Name: Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de lhippocampe sur des durées longues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Découvrez l'imagerie du transport mitochondrial dans les neurones de l'hippocampe sur de longues durées. Cette méthode utilise la microscopie à fluorescence et un incubateur de scène pour étudier l'effet des neuromodulateurs.

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Nous tenons à remercier Donald Hutson pour contribuer son expertise technique et une grande habileté lors de la conception et la fabrication de l&#39;incubateur en scène haut. Nous sommes également reconnaissants à Ayda Dashtaei pour son excellente assistance technique. Tout le travail a été soutenu par Neurosciences Research Foundation.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Employant lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente ciblé à la mitochondrie dans les neurones infectés cultivé et un peu coûteux en laboratoire construit étape-top incubateur qui permet l&#39;imagerie de cellules vivantes pour des durées prolongées, nous avons été en mesure d&#39;étudier le lien entre le mouvement des mitochondries et des signaux neuromodulateurs , tels que la sérotonine (5-HT), la dopamine (DA), et l&#39;acétylcholine (ACh). Nos études ont permis d&#39;élucider une voie de signalisation qui, pour la première fois, le trafic mitochondrial liens à des changements dans l&#39;activité des neurones modulée par des neurotransmetteurs tels que la 5-HT et DA - qui sont au cœur de la fonction neuronale. Nous constatons que l&#39;utilisation de protéines fluorescentes ciblées permet l&#39;observation des mitochondries étiquetés dans la vie des neurones cultivés sur de longues périodes qui peuvent être plus physiologiquement pertinents que les durées beaucoup plus courtes qui sont possibles en utilisant des colorants vitaux. Par ailleurs, l&#39;intensité du signal fluorescent protein nous permet de garder le temps d&#39;exposition courts lors de l&#39;acquisition, en minimisant la possibilité de photoblanchiment ou de phototoxicité. Enfin, une étape-top simple et peu coûteux incubateur qui maintient la température ambiante, l&#39;humidité et de CO 2 niveaux, tout en minimisant l&#39;évaporation de médias, nous permet de suivre le mouvement des mitochondries dans la vie des neurones pendant des heures voire des jours. Les chercheurs qui souhaitent fabriquer un incubateur étape-top pour les observations à long terme des mitochondries dans des neurones vivants ne doivent pas suivre les détails précis de notre conception, à condition que les propriétés des matériaux utilisés (par exemple, le gaz membrane perméable pour éviter l&#39;évaporation des médias ) et les principes appliqués (par exemple, contrôle de la température et l&#39;humidité, du pH tampon, le maintien de l&#39;osmolarité) sont généralement compatibles avec ce qui est décrit dans ce protocole.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantité </th><th> Description (et l&#39;emplacement dans la Figure 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Incubateur de culture tissulaire (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Résistant à la chaleur boîtier en plastique (delrin ou comparables) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Cadre en plastique pour le 35mm GBM couvercle (pour l&#39;apposition membrane pour boîte de Petri) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> linéaires pi matériels Effacer PTFE membrane (téflon) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Vis à oreilles en laiton </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Petites résistances radiateur 10kOhm (utilisés comme éléments de chauffage à l&#39;intérieur en scène haut de l&#39;enceinte incubateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformateur (fourniture de courant 9V à résistances) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Régulateur de température et sonde terrarium (régulation thermostatique de la puissance aux résistances du radiateur via transformateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyer (silencieux pour la suppression des vibrations dans les tuyaux avant l&#39;étape-dessus incubateur) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 feuilles sorbothane &quot;(matériau de joint pour la base de l&#39;étape-dessus incubateur) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hermétique ABS (ou comparable) boîte en plastique (boîtier de la pompe d&#39;aquarium) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Pompe d&#39;aquarium (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Petit ventilateur d&#39;ordinateur </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Boîtier en plastique pour ventilateur de refroidissement (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformateur pour ventilateur d&#39;ordinateur </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Tuyau Nalgene ou de silicone (liens entre