Name: Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprende el ensayo ACT para identificar interacciones de ADN de largo alcance en células de leucemia promielocítica humana. Este método revela asociaciones genómicas desconocidas y mejora el estudio de la arquitectura nuclear.

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Agradecemos a Adelle Murell y Reik Lobo mucho por compartir su protocolo 3C. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa y el Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos.

1. El formaldehído fijación de las interacciones de la cromatina de largo alcance <ol><li> La línea de cultivo de células humanas HL-60 en medio RPMI1640 con FBS al 15% y 1 x penicilina / estreptomicina al 80-90% de confluencia en una incubadora suministra con 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Recoger las células en un tubo de 50 ml Nunc, se centrifuga a 1.200 rpm durante 15 minutos, y luego eliminar el medio por aspiración </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo para volver a suspender los sedimentos celulares, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Tome aproximadamente 1 x 10 7 células en un volumen de 40 ml con FBS RPMI1640 / 10%, a continuación, añadir 1,7 ml de formaldehído al 37% para arreglar la cromatina diluido. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave, y luego apagar con 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar durante 15 minutos a 1200 rpm a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento una vez con 40 ml de PBS frío hielo, y luego girar hacia abajo el precipitado y retirar el PBS. </li></ol> 2. Lisis celular para aislar los núcleos <ol><li> Resuspender las células en 40 ml de solución amortiguadora de lisis fría (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) con inhibidores de la proteasa recién añadido (dilución 1:500) y 0,1 mM PMSF. Incubar en una cámara frigorífica con una rotación de 90 minutos, se centrifuga a 2.500 rpm durante 15 minutos, y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 3. Restricción de la digestión enzimática con Bgl II <ol><li> Resuspender los núcleos en 0,5 ml de un tampón NEB x 3, y añadir 15 μlof 10% SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación, a continuación, añadir 45 l de 20% de Triton X-100 para capturar la SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación. </li><li> Utilice una alícuota de 1 x 10 6 núcleos (alrededor de 15 mg, una décima parte de las células originales) para la digestión con enzimas de restricción. Saque 55 l de solución de los núcleos de Paso 3.1 y enrasar a 500 ml con 433 l de 1 x tampón NEB 3 y 12 l de Bgl II (50U/ul). Se incuba a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 4. La ligadura de segmentos de ADN que interactúan <ol><li> Inactivar la enzima de restricción mediante la adición de 95 l de 10% SDS, y se desnaturalizan por calor a 65 ° C durante 20 minutos en un baño de agua. </li><li> 7 ml de un tampón de ligación x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, MgCl2 10 mM, 10 mM DTT, 1 mM ATP) y 360 l de 20% de Triton X-100 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora . </li><li> Baje la temperatura a 16 ° C y añadir 50 l de 400 U / l de ADN ligasa T4. Incubar la muestra a 16 ° C durante 4 horas y después a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li></ol> 5. Purificación de ADN <ol><li> Añadir 300 mg de proteinasa K, y se incuba a 65 ° C durante la noche. </li><li> Añadir 5 g de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos </li><li> Purificar el ADN por extracción con fenol / cloroformo, y el ADN precipitado con isopropanol. Disolver el ADN en 150 ml de agua destilada estéril. </li></ol> 6. La digestión con Msp I y la ligadura con engarces de oligonucleótidos <ol><li> Incubar 2μg de ADN purificado con 5 unidades de Msp I a 37 ° C durante 4-6 horas. Inactivar Msp I a 65 ° C durante 10 minutos, luego precipitar el ADN en etanol con 1 l de 5 mg / ml de glucógeno. Disolver la pastilla de ADN en 50 l de agua destilada estéril. </li><li> Mezclar 50 l de Msp I tratados con ADN con 2 l de una L 20 M oligonucleótido enlazador (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 l de un oligonucleótido S 20 M (5'-cggtgaatc-3'), 1 l de agua destilada estéril y 6 l de 10 x tampón T4 ADN ligasa. Cubrir la mezcla con la cera líquida. </li><li> Oligonucleótidos se desnaturalizan a 50 ° C durante 1 minuto y dejar enfriar de forma gradual a 10 ° C en un 0,5 ° C / minuto gradiente en un termociclador. </li><li> Añadir 1 l de 400 U / l de ADN ligasa T4 y se incuba a 15 ° C durante la noche. Purificar el ADN linker-liga con un kit