Name: Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende el ensayo de homing competitivo para estudiar la migración de células T intestinales en ratones. Este método permite comparar subpoblaciones celulares simultáneamente y analizar su comportamiento migratorio in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EJV es apoyado por una beca de la enfermedad de Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM es apoyado por becas de CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) y Premio a la Innovación Nuevo director del NIH, s.

1. Ex generación in vivo de células T del intestino-homing y control (ver Figura 1) <ol><li> Aislar esplenocitos por maceración un bazo de ratones de tipo salvaje. Resuspender la suspensión de las células en PBS y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Eliminar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por la resuspensión del sedimento de células en 4 ml de solución amortiguadora de lisis ACK durante 2-3 minutos. Después de eso, añadir 5 ml de PBS. Centrifugar durante 5 'a 400 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender esplenocitos totales de 1 x 10 6 / ml en IMDM + 10% de SFB + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estreptomicina (IMDM completo). Separar las células en dos grupos, uno de los cuales se complementa con AR (RAR o sintético-agonistas, como Am80 o Am580) a una concentración final de 100-200 Nm 3. Las células T activadas en la presencia de RA o RAR-agonistas se upregulate a4b7and CCR9 y se convertirá en trópico intestinal de células T, mientras que las células T activadas sin la AR se convierten en células T de control. </li><li> Agregar 1,5-2,0 ml de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 24 pocillos previamente recubiertas con anti-CD3 (10 mg / ml) y anti-CD28 (10 mg / ml) y se incuba a 37 ° C en 5% CO 2 (para el recubrimiento de la placa de 500 ml / pocillo de anti-CD3 más anti-CD28 en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ˚ C y lavar dos veces con 2 ml de PBS). </li><li> Con el fin de evitar la sobreestimulación de las células T, después de 2-3 días la transferencia de las suspensiones de células en una nueva sin recubrimiento de 24 pocillos. Incubar durante otros 2-3 días. Dependiendo de la densidad celular y la proliferación de los medios de comunicación puede convertirse en ácido (amarillo), en cuyo caso podría ser necesario para reemplazar la mitad de los medios de comunicación con IMDM completo fresco. Recoger las células después de 4-5 días (a contar desde el día 0). </li><li> Típico de los rendimientos finales son 1.2 x 10 6 células T efectoras / bien. Por lo tanto, un mínimo de 12.9 de cada uno de los pozos de las células intestinales trópico-T y las células T de control debe ser recubierto con el fin de terminar con 10-20 x 10 6 células T en cada condición. </li></ol> 2. Análisis de la tripa-homing los receptores de las células T activadas Después de 4-5 días de cultivo se debe observar una alta expresión de la tripa-homing a4b7and CCR9 receptores en las células T activadas en la presencia de los agonistas de RA o RAR, mientras que el control de las células T que expresan niveles muy bajos de estos cuatro receptores. La citometría de flujo (FACS) el análisis. <ol><li> Recoger entre 0,2-0,5 x 10 6 células y centrifugar durante 5 minutos a 300 g a 4 ° C. </li><li> Se incuba con anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) y anti-CD8 PerCP por 15 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Después de la incubación, centrifugar durante 5 min a 300 g 4 ° C. Lavar y volver a suspender las células en buffer de tinción y análisis por FACS. </li></ol> 3. T marcado de células con seguidores de células CFSE y CMTMR <ol><li> Mantenga todas las soluciones a 37 ° C antes de comenzar. Lavado de estómago-trópico células T (a4b7 alta CCR9 alta) y el control de las células T (a4b7 Baja / Neg CCR9 Baja / Neg) dos veces con PBS para eliminar el suero. Ajustar la concentración de células T de 10.15 x 10 6 / ml en PBS. </li><li> Añadir CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster) o CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluoróforos a cualquiera de intestino-trópico de células T y T el control a una concentración final de 5 mm y 10 mm, respectivamente, suavemente vortex e incubar durante 20 minutos a 37 ° C. Se recomienda cambiar los etiquetados en el mismo o en otro experimento con el fin de excluir posibles efectos intrínsecos de fluoróforos en la migración de células T. </li><li> Después de la incubación, apagar con un volumen de FBS y se incuba durante 1-5 minutos a temperatura ambiente. Diluir 10 veces con PBS caliente y centrifugar durante 5 minutos a 300 g. Lavar dos veces con PBS y resuspender en IMDM completo. </li><li> Idealmente, 10-20 x 10 6 células T de cada población debe ser mezclado en una proporción de 1:1 y luego se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Por último, volver a suspender las células en 200-250 ml de PBS caliente y se inyecta a través de la vena de la cola. </li><li> Para calcular la proporción exacta de entrada (lo ideal es cercano a 1) salvar a 5-10 ml de la suspensión de células inyectadas y se diluye con 300 ml de PBS y analizar por FACS. </li></ol> 4. El análisis de células T homing Aunque los ratones pueden ser analizados en diversos puntos de tiempo (entre 1 hora y después de varios días de la inyección de células T), mensajeras de las células intestinales trópico-T es la mejor documentada entre 