Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre
10 de febrero de 2011
Un protocolo rápido para la identificación directa de Enterococcus faecalis y otras especies de Enterococcus en un hemocultivo positivo con un ácido péptido nucleico ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH ANP).
El objetivo general de este procedimiento es identificar rápidamente especies de enterococos a partir de frascos de cultivo de sangre positivos mediante hibridación fluorescente de ácidos nucleicos péptidos y C dos. Una vez que los cultivos de sangre han sido preparados y sometidos a tinción de Gram para confirmar la presencia de enterococos en el cultivo, las muestras se fijan sobre portaobjetos de microscopio para PNA FISH. Luego, los portaobjetos se incuban con sondas de PNA específicas para los organismos de interés.
Una vez que las sondas se han hibridado, se realiza un lavado estricto para eliminar el exceso de sonda no hibridada. Se añade medio de montaje a los portaobjetos, que luego se sellan con cubreobjetos. Las especies de enterococo presentes en la muestra pueden identificarse mediante microscopía de fluorescencia.
Este protocolo de identificación de PNA Fish es único al proporcionar un método rápido y específico para la identificación de enterococos procedentes de la paresia. Incubar dos frascos de hemocultivo, uno aeróbico y otro anaeróbico, que contengan sangre venosa de un paciente sospechoso de sepsis, en un instrumento automatizado de hemocultivo a 35 grados Celsius. Una vez que el dispositivo indique que ha detectado crecimiento microbiano, retire el frasco y agite suavemente los frascos de hemocultivo para resuspender de manera uniforme las bacterias.
Luego, utilizando una jeringa estéril y una aguja, transfiera asépticamente aproximadamente cinco mililitros de sangre de cada frasco a un tubo diferente con tapa roscada. Una vez que se hayan distribuido todas las muestras, use una pipeta estéril para transferir una gota de sangre de cada tubo a un portaobjetos de vidrio para microscopio diferente. Deje secar al aire el portaobjetos durante aproximadamente 15 minutos.
Luego, después de que la laminilla esté completamente seca, sumérjala en metanol para fijar la muestra. Una vez que las laminillas hayan sido fijadas, lávelas y realice una tinción de Gram estándar para determinar la morfología de los organismos presentes en cada cultivo de sangre. Examine las laminillas teñidas utilizando un microscopio con objetivo de inmersión en aceite.
Introduzca una especie de cauca aparecerá como cocos grampositivos típicamente dispuestos en pares o cadenas cortas. Coloque una gota de solución fijadora en el pocillo de un portaobjetos para microscopio de pescado. Mezcle suavemente el tubo de hemocultivo que se va a analizar.
Luego, transfiera 10 microlitros de cultivo sobre la gota de solución fijadora y aspire y expulse varias veces para emulsionar la muestra. Coloque los portaobjetos en una placa calefactora a 55 grados Celsius durante 20 minutos para fijar los frotis en cada prueba. Asegúrese de incluir portaobjetos de control positivo y negativo para la evaluación de la calidad del ensayo.
Las laminillas de control callosas se pueden adquirir de un Van DX o preparar utilizando cultivos de referencia. Una vez que la extensión esté lista, coloque una gota de EFI calloso O-E-P-N-A en el pocillo que contiene la muestra de cultivo de sangre, y también en los pocillos de control positivo y negativo. Para evitar la contaminación de la solución stock de la sonda, asegúrese de no permitir que la punta del frasco gotero toque la extensión de sangre.
Coloque un cubreobjetos encima de la muestra, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire. Luego incube el portaobjetos en un bloque calefactor a 55 grados Celsius durante 30 minutos. Para permitir la hibridación del PNA tras la incubación, coloque los portaobjetos en un portaportas.
Sumerja el portaporta cargado en un recipiente de tinción que contenga Solución de Lavado precalentada a 55 grados Celsius. Para eliminar el exceso de PNA de la muestra, retire suavemente el cubreobjetos agitando el portaobjetos en el tampón o utilizando pinzas. Incube el portaobjetos a 55 grados Celsius en la solución de lavado durante 30 minutos.
Luego retire el portaobjetos del recipiente de tinción y déjelo secar al aire. Una vez que el portaobjetos esté seco, agregue una gota de medio de montaje a temperatura ambiente sobre el portaobjetos y coloque cuidadosamente una laminilla sobre la muestra. Examine los portaobjetos en un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de doble banda dentro de las dos horas posteriores a su preparación.
Mediante este método, iffy, coriáceo, mostrado en verde a la izquierda, puede distinguirse de eum en rojo. En el panel central de la extrema derecha se observa un resultado negativo. Tres aspectos a recordar para obtener resultados exitosos son que las temperaturas del instrumento deben mantenerse en las temperaturas establecidas.
Debe seguir el procedimiento de tinción muy cuidadosamente según se indica en el inserto del envase. Y finalmente, necesita un lector experimentado que realice una lectura exhaustiva de la preparación. Este protocolo es útil para tomar decisiones terapéuticas en el tratamiento de la sepsis causada por enterococo.
Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo rápido para identificar Enterococcus faecalis y otras especies de Enterococcus a partir de cultivos de sangre positivos mediante un ensayo de hibridación fluorescente in situ con ácidos nucleicos peptídicos (PNA FISH). El método permite una identificación rápida y específica, lo que ayuda en el tratamiento de la sepsis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Diagnóstico clínico
- Enfermedades infecciosas
Antecedentes
- Las especies de Enterococcus son patógenos importantes en las infecciones del torrente sanguíneo.
- La identificación rápida a partir de cultivos de sangre es crucial para un tratamiento eficaz.
- La hibridación in situ con sondas de ácido peptidonucleico (PNA FISH) ofrece un método específico para identificar estos organismos.
- El protocolo está diseñado para ser eficiente y confiable.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de identificación rápida para especies de Enterococcus.
- Mejorar la velocidad del diagnóstico en entornos clínicos.
- Ayudar en la toma oportuna de decisiones terapéuticas para el tratamiento de la sepsis.
Métodos Utilizados
- Preparación de cultivos de sangre y tinción de Gram para confirmar la presencia de Enterococcus.
- Uso de sondas PNA específicas para especies de Enterococcus.
- Microscopía de fluorescencia para la visualización de muestras hibridadas.
- Inclusión de portaobjetos de control para la evaluación de calidad.
Resultados principales
- Identificación exitosa de especies de Enterococcus mediante FISH con PNA.
- La microscopía de fluorescencia distingue eficazmente entre especies.
- Los resultados rápidos facilitan la toma oportuna de decisiones clínicas.
- El protocolo demuestra alta especificidad y fiabilidad.
Conclusiones
- El protocolo de FISH con PNA es una herramienta valiosa para el diagnóstico microbiológico.
- Mejora la rapidez en la identificación de patógenos en cultivos de sangre.
- Este método puede tener un impacto significativo en el manejo de la sepsis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación rápida a nivel de especie de Enterococcus a partir de cultivos de sangre apoya la gestión oportuna de antimicrobianos y la vigilancia de resistencias en el manejo de la sepsis. Diferenciar E. faecalis de E. faecium orienta las decisiones terapéuticas tempranas dadas sus distintas perfiles de resistencia. Este ensayo PNA FISH de 1,5 horas permite reducir los riesgos asociados a las opciones empíricas de terapia en programas de enfermedades infecciosas en fase de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite probar hipótesis sobre mecanismos de virulencia específicos de cada especie en modelos de bacteriemia.
- Valor operativo: Proporciona una identificación microbiana estandarizada para estudios preclínicos de sepsis reproducibles.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en el blanco al vincular la identificación de especies con perfiles diferenciales de respuesta a fármacos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera resultados cuantificados de fluorescencia para la validación de hits en cascadas de cribado antimicrobiano.
- Reproducibilidad: Incluye controles positivos/negativos integrados que garantizan la robustez del ensayo entre diferentes operadores.
- Escalabilidad: Compatible con el procesamiento de portaobjetos de alto rendimiento para el perfilado de bibliotecas de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la fisiopatología de la bacteriemia al permitir la caracterización de modelos de sepsis estratificados por especies.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación del blanco in vitro con estudios de eficacia in vivo utilizando cepas microbianas clínicamente relevantes.
- Mitigación de riesgos: Reduce la atribución errónea de efectos terapéuticos a blancos microbianos incorrectos en modelos de sepsis.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Sitúa la identificación microbiana como un controlador crítico entre la validación del blanco y la optimización del fármaco inicial en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos.
- Biología del Descubrimiento: Confirma la actividad sobre el blanco al verificar las especies causales en modelos de infección antes de la elucidación del mecanismo.
- Tamizaje: Permite la determinación específica de la CMI por especie para una evaluación precisa de la potencia del compuesto.
- Análisis: Proporciona resultados binarios por especie que clasifican los compuestos activos según su espectro de actividad.
- Investigación Traducional: Asegura que los modelos preclínicos reflejen la diversidad de aislamientos clínicos para una validez predictiva.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otros patógenos Gram-positivos mediante el rediseño de sondas para su aplicación en toda la plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la interpretación de modelos de sepsis mediante la identificación precisa del patógeno.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo microbiológicos entre equipos de descubrimiento y preclínicos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o no avance al eliminar la identificación errónea de especies como factor de confusión en los datos de eficacia.
- Impacto en la cartera: Permite el avance con estratificación de riesgos de candidatos de espectro estrecho frente a candidatos de espectro amplio, basado en la epidemiología de resistencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microscopía de fluorescencia e hibridación de ácidos nucleicos.
- Depende de equipos de ciclado térmico que mantengan 55°C durante los pasos de fijación, hibridación y lavado.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de portaobjetos para garantizar una fijación de la muestra y accesibilidad de la sonda consistentes.
- Requiere validación en diversas cepas de Enterococcus para confirmar la especificidad de la sonda en paneles globales de aislamientos.
- Limitado a especies detectables con sondas PNA disponibles; las especies novedosas o raras pueden requerir métodos complementarios.