QIAquick PCR Purificación, y eluyen en 50 l de agua destilada estéril. </li></ol> 7. Amplificación por PCR y análisis de secuencias <ol><li> Elija una cartilla de la región específica del ADN que se desea estudiar a larga distancia en las interacciones (es decir, el «cebo»). En este ejemplo, usamos ABL-1. </li><li> Tome 1 l de ADN purificado para llevar a cabo la primera ronda de PCR utilizando un l de 20 M -1 ABL cebadores específicos # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 l de 20 mM imprimación específica enlazador # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. Dos l de 32 P-dCTP se añade a 100 l de 3 x ADN polimerasa Taq I Klen cóctel antes de la amplificación por PCR. El ciclo térmico para un arranque en caliente PCR es de 72 ° C durante 2 min, 95 ° CFOR 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 65 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; la última prórroga se realiza a 72 ° Cdurante 5 minutos. </li><li> Purificar los productos de primera ronda de PCR utilizando un kit QIAquick PCR Purificación, y el ADN se eluyen en 30 l de agua destilada estéril. </li><li> Tome 1 l de 100 x diluida primer producto de PCR para llevar a cabo una segunda ronda de PCR utilizando los cebadores anidados mediante la adición de 1 l de 20 mM ABL-1 cebadores específicos # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Figura 1a), 1 l de 20 M de imprimación específica enlazador # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 l de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. El calendario de ciclos térmicos es de 25 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 67 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto, seguido de la extensión a 72 ° C durante 5 minutos. </li><li> Visualizar los productos de PCR mediante la ejecución de un 5% de urea-PAGE gel y el escaneo de la pantalla expuesta en un PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda de PCR pueden ser reciclados a partir del gel mediante la disolución de las bandas de gel en un tubo Eppendorf que contiene 60 l de agua destilada estéril, y la incubación a 95 ° C durante 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm durante 10 segundos para recoger todas las muestras. Quitar una l que se utilizará como plantilla de ADN para realizar PCR con el primer par de 2961/4626 con las mismas condiciones como se describió anteriormente. Análisis de la secuencia se puede realizar después de la purificación utilizando un kit QIAquick PCR Purificación. </li><li> Secuencias de ADN se analizó mediante una herramienta en línea para determinar su localización cromosómica en el sitio web: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Haga clic en "Blat" para entrar en una nueva ventana que permite pegar una secuencia de ADN, aparecerá una nueva ventana después de hacer clic en 'enviar', y muestra los "Resultados de la búsqueda Blat. Haga clic en "browser" de la exitosa con 100% de identidad para entrar en una ventana al lado de mostrar la ubicación de la secuencia de ADN. </li></ol> 8. Resultados representante 1. ACT ensayo utilizando ABL-1 región como cebo para determinar sus interacciones a largo rango de ADN Como se ilustra en la Figura 1a, dos sitios de Bgl II y un sitio BamH I fueron elegidos para el ensayo de ACT. En la segunda ronda de PCR, primer conjunto 4626/2961 fue utilizado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 se utilizó para ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para ABL-M3. Un patrón típico muestra un gel de varias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de un ensayo ACT consta de dos segmentos de ADN que combina: un segmento se deriva de la región de ADN cebo, mientras que el segundo segmento proviene del asociado, que se unió al segmento de la región cebo por la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción primera. La secuencia de la enzima segundo reconocimiento aparecerá al final de la secuencia de los miembros asociados (Figura 1c). El clonado ABL-M1 fragmento contiene ADN de la región de ABL1 localizado en el cromosoma 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, y el miembro asociado, se encuentra en el cromosoma 3p13 de +71,869,882-71,870,107. Las identidades de los miembros asociados son descubiertos por las voladuras de sus secuencias utilizando la UCSC genoma navegador (GRCh7/hg19 lanzado en febrero de 2009). PROK2 fue identificado como el miembro asociado en el locus chr3p13. Del mismo modo, el socio de ABL-M2 asociados se localizó en chr5q21.1, mientras que el clon ABL-M3 fue identificado como una asociación dentro de los cromosomas, cerca de la ABL-1 locus. 