12-24 h después de la inyección. Ya los puntos de tiempo aumentar los posibles efectos de otras variables que afectan el número final de células / relaciones, como la apoptosis de las células T y la salida de las células T de los tejidos. Después de los ratones son suspensiones eutanasia, células de diversos tejidos deben ser aislados de inmediato a fin de reducir la muerte celular, lo que podría afectar los rendimientos y resultados finales. Los tejidos de interés son el intestino delgado, colon, bazo, ganglios linfáticos, las placas de Peyer, hígado, pulmones y sangre. Si elinyectaron células T son de buena fe trópico intestinal de células T, que debe su casa, en promedio de 5-10 veces más (o superior) a la mucosa del intestino delgado, en comparación con el control de las células T. Sin embargo, otros tejidos, como la sangre y el bazo, no debe presentar una migración de las células T preferencial. Aislamiento de linfocitos de la lámina propia intestinal y el compartimiento intraepitelial se ha descrito anteriormente 5. <ol><li> Tinción FACS: Las muestras se resuspendieron en función del número de células recogidas, con una densidad no superior a 3,0 x 10 6 células / ml. Si congenic CD45.1 + o + Thy1.1 ratones fueron utilizados como receptores, las células se tiñen con el marcador correspondiente congenic (por ejemplo, o CD45.2 Thy1.2) en combinación con algún marcador linaje (por ejemplo, TCRbchain, CD4 y CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Durante el análisis de FACS, las células están separadas en el marcador congenic (por ejemplo, CD45.1) y luego en los marcadores de linaje específico (por ejemplo, CD4/CD8) y se analizó la relación entre las células CFSE CMTMR y positivo. </li><li> Los datos generalmente se expresa como el Índice de Homing (HI), que se calcula como el cociente CFSE / CMTMR (o CMTMR / CFSE) en cada tejido, dividido por el ratio de la entrada correspondiente (ver abajo). Si la relación de entrada es muy cercano a 1, las razones de tejido será equivalente a la HI. </li></ol> HI = CFSE tejido / tejido CMTMR: CFSE entrada / CMTMR entrada La sangre también deben ser analizados con el fin de determinar si las dos poblaciones de células T están igualmente representados en la circulación, o si una población de células T es menor respecto a los otros (por ejemplo, por la captura preferencial en los pulmones / el hígado o por disminución de la viabilidad). Esto puede ocurrir cuando se comparan las células de memoria ingenua o T en reposo en comparación con hace poco activa las células T efectoras, ya que estos últimos podrían quedar atrapados en mayor medida en los pulmones. Si el HI en la sangre es significativamente diferente de 1, se puede normalizar la HI en los tejidos por la HI en la sangre. La sangre se puede obtener a través de punción cardíaca de los ratones anestesiados (con la eutanasia avertina o isofluorano antes) y deben ser lisadas dos veces con tampón ACK antes de usarlo para la tinción FACS. Normalización de la sangre = HI tejido / HI sangre 5. Resultados representante Ratones receptores (Thy1.1 +) fueron post euthanized18h la inyección de células. Las suspensiones celulares fueron generados a partir del bazo, los ganglios linfáticos periféricos (PLN), los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y Propia pequeña lámina de intestino (LP). Después de que las células se tiñeron de Thy1.2 y CD8 y luego analizada por FACS de gating en viable Thy1.2 + células CD8 +, que fueron analizados por fin de la relación entre las células CMTMR + (trópico intestinal de células T) y la CFSE + las células (control de las células T) dividida por la relación de entrada. Los resultados se pueden visualizar como se muestra en la Figura 2, en el que se puede apreciar que el trópico intestino y el control de las células T alojados también en el bazo (HI cercano a 1, se indica con una línea roja). Por el contrario, trópico intestinal de células T emigraron alrededor de 10 veces más eficiente que el LP, en comparación con el control de las células T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Esquema de la generación y el etiquetado de los intestinos-trópico y no-gut células T trópico células T son aislados de los ratones de tipo salvaje y se activa con anti-CD3/anti-CD28 y en la presencia o ausencia de 100-200 nm todos - trans del ácido retinoico (RA). Después de 4-5 días la AR tratados con células T adquieren la expresión de receptores de intestino homing CCR9 y a4b7. Entonces, trópico intestino y el control de las células T son diferencialmente etiquetados con CFSE o CMTMR, lavado, mezclado en una proporción de 1:1 y se inyecta en un ratón receptor a través de la vena de la cola. Algunas células marcadas se utilizan para determinar la relación de entradas CFSE / CMTMR (debe ser cercano a 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Ratones Ejemplo de análisis de recalada analizado 12-18 h después de la inyección de células T y suspensiones de células individuales se obtienen de los órganos de interés. Las células se tiñeron con anti-Thy1.2 (marcador congenic), además de anti-CD8 y Thy1.2 + células T CD8 + se analizan para la relación de CMTMR + + y CFSE células en cada tejido por FACS. El tejido CMTMR / CFSE relaciones se normalizan por la entrada CMTMR / CFSE relación para obtener los índices de homing (HI). En este ejemplo CMTMR + y + CFSE células son intestino tropicales y control de las células efectoras T, respectivamente.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

