Name: Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende inmunohistoquímica de montaje completo para analizar la vasculatura en piel de miembro embrionario de ratón. Este método permite visualizar redes vasculares con microscopía confocal de alta resolución.

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Damos las gracias a K. Gill para obtener ayuda con la cría del ratón y el cuidado y la gestión de laboratorio. Gracias también a los miembros Mukoyama laboratorio para ayuda técnica. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto de Salud Naitonal.

1. Ratón recogida de la piel del miembro embrionarias (E13.5 E17.5 ~) <ol><li> Eutanasia conectado mujeres mediante el procedimiento de aprobación. De acuerdo con el protocolo aprobado animales, las hembras se sacrifican por el CO 2 de exposición y luego aseguró por dislocación cervical. Coloque el animal en su toalla de papel absorbente y disfrutar a fondo en el 70% de EtOH / H 2 O de un frasco. </li><li> Diseccionar el útero intacto y colocarlo en un 100 x 15 mm placa de Petri que contiene solución salina equilibrada de helado de Hanks (HBSS) para limpiarla de sangre. </li><li> Separados y diseccionar el embrión. Quitar el amnios muy delgada a partir del embrión. </li><li> (Opción) la disección de un solo embrión en un plato de 35 x 10 mm Petri si cada embrión debe ser genotipo. Cola disecados se transfiere a un tubo de PCR de 0,2 ml para el genotipado. </li><li> Cortar las extremidades anteriores del embrión y la transferencia de las extremidades anteriores con una pinza de anillo en 24 pocillos con 2 ml de helado de dulce 4% paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Fijar las patas delanteras con una suave mezcla en el mezclador Nutator a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, retire la PFA y lavar tres veces durante 5 minutos en 2 ml de PBS con agitación suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de las patas delanteras en el 100% de metanol (MeOH) y almacenarlas a -20 ° C congelador enzima (el congelador con el control de la temperatura crítica y sin función automática de descongelación). Anticuerpos primarios en la tabla 1 el trabajo después del tratamiento con MeOH al 100%. </li><li> La piel de fuera de la extremidad anterior con unas pinzas finas. La piel del miembro, cuando se deshidrata, deben separarse fácilmente de la extremidad. En primer lugar la extremidad con la cara ventral (lado de la palma) hacia arriba. Luego, usando unas pinzas finas, cortar la piel, como se muestra en el video. A continuación diseccionar alrededor de toda la extremidad, el pelado de la piel de suavidad sin ningún tipo de daño. </li></ol> 2. Todo el montaje la tinción inmunohistoquímica de Skins extremidades <ol><li> Rehidratar la piel de las extremidades en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo mediante la incubación a través de la serie graduada de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) durante 5 minutos cada uno. Tenga en cuenta que el intercambio de soluciones debe tener cuidado para no dañar las pieles de las extremidades. </li><li> Lavar dos veces durante 5 min en PBT con una suave mezcla en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Bloquear la piel del miembro, ya sea con 10% de suero de cabra / PBS 0,2% TX100 tampón de bloqueo para detectar anticuerpos de cabra secundaria o el 10% de suero burro / PBS 0,2% TX100 tampón de bloqueo para detectar anticuerpos burro secundaria durante 2 horas con agitación suave en el mezclador en Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en el tubo de 2 ml-microcentrífuga con 800μl de anticuerpos primarios (dilución adecuada como se indica en las tablas) en el tampón de bloqueo (ya sea de cabra 10% de suero / PBS 0,2 TX100% o 10% de suero de burro / PBS 0,2% TX100). Incubar las pieles de las extremidades con una suave mezcla en el mezclador de Nutator a 4 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que varios anticuerpos primarios derivados de las diferentes especies (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de rata + anticuerpo policlonal de conejo) se pueden utilizar simultáneamente. </li><li> Al día siguiente, el lugar de la piel del miembro en un 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2 TX100 % burro suero / PBS 0,2% TX100). </li><li> Lavar cinco veces durante 15 minutos con la mezcla suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en el tubo de 2 ml-microcentrífuga con 800μl de secundaria de anticuerpos en el amortiguador de bloqueo (ya sea de cabra 10% de suero / PBS 0,2% TX100 o el 10% burro suero / PBS 0,2% TX100). Normalmente se utiliza anticuerpos secundarios de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 diluciones) o Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilución). Filtrar la solución secundaria de anticuerpos con 0.22μm PVDF filtros de jeringa de membrana para eliminar las partículas de agregados de la secundaria de anticuerpos. Incubar la piel de las extremidades en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio durante 1 hora con agitación suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que diferentes anticuerpos conjugados fluorescentes secundarios derivados de las diferentes especies se pueden utilizar simultáneamente. </li><li> Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100). Lavar cinco veces durante 15 minutos en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio con mezclado suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. </li><li> (Opción para contratinción contra el núcleo) Incubar las pieles de las extremidades con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100) con A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , dilución 1:3000) en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio durante 10 minutos con la mezcla suave en el mezclador de Nutator en la sala de temre. A continuación, lavar tres veces por 5 min con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100) en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio con mezcla suave el mezclador Nutator a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la tinción fuerte y específica para los núcleos que se observa para To-Pro-3 en una emisión específica (HeNe 633 nm de excitación). </li></ol> 3. Montaje de los Skins en la extremidad de diapositivas <ol><li> Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm plato de Petri. Eliminar el polvo, los cristales, las fibras de la capa interna de la piel con unas pinzas finas bajo el microscopio estereoscópico con poca iluminación para evitar la foto de un extenso descoloramiento. </li><li> Transferencia de las pieles de las extremidades para portaobjetos adhesivos con una pinza de anillo. Coloque las pieles con la capa interna mentir al alza en la diapositiva (es decir, hacia cubreobjetos). Aplanar la piel cuidadosamente con unas pinzas finas y eliminar traspaso de tampón de lavado por Kimwipe. </li><li> Monte en la lucha contra la decoloración medios de montaje sin burbujas de aire. Utilizamos 25 "x25" cubreobjetos. Cura en una superficie plana en la oscuridad (por ejemplo, las muestras montadas con prolongar el reactivo de oro se colocan durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de ver). Para almacenamiento a largo plazo, sellar el cubreobjetos a la diapositiva y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 4. Microscopía Confocal <ol><li> Establecer láser adecuado para fluoróforos. Utilizamos microscopio Leica TCS SP5 confocal con tres fuentes láser de argón incluyendo 488nm (por Alexa Fluor 488 y GFP), 561nm DPSS (por Alexa Fluor 568 y Cy3) y HeNe 633 nm (por Alexa Fluor 633, Cy5 y To-Pro-3) . </li><li> Use la herramienta de búsqueda secuencial para evitar o reducir la interferencia en la que todos los colorantes en las muestras de doble o triple del manchar-se entusiasma al mismo tiempo. En el modo de exploración secuencial, las imágenes se grabarán en un orden secuencial. </li><li> Más información general sobre los tintes fluorescentes y láser para la excitación puede ser fundada en "Microscopía Confocal de Biología" por Hibbs (2004) </li></ol> 5. Resultados representante Todo el montaje immnofluorescence microscopía confocal de triple sello en la piel del ratón en el miembro anterior E15.5 con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (Figura 1-C, D azul), el marcador de neurofilamentos 2H3 (Figura 1 verde), y las células de músculo liso marcador αSMA (Figura 1 A, B rojo) revela un patrón característico de ramificación de las arterias αSMA +, alineado con 2H3 + nervios periféricos en la piel del miembro. Además de la ramificación de los vasos sanguíneos, la piel esta extremidad modelo vascular se utiliza para estudiar los patrones de ramificación de vasos linfáticos con anticuerpos para el marcador de las células endoteliales linfáticas LYVE-1 (Figura 1 D, E de color rojo) y Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1 D, F verde ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (AC) Las arterias se alinean con los nervios periféricos en la piel del miembro embrionario. Todo el montaje de triple sello microscopía confocal immnofluorescence con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (AC, azul), el marcador de neurofilamentos 2H3 (A, verde), y el marcador de las células musculares lisas αSMA (A y B, de color rojo ) se muestra. En E15.5, 2H3 + nervios periféricos (flechas abiertas) asociados con las arterias (puntas de flecha), que están cubiertos por αSMA + en las células del músculo liso. (DF) linfático vascular en la piel del miembro embrionario. Triple-etiqueta de la microscopía confocal immnofluorescence con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (D, azul), el marcador de las células endoteliales linfáticas LYVE-1 (D y E, de color rojo) y Neuropilin2 (NRP2) (D y F, verde ) se muestra. Los vasos linfáticos son visualizados por tanto LYVE-1 y NRP2, mientras que LYVE-1 también se expresa por una parte de los macrófagos (puntas de flecha abierta). Barra de escala: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