2. La determinación de las interacciones de largo alcance usando menos prevalentes ensayo ACT Otros ensayos sobre la base de 3C han reportado muchos más socios que interactúan que hemos mostrado en la Figura 1 y en el Igf2 / H19 lugar 12. La metodología que hemos planteado seleccionará las interacciones más frecuentes de largo alcance. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR, es posible identificar las asociaciones adicionales, menos frecuentes, así (Figura 2). 3. Diferencias en las interacciones de largo alcance en las células del cáncer en comparación con tejidos normales. La prueba ACT también puede ser utilizado para identificar las diferencias en la arquitectura y las interacciones nucleares de largo alcance entre células normales y células cancerosas (Figura 3). Estas diferencias pueden reflejar cambios en la arquitectura nuclear que se producen durante la transformación celular, y por lo tanto este ensayo en última instancia, pueden ser aplicables para fines de diagnóstico. Los patrones de gel similares que ocurren tanto en los tejidos normales y el cáncer se indica que la prueba ACT es confiable y repetible. Mientras que el ensayo ACT puede identificar socios a largo rango de ADN, análisis adicionales, tales como peces y ensayos de chip, están obligados a verificar la presencia de las asociaciones identificadas entre loci lejano. Los estudios genéticos, fisiológicos y bioquímicos se puede llevar a cabo para dilucidar las implicaciones biológicas de estas asociaciones de ADN de largo alcance. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 ACT ensayo utilizando ABL-1 región de ADN cebo en células HL-60. a. ADN estructuraUre en ABL-1 región. La enzima de restricción por primera vez en ACT ensayo se Bgl II. Los primers para la segunda ronda de PCR también se etiquetan mediante flechas y números correspondientes de imprimación. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Primer par de 4626/2961 fue utilizado para amplificar el clon de ABL-M1 en la PCR anidada, 4630/2961 se utilizó para clonar ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para clonar ABL-M3. c. La secuencia de ADN del clon ABL-M1. Fragmento de ADN de ABL-1 ADN cebo está etiquetado en rojo, y el socio de ADN asociado tiene la etiqueta de color cyan. Bgl II sitio (AGACTC) fue marcado en verde, y Msp I sitio (CCGG) está marcado en color púrpura. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 ciclos de PCR afectar los resultados del ACT ensayo. Uso de la región de control de impresión (ICR) en el locus IGF-2/H19 como cebo de ADN en las células de fibroblastos de ratón, diferentes programas de ciclismo se aplicaron en la primera y segunda ronda de PCR en la prueba de ACT. 18-20 ciclos en la primera ronda de PCR no amplificar la señal lo suficiente como para ser visualizado. Veinte y cinco ciclos en el segundo los resultados de PCR en las bandas claras, mientras que el aumento del número de ciclos para la segunda ronda de PCR inducido por un patrón de tinción, además de más bandas. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 La detección de diferencias en la arquitectura nuclear entre el tejido normal del colon y el tejido de cáncer de colon en el ensayo ACT. A. La estructura del ADN de la región ICR en IGF-2/H19 lugar y el gen IGF2. Dpn sitios para el ensayo ACT II son etiquetados. Cebadores utilizados en la segunda ronda de PCR están marcados con flechas y números en diferentes colores que corresponden a cada calle, en el panel B de la figura. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Tejido normal del colon MAD03-1423 y el tejido de cáncer de colon MAD04-149 se obtuvo de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN) División Oeste. Después de cada tejido del colon se homogeneizó, ensayo ACT se llevó a cabo siguiendo los procedimientos descritos en este documento. Carril 1 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') marcados en color rosa en un panel, carril 2 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') etiqueta de color naranja en un panel, carril 3 representa los resultados de la PCR con el primer par # 2961 y # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') marcados en azul en el panel de una; carril 4 corresponde a los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') marcada en verde en el panel de a. Bandas únicas que aparecen sólo en el tejido normal del colon están marcados por flechas amarillas, y esas bandas que apareció sólo en el tejido de cáncer de colon están etiquetados en las flechas rojas. ICR, el control de impresión de la región, DMR, región metilado diferentes.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