la culture de tissus et le stade-top incubateurs; pièges à humidité) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Robinets en plastique (pour ouvrir et fermer le débit d&#39;air avant et après l&#39;étape-dessus incubateur) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Raccords de tuyaux en laiton barbelé (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur et enceinte de la pompe d&#39;aquarium) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Coupleurs rapides en laiton (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Coupleurs rapides en laiton (pour les raccords de tuyau de / vers l&#39;étape-top incubateur) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Stage-dessus des pièces incubateur: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminine </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm à fond de verre plats </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Riche en lipides BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-asparagine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> La vitamine B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25MG </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25MG </td></tr><tr><td> Dopamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25MG </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulation et mitochondriale de transport: live in imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Pour comprendre la relation entre le transport mitochondrial et la fonction neuronale, il est essentiel d&#39;observer le comportement des mitochondries en direct neurones cultivés pour des durées étendu 1-3. C&#39;est maintenant possible grâce à l&#39;utilisation de colorants vitaux et des protéines fluorescentes avec laquelle les composants du cytosquelette, les organites, et d&#39;autres structures dans les cellules vivantes peuvent être étiquetées et ensuite visualisé par microscopie à fluorescence dynamique. Par exemple, dans les neurones embryonnaires de poulet sympathique, le mouvement mitochondrial a été caractérisée en utilisant la rhodamine colorant vital 123 4. Dans une autre étude, les mitochondries ont été visualisées dans les neurones du cerveau antérieur chez le rat par transfection de mitochondrially ciblées EYFP 5. Cependant, l&#39;imagerie des neurones primaires en quelques minutes, heures, jours ou même présente un certain nombre de questions. Ce sont notamment les suivants: 1) le maintien de conditions de culture telles que la température, l&#39;humidité et du pH au cours des séances d&#39;imagerie longue; 2) un signal fort et stable, fluorescentes pour assurer la qualité des images acquises et la mesure précise de l&#39;intensité du signal pendant l&#39;analyse d&#39;image; et 3) la limitation des temps d&#39;exposition lors de l&#39;acquisition d&#39;images pour minimiser photoblanchiment et d&#39;éviter la phototoxicité. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l&#39;observation, la visualisation et l&#39;analyse du mouvement des mitochondries dans des cultures de neurones de l&#39;hippocampe avec une résolution temporelle élevée et dans des conditions optimales de survie. Nous avons construit un prix abordable étape-top incubateur qui permet une régulation de température et de débit de gaz bonne atmosphère, et limite également le degré d&#39;évaporation des médias, en assurant un pH stable et l&#39;osmolarité. Cet incubateur est connecté, via l&#39;entrée et la sortie de tuyaux, d&#39;une norme incubateur de culture tissulaire, qui fournit des niveaux d&#39;humidité constante et une atmosphère de 5-10% de CO 2 / air. Cette conception offre une alternative rentable aux incubateurs microscope sensiblement plus cher que ne garantit pas nécessairement la viabilité des cellules pendant plusieurs heures voire plusieurs jours. Pour visualiser la mitochondrie, nous infecter les cellules avec un lentivirus codant pour une protéine fluorescente rouge qui est ciblé vers la mitochondrie. Ceci assure un signal fort et persistant, qui, en conjonction avec l&#39;utilisation d&#39;une source de lumière au xénon stable, nous permet de limiter les temps d&#39;exposition lors de l&#39;acquisition d&#39;images et de tous, mais exclut photoblanchiment et de phototoxicité. Deux ports d&#39;injection sur le dessus de l&#39;incubateur en scène haut permettent l&#39;administration aiguë de neurotransmetteurs et autres réactifs destinés à moduler le mouvement des mitochondries. En somme, lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;un organite ciblées protéine fluorescente rouge et la combinaison de notre stade-dessus incubateur, une conventionnelles microscope inversé à fluorescence, caméra CCD, et la source lumineuse au xénon nous permettent d&#39;acquérir des images en accéléré du transport mitochondrial neurones vivants sur de longues durées que celles possibles dans les études conventionnelles de déployer des colorants vitaux et off-the-shelf systèmes de survie.