El sistema vascular es fundamental para el desarrollo de órganos durante la embriogénesis, así como para el mantenimiento de órganos y funciones de reproducción en los adultos, ya que proporciona suficiente oxígeno y nutrientes a los órganos. Red vascular adecuado es bien establecido, con procesos complejos y múltiples pasos por la angiogénesis en el que se reorganiza pre-existentes de la red capilar con estructuras muy ramificadas y jerárquica. A pesar de numerosos trabajos han demostrado que una variedad de moléculas ...

Anticuerpos Pan-marcador de las células endoteliales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Hamster Armenia (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Dilución 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rata (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 dilución </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rata (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rata (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 dilución </td></tr><tr><td> Colágeno IV </td><td> Conejo (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 dilución # 2 </td></tr></tbody></table> Marcador de células endoteliales arteriales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Conejo (P) </td><td> El laboratorio de la Kolodkin Alex # 3 </td><td></td><td> Dilución 1:3000 </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Cabra (P) </td><td> I + D </td><td> AF1006 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr></tbody></table> Venosa marcador de células endoteliales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Cabra (P) </td><td> I + D </td><td> AF446 </td><td> Dilución 1:100 </td></tr></tbody></table> Linfático marcador de células endoteliales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Conejo (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rata (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Conejo (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> Dilución 1:1000 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Cabra (P) </td><td> I + D </td><td> AF2727 </td><td> Dilución 1:50 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Conejo (P) </td><td> Señalización Celular </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 de dilución </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Hámster sirio (M) </td><td> Banco hibridoma </td><td> 8.1.1 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr></tbody></table> Células del músculo liso / pericitos marcador <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Ratón (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> Dilución 1:500 # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Conejo (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Conejo (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr></tbody></table> Los anticuerpos para el reportero GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> Las buenas prácticas agrarias </td><td> Conejo (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 dilución </td></tr><tr><td> Las buenas prácticas agrarias </td><td> Rata (M) </td><td> Nacalai Tesque </td><td> 04404-84 </td><td> Dilución 1:1000 </td></tr><tr><td> Las buenas prácticas agrarias </td><td> Pollo (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 dilución </td></tr></tbody></table> Los anticuerpos para el reportero LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Conejo (P) </td><td> MP Biomédica </td><td> 55976 </td><td> Dilución 1:5000 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Cabra (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> Dilución 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Pollo (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr></tbody></table> Los anticuerpos de los axones periféricos <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Especies </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Condiciones de trabajo </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Ratón (M) # 7 </td><td> Banco hibridoma </td><td> 2H3 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Ratón (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> Dilución 1:500 </td></tr><tr><td> Periferina </td><td> Conejo (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> Dilución 1:1000 </td></tr></tbody></table> Anticuerpos para la migración de las células de Schwann <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Conejo (P) </td><td> El laboratorio de Thomas Müller es # 9 </td><td></td><td> Dilución 1:3000 </td></tr></tbody></table> (P): anticuerpo policlonal (M): anticuerpo monoclonal # 1: de cabra anti-armenio hámster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) de anticuerpos debe ser utilizado como anticuerpo secundario. # 2: Los anticuerpos colágeno IV puede ser utilizado para detectar los vasos sanguíneos después de la hibridación in situ. # 3: El anticuerpo es Neuropilin1 amablemente proporcionados por el laboratorio de la Kolodkin de Alex en la Universidad Johns Hopkins. De oveja anti-anticuerpos humanos Neuropilin1 está disponible en I + D (AF3870), aunque no lo he probado todavía. # 4: Los anticuerpos LYVE-1 también se detecta un subconjunto de los macrófagos en la piel embrionaria. # 5: El anticuerpo anti-ratón de anticuerpos es αSMA monoclonal IgG2a. # 6: El anticuerpo conjugado con Cy3 αSMA se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, junto con el secanticuerpos secundaria de otros anticuerpos primarios. # 7: 2H3 anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón de anticuerpos contra neurofilamentos. # 8: Tuj1 anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón de anticuerpos contra las neuronas específicas de la clase III beta-tubulina. # 9: El BFABP (cerebro-específica de ácidos grasos de unión a proteínas) de anticuerpos es amablemente proporcionados por el laboratorio Thomas Müller en Max-Delbrück-Center de Medicina Molecular.