Dekker et al. Desarrolló la conformación de los cromosomas de captura (3C) método para detectar la frecuencia de interacción entre dos loci del genoma 1 y 3C se ha utilizado ampliamente para investigar las asociaciones intra-e inter-cromosómicas cromosómicas entre dos regiones de ADN en células de mamíferos conocidos 2 -9. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus 10-11. Hemos modificado este enfoque para identificar las regiones desconocidas de ADN que están asociados con una región de ADN conocidos en el ratón y células humanas cultivadas (Figura 1). Hemos llamado a este método la trampa cromosómicas asociadas (ACT) de ensayo, ya que nos proporciona un método fiable y reproducible para identificar nuevos socios de ADN desconocido que se asocian con una zona piloto de ADN que se sabe 12. Un ensayo con éxito 3C con los controles adecuados se realiza antes de la ejecución de los aspectos novedosos de la prueba ACT 13. Con el fin de tofind como muchas regiones de ADN asociadas como sea posible, es necesario el uso de varias combinaciones de enzimas de restricción primera y segunda. Es especialmente importante la utilización de enzimas de restricción que son sensibles a la metilación CpG para llevar a cabo el primer paso para la ligadura de 3C. La unión a proteínas y la metilación del ADN también pueden influir en la eficiencia de la enzima de restricción digestión y puede conducir al fracaso de la ligadura de las regiones de ADN asociadas a ciertas digestiones con enzimas de restricción. La aparición de la ligadura de intra o inter-cromosómica depende de la proteína-ADN de entrecruzamiento y apropiado mapas físicos de las dos regiones de ADN asociadas. Por lo tanto, algunos experimentos preliminares son esenciales para establecer una concentración de formaldehído eficaz posible y el tiempo de tratamiento en el ensayo de ACT. Una gama de concentraciones finales de formaldehído (from1.5% a 2%) se han utilizado en varios laboratorios en la parte de 3C de la prueba de 7,9. Por otra parte, los oligonucleótidos utilizados como enlaces pueden ser diseñados para coincidir con el extremo cohesivo cortado por la enzima de restricción segundos. Aunque se encontró que los ciclos de 18-20 en la primera ronda de PCR y los ciclos de 20-25 en la segunda ronda de PCR podría proporcionar bandas claras, es necesario establecer las mejores condiciones de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula recocido entre la secuencia del adaptador extremo 5 &#39;y 3&#39; final complementaria de una cadena de ADN puede ocurrir en la PCR, que inhibe específica del adaptador de primer recocido con la molécula de ADN, y dio lugar a la eficiencia de amplificación mucho menor en el primero de varios ciclos. Después de la meta de ADN fue amplificado por ciclos, su cantidad puede ser mucho mayor que estas reacciones no específicas, y puede facilitar la competencia de primer recocido a las moléculas de ADN diana. Esta es la razón por la que podemos ver a la amplificación de fondo, y por qué el producto la primera ronda de PCR tiene que ser diluida para disminuir amplification.It de fondo es importante para eliminar el exceso de cebadores de la reacción de PCR con el fin de disminuir el fondo en la segunda ronda de PCR. Como en todos los experimentos basados ​​en la PCR, es de vital importancia el diseño de cebadores que no se encuentran en las regiones de secuencia de repetición, que constituyen la mayoría del ADN humano y el ratón. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus.