A pesar de que los experimentos homing proporcionar información muy valiosa acerca de la migración de la población total de células en un tejido determinado, se debe tener en cuenta que estos ensayos no analizan directamente de adhesión endoteliales y por lo tanto no discriminar en qué etapa (s) de la adhesión de varios pasos cascada (tethering / móvil, activación o pegue) un determinado receptor homing está actuando. El estándar de oro para definir el papel específico de los receptores de homing en la cascada de adhere...

Animales: ratones C57BL / 6 se utilizan para el aislamiento de células T. Además, CD45.1 y Thy1.1 cepas congenic están disponibles a través Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los medios de cultivo: IMDM (medio modificado de Iscove Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) más el 10% SFB inactivado por calor (bovino fetal endotoxina en suero, baja, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / anfotericina B (Gibco) y 50 mM b-mercaptoetanol. ACK Glóbulos Rojos tampón de lisis (RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente). PBS (tampón fosfato salino, Hyclone, Waltham, MA). La citometría de flujo (FACS) los medios de comunicación (PBS o IMDM + 2% de SFB + 5 mM EDTA). Cuando la tinción con Selectina-Fc quimeras, los medios de comunicación con 2 mM de Ca + + se debe utilizar en todos los pasos (incluyendo la adquisición de FACS). IMDM se recomienda en este caso. T etiquetado celular y la transferencia adoptiva: CFSE (diacetato carboxifluoresceína, succinimidil éster), CMTMR ((5 - (y-6 )-((( 4-clorometil) benzoilo) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 acciones x debe hacerse en DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) y almacenados a -20 ° C. La activación policlonal de células T: 24 y 96 o bien placas (cultivo de tejidos tratados, de poliestireno, de fondo plano con tapa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 50 ml de PBS, respectivamente , que contiene anti-CD3 además de los anticuerpos anti-CD28 (10 mg / ml cada uno). A continuación, las placas de cultivo se lavan dos veces con PBS y se utiliza inmediatamente para el cultivo de células T. Por otra parte, Dynabeads recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) se puede utilizar para la activación de células T en lugar de obligado placa de anticuerpos. Citometría de flujo (FACS) de tinción: la activación policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), control de isotipo (IgG2a, k). Homing la piel de los receptores: P-selectina-Fc (purificada ratón P-selectina - IgG proteína de fusión, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina Fc (E-Selectin/Fc ratón recombinante quimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) más el correspondiente F secundario de cabra reactivo (ab &#39;) 2 anti-IgG humana R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ácido trans-retinoico (Sigma, St. Louis, MO) se vuelve a suspender en etanol absoluto o DMSO con una bombilla de color amarillo o una fuente indirecta de la luz durante la preparación. Alícuotas de almacenar en frascos de vidrio a -80 ° C y protegido de la luz en todo momento. RAR-agonistas sintéticos: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

los análisis competitivos de homing para el estudio de la tripa-trópico migración de células t