todo el montaje el análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Todo el montaje análisis inmunohistoquímico para obtener imágenes de todo el sistema vascular es fundamental para la comprensión de los mecanismos celulares de la ramificación morfogénesis. Hemos desarrollado el modelo de la piel del miembro vasculatura para estudiar el desarrollo vascular en el que un pre-existentes primitivo plexo capilar se reorganiza en una red jerárquica ramificada vascular. Todo el montaje de microscopía confocal con el etiquetado múltiple permite a la imagen robusta de los vasos sanguíneos intactos, así como sus componentes celulares incluyendo las células endoteliales, pericitos y células de músculo liso, utilizando marcadores fluorescentes específicos. Los avances en este modelo las extremidades vasculatura la piel con los estudios genéticos han permitido comprender los mecanismos moleculares del desarrollo vascular y el patrón. La piel del miembro vasculatura modelo ha sido utilizado para estudiar cómo los nervios periféricos proporcionan un modelo espacial para la diferenciación y el patrón de las arterias. En este artículo se describe un protocolo de vídeo sencillo y robusto para teñir los vasos sanguíneos intactos con vascular anticuerpos específicos y anticuerpos fluorescentes secundaria, que es aplicable para vascularizado órganos embrionarios en los que son capaces de seguir el proceso de desarrollo vascular.

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

El análisis inmunohistoquímico de piezas enteras para la obtención de imágenes de toda la vasculatura es fundamental para comprender los mecanismos celulares de la morfogénesis ramificada. Hemos desarrollado el modelo de vasculatura de la piel de la extremidad para estudiar el desarrollo vascular, en el cual un plexo capilar primitivo preexistente se reorganiza en una red vascular ramificada jerárquicamente. La microscopía confocal de piezas enteras con marcado múltiple permite la obtención de imágenes robustas de vasos sanguíneos intactos, así como de sus componentes celulares, incluyendo células endoteliales, pericitos y células de músculo liso, mediante el uso de marcadores fluorescentes específicos. Los avances en este modelo de vasculatura de la piel de la extremidad, junto con estudios genéticos, han mejorado la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo y el patrón vascular. El modelo de vasculatura de la piel de la extremidad se ha utilizado para estudiar cómo los nervios periféricos proporcionan una plantilla espacial para la diferenciación y el patrón de las arterias. Este video artículo describe un protocolo sencillo y robusto para teñir vasos sanguíneos intactos con anticuerpos específicos vasculares y anticuerpos secundarios fluorescentes, el cual es aplicable a órganos embrionarios vascularizados donde es posible seguir el proceso de desarrollo vascular.

