microscopio es más grande que la abertura clara de la lente.

Se utilizan polarizadores Thompson y un telescopio de 0,47 aumentos construido con dos dobletes aromáticos para reducir el haz. Luego, la luz de señal se polariza mediante un polarizador Thompson orientado a cero grados con respecto a la vertical en el sistema de laboratorio y se dirige a un espejo dicróico donde se vuelve a combinar con el haz de bombeo. El haz de bombeo se envía a una línea de retardo compuesta por dos espejos colocados en ángulo recto entre sí, ambos situados sobre una plataforma de traslación lineal que puede ajustarse para garantizar el solapamiento temporal de los pulsos de bombeo y de señal.

Después de la línea de retardo, el haz se dirige a través de una placa a medio camino y un polarizador orientado a 45 grados con respecto a la vertical en el marco del laboratorio. Esto garantiza el estado de polarización adecuado del haz de bombeo cuando llega al medio no lineal. Luego, la luz se refleja en dos espejos de orientación, uno con controles piezoeléctricos, que debe utilizarse para ajustar finalmente la posición del haz de bombeo de manera que coincida espacialmente con el haz señal.

Para obtener este solapamiento, observe los haces de bombeo y señal en dos ubicaciones, una cercana y otra lejana al espejo dicróico donde se combinan los haces, utilizando el primer espejo de alineación para solapar los dos haces en el punto cercano y el espejo piezoeléctrico para solapar los haces en el punto lejano, de modo que el haz de bombeo pueda hacerse exactamente colineal con los haces de señal. A continuación, debe configurarse el sistema de corrugación y recolección para maximizar la señal recolectada con compuerta temporal. Para ello, primero se hacen pasar los haces de bombeo y señal a través de un filtro dicroico que tiene una DO de seis a 404 nanómetros, con el fin de evitar que cualquier luz de excitación residual excite y se disperse dentro del medio no lineal.

Los haces de bombeo y señal luego se enfocan mediante un doblete aromático en una celda de cuarzo de un centímetro de longitud de trayectoria que contiene el material no lineal; cualquier material no lineal, con un índice no lineal adecuadamente alto y una respuesta temporal adecuadamente corta, puede utilizarse aquí. Para estos experimentos, utilizamos disulfuro de carbono. Luego, la luz se recolima mediante un segundo doblete con una distancia focal idéntica a la del primero.

A continuación, los haces pasan a través de un analizador gland Thompson montado sobre una base giratoria y luego a través de un conjunto de filtros de absorción e interferencia que combinados tienen una DO de 10 a 808 nanómetros. Finalmente, la luz de señal se enfoca mediante un doblete aromático hacia una fibra óptica multimodo de 50 micrones, donde la fibra está montada en una plataforma que permite traslación en X, Y y Z. Luego, la fibra se acopla a un espectrógrafo de imágenes comercial con una cámara CCD adjunta para alinear el sistema de recolección y maximizar la señal recogida, ajustar el analizador a cero grados y colocar una muestra de prueba de tolueno en el plano de la muestra, optimizando la señal Raman recogida mediante el ajuste de los controles X, Y y Z del soporte de la fibra para asegurar un solapamiento espacial y temporal adecuado entre los haces de bombeo y señal. Coloque un espejo en el plano de muestra del microscopio.

Luego retire el filtro de 404 nanómetros del sistema. Gire el analizador a 90 grados para que el haz retroreflejado de 404 nanómetros se dirija al espectrógrafo, ajustando la intensidad de modo que no sature la cámara. Ahora, con el haz de bombeo apagado, gire el analizador para minimizar la señal transmitida de 404 nanómetros.

Luego, reactive la haz de bombeo y ajuste lentamente la etapa de retardo hasta que la transmisión de la luz de 404 nanómetros comience a aumentar. A continuación, ajuste de forma iterativa la etapa de retardo, el espejo piezoeléctrico y los controles X, Y y Z de la fibra para maximizar la señal, ya que el haz de 404 nanómetros retroreflejado y la luz dispersada Raman pueden seguir trayectorias ligeramente diferentes a través del sistema. Realice ajustes finales colocando un dispersor Raman fuerte, como el tolueno, en la platina de la muestra, reemplazando el filtro Raman y ajustando ligeramente la alineación mediante cambios en la etapa de retardo, el espejo piezoeléctrico y los controles X, Y y Z de la fibra para optimizar la señal Raman.

Ahora el sistema está listo para recopilar espectros. Esto requiere primero la adquisición de varias curvas de fondo para corregir los artefactos del sistema. Primero, con el analizador ajustado a cero grados, el haz de excitación encendido y el haz de bombeo apagado.

Obtenga un espectro sin polarizador, luego configure el analizador a 90 grados y registre un espectro de fondo que represente la luz dispersa que atraviesa los polarizadores. A continuación, manteniendo el analizador a 90 grados, apague el haz Raman y encienda el haz de bombeo. Registre un segundo espectro de fondo que represente la cantidad de luz de bombeo que atraviesa los filtros dicróicos.

Finalmente, con todos los láseres apagados, recolecte un espectro oscuro de referencia que represente el nivel de corriente oscura de la cámara y la electrónica. Luego encienda todos los haces y recolecte un espectro compuertado. Para obtener el espectro verdadero únicamente de la luz que atraviesa la compuerta, es necesario restar de este espectro compuertado los dos espectros de fondo y el espectro oscuro.

Aquí vemos un diagrama esquemático del sistema corrugador. La trayectoria del haz de bombeo se muestra como una línea roja continua, mientras que la trayectoria del SHG se muestra como una línea azul marino continua. La trayectoria donde se superponen el ramán y la fluorescencia se muestra en verde.

Mientras tanto, la trayectoria donde la fluorescencia ha sido temporalmente filtrada se muestra en amarillo. Aquí observamos los espectros brutos de coumarina disuelta en aceite de inmersión. La curva roja muestra el espectro obtenido con la compuerta abierta, mientras que la curva negra muestra el espectro obtenido con el analizador alineado para la transmisión mínima y con un haz de bombeo aplicado.

La curva azul muestra el espectro tomado con el analizador alineado para la transmisión mínima y sin aplicar el haz de bombeo, y la curva verde muestra el espectro tomado con solo el haz de bombeo aplicado. Todos los espectros han sido suavizados con un filtro KY gole de tercer orden de 11 puntos. Las líneas magenta discontinuas indican la región espectral mostrada en el siguiente gráfico.

Aquí observamos los espectros de cumarina disuelta en aceite de inmersión tras la sustracción del fondo de fluorescencia. La curva roja corresponde al espectro con la compuerta abierta, y la curva azul corresponde al espectro compuertado. El espectro compuertado muestra claramente el pico característico de número de onda alto y superpuesto, típico de los aceites.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el láser debe tener inicialmente suficiente energía de pulso para excitar el ga, y que el sistema requiere un solapamiento espacial y temporal exquisito de los dos pulsos. Después de ver este video y leer el protocolo adjunto, debería tener una buena comprensión de cómo separar el haz láser en un haz de excitación y un haz de sonda. Cómo solapar esos dos haces, tanto espacial como temporalmente.

Cómo registrar una señal de ramen mediante espectrógrafo y C, c, D, y también cómo visualizar y analizar la señal de ramen. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas protectoras para láser al intentar este procedimiento. Se aplican reglas adicionales de seguridad para el uso del material no lineal y para el uso de su muestra específica.