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Con el fin de ejercer su función de linfocitos necesidad de salir de la sangre y migran hacia los diferentes tejidos del cuerpo. La adhesión de linfocitos a las células endoteliales y la extravasación de tejido es un proceso de múltiples pasos controlados por diferentes moléculas de adhesión (receptores homing) expresa en los linfocitos y sus respectivos ligandos (addressins) que aparecen en las células endoteliales 1 2. A pesar de que la función de estos receptores de adhesión puede ser parcialmente estudiado ex vivo, la prueba definitiva de su relevancia fisiológica es para evaluar su función en vivo en la adhesión de linfocitos y la migración. Dos estrategias complementarias se han utilizado para este propósito: la microscopía intravital (IVM) y los experimentos mensajeras. A pesar de IVM ha sido esencial para definir la contribución exacta de los receptores de adhesión específicas en la cascada de adherencia en tiempo real y en diferentes tejidos, IVM es mucho tiempo y mano de obra intensiva, que a menudo requiere el desarrollo de sofisticadas técnicas quirúrgicas, es necesario el aislamiento previo de homogeneidad las poblaciones de células y permite el análisis de un solo tejido / órgano en un momento dado. Por el contrario, la competencia experimentos homing permitir la comparación directa y simultánea en la migración de los dos (o más) subconjuntos de células en el mismo ratón y también permiten el análisis de muchos tejidos y de un elevado número de células en el mismo experimento. A continuación se describe el protocolo de la competencia clásica mensajeras para determinar la ventaja / desventaja de un tipo de célula a la casa a tejidos específicos, en comparación con una población de células control. Hemos elegido para ilustrar las propiedades migratorias de la tripa-tropical frente a las células T no destripar-trópico, debido a que la mucosa intestinal es la mayor superficie del cuerpo en contacto con el medio externo y es también el tejido extra-linfoides con los requisitos de mejor definidos migratorias . Por otra parte, trabajos recientes han determinado que la vitamina A metabolito ácido trans-retinoico (RA) es el principal mecanismo molecular responsable de la inducción al intestino receptores específicos de la adhesión (integrinas receptor de quimiocinas a4b7and CCR9) en los linfocitos. Por lo tanto, fácilmente puede generar un gran número de intestino tropicales y no tropicales los linfocitos al intestino ex vivo mediante la activación de células T en la presencia o ausencia de RA, respectivamente, que pueden ser finalmente utilizado en los experimentos competitivos homing se describe aquí.

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

Para ejercer su función, los linfocitos deben abandonar la sangre y migrar hacia diferentes tejidos del organismo. La adhesión de los linfocitos al endotelio...