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis inmunohistoquím ico en montaje completo para obtener imágenes de toda la vasculatura en la piel en desarrollo del miembro. Esto se logra primero cortando cuatro miembros del embrión, fijando los cuatro miembros en paraformaldehído al 4% en PBS y luego deshidratándolos en metanol al 100%. El segundo paso consiste en usar pinzas finas para desprender la piel en la base del miembro.Siga las líneas punteadas azules y desprenda la piel en un recipiente que contiene metanol al 100 %. Retire la piel del miembro. A continuación, se realiza la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos primarios específicos para vasos sanguíneos y anticuerpos secundarios fluorescentes en la piel del miembro.Finalmente, la microscopía confocal en montaje completo con múltiples marcaciones permitirá una visualización robusta de toda la vasculatura de la piel del miembro, lo que representa una ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el análisis histológico por conteo cruzado. A diferencia del corte de embriones, el análisis inmunohistoquímico en montaje completo de la vasculatura de la piel del miembro nos permite no solo imaginar toda la vasculatura, incluyendo sus componentes celulares, sino también estudiar los procesos de diferenciación y el patrón de las células de los vasos sanguíneos y la ramificación de los vasos linfáticos. Estamos demostrando el procedimiento junto con DA Winding, investigadora postdoctoral de mi laboratorio. Las pieles embrionarias de miembros se recolectan de ratones hembra preñadas.Después de extraer y lavar el útero, trabaje bajo un microscopio estereoscópico para separar y diseccionar los embriones. Una vez que los embriones hayan sido diseccionados, el siguiente paso consiste en retirar los cuatro miembros del embrión utilizando pinzas finas. Corte los cuatro miembros a la altura del hombro y luego use una pinza de anillo para transferirlos a una placa de 24 pocillos que contenga hielo.Coloque dos miembros en frío y fresco al 4 % de paraformaldehído en PBS por pocillo, en dos mililitros de PFA al 4 %. Fije los cuatro miembros con mezcla suave en un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius durante la noche; al día siguiente, retire el PFA de cada pocillo y agregue dos mililitros de PBS.Lave las muestras durante cinco minutos con mezcla suave en el mezclador mutador a temperatura ambiente. Repita este lavado dos veces para un total de tres lavados. A continuación, transfiera los cuatro miembros a un tubo redondo de polipropileno de cinco mililitros que contenga metanol al 100 % y almacénelo a menos veinte grados Celsius en un congelador de enzimas con control crítico de temperatura y sin función de descongelación automática. Tras el almacenamiento nocturno a menos veinte, la piel puede separarse del tejido subyacente.Este es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento, ya que el éxito de la tinción e imagen subsecuentes depende de no dañar las pieles. La piel del miembro se separa fácilmente del miembro cuando se deshidrata de esta manera para desprender la piel de los cuatro miembros. Coloque primero el miembro con el lado ventral hacia arriba.Luego, utilizando pinzas finas, disecar a través de la piel cerca de la base del miembro hacia la pata en línea recta. A continuación, disecar alrededor de todo el miembro, retirando la piel mientras se gira el miembro. Una vez que se haya retirado la piel.Prepare previamente las cuatro extremidades para la tinción inmunohistoquímica en montaje completo de las pieles de las extremidades. Prepare tres tubos de 50 mililitros con metanol al 75 %, al 50 % y al 25 % en PBT para la rehidratación. Las pieles, es decir, las pieles de las extremidades, se rehidratan incubándolas en una serie graduada de metanol, desde las concentraciones más altas hasta las más bajas, durante cinco minutos cada una.Para comenzar, transfiera la piel del miembro a un tubo redondo de polipropileno de cinco mililitros que contenga metanol al 75% en PBT. Después de cinco minutos en el mezclador agitador, aspire cuidadosamente el metanol al 75% y rellene con metanol al 50% y PBT. Cinco minutos después.Sustituya el 50% de metanol por metanol al 25% y PBT. Al final de la incubación final, aspire cuidadosamente la mezcla de metanol al 25% y PBT y rellene con PBT.Lave las pieles de las extremidades durante cinco minutos con mezcla suave en el mezclador mutador a temperatura ambiente. Repita este lavado una vez. Tenga cuidado de evitar dañar las pieles de las extremidades durante el intercambio de soluciones.Una vez que las pieles de las extremidades se hayan rehidratado, bloquéelas con el tampón de bloqueo adecuado. Incube durante dos horas con mezcla suave en el agitador nutator a temperatura ambiente. Después de dos horas, coloque las pieles de las extremidades en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Luego use fórceps de anillo para transferir las pieles a un tubo fuge de dos mililitros que contenga 800 