Nous décrivons un protocole qui permet l&#39;imagerie de la mitochondrie dans la vie des neurones par l&#39;intermédiaire de microscopie par fluorescence sur des durées longues. Imagerie sur de longues périodes est accompli par des lentivirus médiée par l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente mitochondrially ciblées et l&#39;utilisation d&#39;un moyen peu coûteux étape-top incubateur qui a été conçu et construit dans notre laboratoire.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

Pour comprendre la relation entre le transport mitochondrial et la fonction neuronale, il est essentiel d'observer le comportement des mitochondries dans des cultures vivantes de...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser le transport mitochondrial dans des neurones en culture pendant de longues durées à l'aide de la microscopie à fluorescence en temps réel. Cela est réalisé en marquant d'abord les mitochondries dans des neurones en culture à l'aide d'une protéine fluorescente ciblant un organite. La deuxième étape de la procédure consiste à acquérir des images du transport mitochondrial dans des conditions de contrôle.La troisième étape de la procédure consiste à acquérir des séries d'images en laps de temps du transport mitochondrial après l'administration aiguë de neuromodulateurs tels que la sérotonine. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les séries d'images en laps de temps acquises. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les neurotransmetteurs modulent le transport mitochondrial.De tels résultats ne sont obtenus que par l'imagerie de mitochondries marquées par fluorescence dans des neurones sur des durées prolongées. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que le marquage avec des colorants vitaux ou la transfection transitoire de GFP, est qu'elle rend possible l'observation à long terme du transport mitochondrial dans des neurones en culture sains. Cette procédure sera démontrée par Chen, chercheur associé de mon laboratoire, afin de fournir un environnement stably chauffé et humidifié.L'incubateur à plateau est relié à un incubateur standard pour culture de tissus par un circuit fermé, avec un couvercle à membrane A-P-F-T-E pour boîtes de culture de 35 millimètres à fond en verre, permettant les échanges gazeux entre la culture neuronale et l'environnement à l'intérieur de l'incubateur. L'ensemble de ces caractéristiques et d'autres permettent l'observation à long terme de neurones en culture dans diverses conditions expérimentales. Transférez la boîte de culture contenant les neurones hippocampiques en culture exprimant la protéine mito turbo red vers une hotte de culture de tissus.Remplacez le couvercle en plastique par le couvercle en membrane de PFTE et déplacez la boîte de culture vers le microscope. Fixez la base de l'incubateur sur la platine du microscope, puis placez délicatement la boîte de culture couverte de membrane. Dans l'ouverture en creux, alignez l'enceinte de l'incubateur avec les piliers en acier situés sur la base de l'incubateur et abaissez l'enceinte sur la base.Serrer les vis moletées jusqu'à ce qu'un bon joint soit obtenu entre l'enceinte et la base. Allumer le contrôleur de la roue à filtres du microscope, la source lumineuse et la caméra CCD avant d'ouvrir le logiciel d'acquisition d'images. Dans ce protocole, le diaporama numéro cinq est utilisé pour l'acquisition d'images.Passer à un objectif à immersion huile de 63 x et abaisser la tourelle d'objectifs. Appliquer soigneusement de l'huile à immersion sur la surface de l'objectif. Cliquer sur l'icône de fenêtre de mise au point dans la barre d'outils et allumer la lampe de champ clair en déplaçant le curseur de la lampe.Pour régler l'intensité lumineuse, obtenez le focus sur un champ de cellules à l'aide des oculaires et repérez une cellule d'intérêt. Sélectionnez le filtre XI trois sous l'onglet du microscope à l'aide des oculaires, trouvez le plan de focalisation des mitochondries dans les cellules marquées avec la protéine mito turbo red, puis passez à la caméra CCD. Cliquez sur l'icône de capture d'image dans la barre d'outils, en commençant par un temps d'exposition initial de 100 millisecondes.Trouvez l'exposition optimale en utilisant les boutons de test et de recherche du meilleur dans la fenêtre de capture. Sous la zone type de capture, cochez l'option d'acquisition temporelle et sélectionnez l'intervalle d'imagerie souhaité ainsi que la durée de la session d'imagerie dans les options d'acquisition temporelle.Lancez l'acquisition d'images en mode laps de temps en cliquant sur le bouton de démarrage situé en bas à droite de la fenêtre de capture. Après avoir effectué une session d'imagerie de contrôle, ajoutez des neurotransmetteurs ou d'autres réactifs par les orifices d'injection situés en haut de l'incubateur de platine. Après l'ajout de l'agoniste du récepteur de la sérotonine 8-OH-DPAT, les mitochondries auparavant immobiles, indiquées par la flèche, se déplacent le long de l'axone du neurone hippocampique.La vitesse moyenne et la directionnalité des mitochondries individuelles sont résumées avant l'ajout de sérotonine. La majorité des mitochondries sont immobiles ; toutefois, après l'ajout de sérotonine, 42 % des mitochondries présentent désormais un mouvement directionnel et parcourent des distances plus grandes que celles observées en l'absence de sérotonine. Inversement, après l'ajout de dopamine, 92 % des mitochondries sont immobiles durant les dernières 15 minutes d'une séance d'imagerie suivant cette procédure.D'autres méthodes permettant de surveiller plus d'un signal peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, la manière dont l'activité calcique et le transport mitochondrial dans les neurones sont liés.

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