El objetivo general de este procedimiento es comparar las capacidades migratorias específicas de tejidos de dos o más subconjuntos celulares en un mismo ratón receptor, lo que permite analizar muchos tejidos y células en un solo experimento. Aquí mostramos un método para comparar las capacidades migratorias de linfocitos T generados in vitro con tropismo intestinal y linfocitos T de control en un ratón receptor de tipo salvaje. El método puede utilizarse, por ejemplo, para determinar la capacidad de los linfocitos T con tropismo intestinal de migrar hacia los ganglios linfáticos mesentéricos intestinales, los ganglios linfáticos periféricos y el bazo.En comparación con los linfocitos T de control, primero deben generarse in vitro linfocitos T efectorores con tropismo por el intestino y linfocitos T de control. A continuación, los linfocitos T experimentales y de control deben marcarse con colorantes diferenciales y mezclarse en una proporción uno a uno. Luego, se inyecta en el ratón receptor la mezcla celular, excepto una pequeña cantidad de Eloqua utilizada para confirmar la proporción de entrada.Finalmente, el ratón es sacrificado 18 horas después de la transferencia adoptiva y los órganos de interés se analizan en busca de la presencia de linfocitos T con tropismo intestinal y linfocitos T de control mediante citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la transferencia adoptiva de una sola población celular, es que se inyecta una combinación de diferentes subtipos en los mismos ratones receptores, reduciendo considerablemente la variabilidad asociada a la inyección intravenosa o al uso de distintos ratones receptores. Las implicaciones de esta técnica se extienden al tratamiento de enfermedades asociadas con una infiltración masiva de leucocitos, como la enfermedad inflamatoria intestinal.Por ejemplo, nos permite determinar cuántas moléculas son necesarias durante la migración normal, así como durante la migración de linfocitos al intestino. Además, este procedimiento nos permite evaluar la eficacia de fármacos diseñados para bloquear el tráfico de leucocitos. Etiquete cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de PBS que contenga 10 miligramos por mililitro de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Incube la placa durante dos horas a 37 grados Celsius en un ambiente con 5% de dióxido de carbono mientras se recubren los pocillos.Sacrifique un ratón de tipo salvaje y diseque el bazo, colocándolo en un tubo de 50 mililitros con medio. Aísle los PLE citos colocando el bazo entre dos láminas de microscopio y machacándolo sobre una placa de Petri. Suspender las células en PBS, pipetee la suspensión celular en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue durante cinco minutos.A 400 Gs a temperatura ambiente, retire el sobrenadante y lice las células rojas resuspendiendo el botón celular en cuatro mililitros de tampón de lisis act durante dos a tres minutos. Detenga la lisis con cinco mililitros de PBS, centrifugue nuevamente la suspensión celular durante cinco minutos a 400 Gs a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspenda el botón resultante en una vez 10 de las seis células por mililitro en hielo completo.Divida equitativamente el medio modificado de Coves delcos o IMDM en dos tubos separados, suplementando uno de los tubos con ácido retinoico todo trans o RA hasta una concentración final de 100 a 200 nanomolares cúbicos. Proteja el tubo de la luz directa para evitar la degradación del ácido retinoico todo trans. Retire la placa de 24 pocillos del incubador y lave cada pocillo dos veces con dos mililitros de PBS.Añada de 1,5 a dos mililitros de la suspensión celular suplementada con AR a la mitad de la placa de 24 pocillos. Luego, añada la misma cantidad de células control a cada pocillo de la segunda mitad de la placa de 24 pocillos y regrese la placa al incubador. Después de dos a tres días, transfiera las suspensiones celulares a una nueva placa de 24 pocillos sin recubrir.Para evitar la sobreestimulación de las células T, incubar las células durante dos o tres días adicionales. Si el medio cambia a amarillo debido a la densidad celular o a la proliferación, añadir 500 microlitros de IMDM fresco a cada pocillo para alcanzar un volumen final de un mililitro por pocillo. Para recolectar las células, recoger el sobrenadante el día cuatro o cinco, considerando como día cero el día en que se sembraron las células.Los rendimientos finales típicos son de uno a dos por diez a la seis células T efectoras por pocillo. Por lo tanto, se debe sembrar un mínimo de nueve a doce pocillos de cada tipo de células T trópicas para el intestino y células T controladas para generar de diez a veinte por diez a la seis células T por grupo. Para verificar los niveles de expresión de alfa cuatro, beta siete y CCR nueve en ra.Las células T activadas y controladas recolectan entre 0,2 y 0,5 veces 10 a la sexta de las células experimentales y de control recién obtenidas en tubos cónicos de cuatro mililitros y centrifugar durante cinco minutos a 300 ×g a cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 microlitros de tampón de tinción, incubar con anti-CD4 FSE, anti-CD4β7 PE, anti-CCR9 APC y anti-CD8 PerP durante 15 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.Después de la incubación, lave las células con PBS durante cinco minutos a 300 GS y 4 grados Celsius, deseche el sobrenadante y re suspenda las células en tampón de tinción. Vuelva a analizar mediante citometría de flujo al inicio de este paso. Precaliente un frasco de IMDM y un frasco de PBS a 37 grados Celsius para su uso posterior en el protocolo de tinción.Después de confirmar los fenotipos de homing de linfocitos T de las dos culturas celulares mediante citometría de flujo según se describió en el paso anterior, centrifugar las poblaciones de linfocitos T recién recolectadas, tropicas para el intestino (alfa cuatro, beta siete, CCR nueve alta) y de control (alfa cuatro, beta siete, CCR nueve baja o negativa) a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células dos veces más