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en el tampón de bloqueo adecuado.Aquí, se pueden usar simultáneamente múltiples anticuerpos primarios derivados de diferentes especies. Incube las pieles de las extremidades con agitación suave en el mezclador mutador a cuatro grados Celsius durante la noche; al día siguiente, coloque las pieles de las extremidades en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Transfiera las pieles a un tubo redondo de polipropileno de cinco mililitros que contenga cuatro litros del tampón de lavado adecuado.Lave cinco veces durante 15 minutos cada vez con mezcla suave en el agitador rotatorio a temperatura ambiente. Reemplace cuidadosamente el tampón usado con tampón nuevo para cada lavado durante los lavados. Prepare los anticuerpos secundarios para eliminar las partículas agregadas de los anticuerpos secundarios.Use un filtro de jeringa con membrana de PVDF de 0,22 micrones para filtrar la solución de anticuerpo secundario en un tubo fuge de 1,5 mililitros. Luego, centrifugue la muestra filtrada a 15.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar partículas y burbujas de aire. Recopile la solución de anticuerpo filtrada en un tubo microfuge de dos mililitros.Una vez realizados los cinco lavados, coloque las pieles de las extremidades en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros y transfiéralas a un tubo microfuga de dos litros que contenga 800 microlitros de anticuerpos secundarios en el tampón bloqueador. En este paso se pueden usar simultáneamente diferentes anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos derivados de distintas especies. Incube las extremidades y pieles a temperatura ambiente, a oscuras, durante una hora con agitación suave en el agitador mutador.Después de la incubación de una hora, coloque las pieles de los miembros en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros y transfiéralas a un tubo redondo de polipropileno de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros del tampón de lavado adecuado. Lave cinco veces durante 15 minutos cada vez, en la oscuridad, con mezcla suave en el mezclador Tator a temperatura ambiente para su visualización mediante microscopía confocal. Las pieles de los miembros deben montarse sobre un portaobjetos después de la tinción inmunohistoquímica.Para comenzar este procedimiento, coloque las pieles teñidas de las extremidades en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros, trabajando bajo un microscopio estereoscópico con iluminación baja. Para evitar un extenso blanqueamiento por luz, use pinzas finas para eliminar cristales de polvo y fibras de la capa interna de las pieles. Transfiera las pieles de las extremidades a un portaobjetos microscópico adhesivo.Coloque las pieles con la capa interna hacia arriba sobre el portaobjetos, orientadas hacia el cubreobjetos. Luego, aplane cuidadosamente las pieles usando pinzas finas. Retire el tampón de lavado residual con una toallita Kim.Añada medios de montaje Antifa a las pieles y coloque un cubreobjetos de 25 por 25 encima de los especímenes. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire y deje curar sobre una superficie plana en la oscuridad a temperatura ambiente para el almacenamiento a largo plazo de los especímenes. Selle el cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas y almacene a cuatro grados Celsius.El patrón de los nervios y los vasos sanguíneos en la piel de la extremidad de ratón en E15.5 se muestra mediante estos resultados representativos de microscopía confocal de inmunofluorescencia triple en montaje completo. La inmunofluorescencia del marcador panendotelial pcam uno es azul. El marcador de neurofilamentos dos H tres es verde, y el marcador de células musculares lisas alfa SMA es rojo. Estas imágenes revelaron un patrón de ramificación característico de arterias positivas para alfa SMA, indicadas por la punta de flecha blanca, alineadas con los nervios periféricos dos H tres, indicados por flechas abiertas, además de la ramificación de los vasos sanguíneos.Este modelo de vasculatura de la piel del miembro también puede revelar el patrón de ramificación de los vasos linfáticos mediante el marcador de células endoteliales linfáticas LYVE-1 mostrado en rojo y NRP-2 mostrado en verde. Los vasos linfáticos se visualizan mediante LYVE-1 y NRP-2, mientras que LYVE-1 también se expresa en un subconjunto de macrófagos indicado por las cabezas de flecha abiertas. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular exploren los complejos procesos de patrón y diferenciación de la vasculatura durante el desarrollo tisular, la reparación de tejidos y en condiciones patológicas.

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Investigación

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Biología

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Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones (Video) | JoVE Journal

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

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