con PBS para eliminar el suero y luego ajustar la concentración de linfocitos T de cada grupo a 10-15 × 10⁶ células por mililitro. En PBS, añadir el colorante CFSE o C-M-T-M-R a los linfocitos T tropicos para el intestino o a los linfocitos T de control.Aquí se está añadiendo CFSE a la población de células control y C-M-T-M-R al intestino. Células T trópicas hasta una concentración final de cinco milimolares y 10 milimolares, respectivamente; se vortexean suavemente las células durante cinco segundos e incubar los tubos durante 20 minutos a 37 grados Celsius en baño de agua tras el período de incubación. Detener la tinción mediante la adición de cinco mililitros de FPS e incubar durante uno a cinco minutos a temperatura ambiente.Diluya 10 veces con PBS tibio y centrifugue durante cinco minutos a 300 Gs a temperatura ambiente. Descarte el sobrenadante y lave dos veces más con PBS, luego resuspenda las células en IMDM completo. Idealmente, de 10 a 20 veces 10º de las seis células de cada población de linfocitos T deben mezclarse juntas en tubos de fáxmil de cuatro mililitros en una proporción uno a uno.Para calcular la proporción exacta de entrada, guarde de cinco a 10 microlitros de la suspensión celular inyectada en el tubo, denominada muestra de entrada, y manténgala a cuatro grados Celsius. Centrifugue la mezcla celular que será inyectada a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Re suspenda las células que serán inyectadas en 250 a 300 microlitros de PBS tibio. Cargue una jeringa de insulina de un CC con una aguja de calibre 28 con las células para inyección.Inyecte 250 microlitros de la mezcla celular a través de la vena de la cola. Finalmente, analice las células de entrada mediante citometría de flujo para obtener el porcentaje de células positivas para CFSE y C-M-T-M-R que se inyectaron previamente. Esa será la proporción de entrada utilizada.En el cálculo final del índice de homing, suspendemos las muestras celulares de los tejidos para el análisis del homing de linfocitos T a una densidad no mayor de tres veces 10 a la seis células por mililitro. Si se utilizan ratones congénicos como receptores en este video, las células CD 45.1 positivas se tiñeron con el marcador congénico apropiado combinado con algún marcador de linaje durante el análisis citométrico por flujo; se seleccionan las células según el marcador congénico elegido y luego según el marcador de linaje específico CD ocho, y se analizan las proporciones entre células C-M-T-M-R y células positivas para CFSE.Los datos se expresan entonces como el índice de homing o hi, que se calcula como la relación entre los dos colorantes diferentes en cada tejido dividida por la relación de entrada correspondiente. La relación de entrada es la proporción de células positivas para CFSE respecto a las células positivas para CMTM TMR en la jeringa antes de la inyección, calculada a partir de la alícuota de cinco a 10 microlitros de la suspensión celular que se reservó y analizó mediante citometría de flujo con este fin. Si la relación de entrada es muy cercana a uno, entonces las relaciones en los tejidos serán equivalentes al hi.Si el IH y la sangre son significativamente diferentes de uno, el IH en los tejidos que se analizan puede normalizarse mediante el IH en sangre calculando la razón del IH en los tejidos dividido por el IH en las suspensiones celulares generadas a partir del bazo, ganglios linfáticos periféricos o ganglios linfáticos mesentéricos o MLN y la lámina propia o LP del intestino delgado 18 horas después de la inyección. Se analizaron la expresión de C-M-T-M-R y CFSE en células CD8 positivas y CD45.1 positivas seleccionadas por compuerta, RA activada alfa 4, beta 7 y células T CCR9 positivas que expresan C-M-T-M-R positivas que migran al bazo en números iguales a las células control CFSE positivas, pero mostraron un aumento notable en la migración hacia el intestino y los tejidos linfáticos asociados al intestino. El cálculo del IH para cada tejido confirmó además que las células T trópicas del intestino y las células T control migraron por igual al bazo, pero, por el contrario, las células T trópicas del intestino migraron aproximadamente 10 veces más eficientemente a la LP en comparación con las células T control tras dominar el procedimiento.En lugar de utilizar la nivelación con colorante, se pueden usar ratones congénicos para evaluar la capacidad migratoria de tipos celulares adicionales, como células dendríticas o macrófagos. Dado que estos tipos celulares tienden a perder el colorante una vez inyectados en los ratones receptores, el uso de animales congénicos permite un mejor seguimiento de las células durante períodos de tiempo mucho más largos tras la transferencia adoptiva.

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos...

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

Este video describe las imágenes de las células T CD8 residentes infiltrantes de tumores marcadas con anticuerpos acoplados fluorescentemente dentro de cortes de tumores de pulmón humanos. Esta técnica permite analizar en tiempo real la migración de linfocitos T CD8 mediante microscopía confocal.

Análisis en tiempo real de la migración de células T residentes en diferentes regiones tumorales mediante microscopía confocal

Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

Presentamos protocolos mejorados para la transducción retroviral de receptores de tráfico y el homing competitivo para estudiar el posicionamiento de linfocitos específicos de órganos y microambientes mediados por receptores. Este método ofrece información valiosa sobre los mecanismos de tráfico de células inmunitarias y tiene aplicaciones potenciales en futuras investigaciones básicas y terapéuticas.

Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Aprende el ensayo de homing competitivo para estudiar la migración de células T intestinales en ratones. Este método permite comparar subpoblaciones celulares simultáneamente y analizar su comportamiento migratorio in vivo.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

Explorar más videos