<table><tbody><tr><td>Medio RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ATP, 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa T4 de ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>formaldehído al 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de proteinasas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alfa P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico PTC-100</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance interacciones adn

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

La información genética codificada por el ADN está organizado en una estructura de la cromatina complejo y altamente regulado. Cada cromosoma ocupa un territorio específico, que puede variar de acuerdo a la etapa de desarrollo o del ciclo celular. La expresión de genes puede ocurrir en las fábricas especializadas en los segmentos de la transcripción de la cromatina puede salida en lazo de los territorios de varios cromosomas, dando lugar a la co-localización de segmentos de ADN que pueden existir en diferentes cromosomas o muy separados en el mismo cromosoma. La trampa de cromosomas asociados (ACT) de ensayo proporciona una metodología eficaz para identificar el ADN de estas asociaciones a largo plazo de una manera imparcial mediante la ampliación y modificación de la conformación técnica de captura de los cromosomas. La prueba ACT hace posible para nosotros para investigar los mecanismos de regulación transcripcional en trans, y puede ayudar a explicar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión de genes en la fisiología normal y durante estados de enfermedad.

La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

La información genética codificada por el ADN se organiza en una estructura de cromatina compleja y altamente regulada. Cada cromosoma ocupa un territorio específico, ...

El objetivo general del siguiente experimento es descubrir e identificar los fragmentos de ADN asociados a larga distancia. Esto se logra mediante la fijación, la lisis celular y la digestión del ADN con la primera enzima de restricción, seguida de una ligación para crear un ADN quimérico compuesto por segmentos de los dos genes asociados. A continuación, se añaden adaptadores al ADN quimérico tras la segunda digestión de restricción para facilitar su amplificación. Luego se realiza la amplificación por PCR utilizando cebadores específicos para los adaptadores y el ADN cebo, con el fin de obtener cantidades suficientes de los fragmentos de ADN asociados. Los resultados obtenidos muestran los fragmentos de ADN asociados a larga distancia con el ADN cebo, basándose en el análisis de secuencias de los fragmentos de ADN amplificados.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la captura de conformación de cromosomas o tres C, es que A-C-T-S-A puede utilizarse para identificar eficazmente un asociado de ADN desconocido a largo alcance. Mientras que tres C surgió para la verificación de interacciones previamente sospechadas únicamente. Para comenzar este protocolo, cultive células humanas en un incubador provisto con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius hasta que alcancen una confluencia del 80 al 90%.Se utilizan células de leucemia promielocítica ácida humana para esta demostración. Recolecte las células vertiéndolas en un tubo NOC de 50 mililitros y centrifugue a 1200 RPM durante 15 minutos. Tras la centrifugación, elimine el medio mediante aspiración.Añada cinco mililitros de medio de cultivo para resuspender los pellet celulares. Después de contar las células con un citómetro de hemocitómetro, tome aproximadamente un por diez a la séptima células hasta un volumen de 40 mililitros con RPMI 1640, medio que contiene 10% FBS. Luego añada 1,7 mililitros de formaldehído al 37% para fijar la cromatina diluida.Incube la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave. Tras la incubación, detenga la reacción con 2,4 mililitros de glicina dos molar. A continuación, centrifugue la muestra durante 15 minutos a 1200 RPM y cuatro grados centígrados.Tras eliminar el sobrenadante, lave el sedimento una vez con 40 mililitros de PBS frío con hielo, luego centrifugue la muestra para recuperar el sedimento celular lavado. Re suspenda el sedimento resultante en 40 mililitros de tampón de lisis frío con hielo, con inhibidores de proteasas recién añadidos y PMSF 0,1 milimolar. Incube la muestra en cámara fría con agitación rotatoria durante 90 minutos. Finalmente, centrifugue la muestra a 2.500 RPM durante 15 minutos, elimine el sobrenadante y obtenga los núcleos aislados. Re suspenda los núcleos en 0,5 mililitros de tampón NEB 1X y añada 15 microlitros de SDS al 10 %.Incube la muestra a 37 grados Celsius durante una hora con agitación. Luego, agregue 45 microlitros de Triton X-100 al 20% para secuestrar el SDS e incube nuevamente a 37 grados Celsius durante una hora con agitación y una alícuota de uno por diez a la sexta. Los núcleos, o aproximadamente 15 microgramos, se utilizan para la digestión con enzima de restricción en 55 microlitros de solución de núcleos.Añada 433 microlitros de un tampón XNEB tres y 12 microlitros de BGL dos. Para obtener un volumen total de reacción de digestión de 500 litros, incube la reacción a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, inactivar la enzima de restricción añadiendo 95 microlitros de SDS al 10% y desnaturalice la enzima calentando a 65 grados Celsius durante 20 minutos.En un baño de agua, agregue siete mililitros de tampón de ligación 1x y 360 microlitros de Triton X-100 al 20%. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante una hora. Reduzca la temperatura a 16 grados Celsius y agregue 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.T cuatro ADN ligasa. Incube la reacción de ligación a 16 grados Celsius durante cuatro horas y luego a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez completada la ligación, agregue 300 microgramos de proteinasa K e incube a 65 grados Celsius durante la noche.Luego, agregue cinco microgramos de RNAA e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Purifique el ADN mediante extracción con fenol-cloroformo y precipite el ADN en isopropanol; disuelva el ADN precipitado en 150 microlitros de agua destilada estéril. Para agregar conectores al ADN quimérico, primero digiera el ADN incubando dos microgramos de ADN purificado con cinco unidades de MspI a 37 grados Celsius durante cuatro a seis horas. Tras la digestión, inactível el MspI a 65 grados Celsius durante 10 minutos.Luego precipite el ADN en etanol con un microlitro de cinco miligramos por mililitro de glucógeno. Disuelva el sedimento de ADN resultante en 50 microlitros de agua destilada estéril. A continuación, mezcle 50 microlitros de ADN tratado con MSP1 con dos microlitros de un oligonucleótido conector de 20 micromolar (L) y un microlitro de un oligonucleótido S de 20 micromolar; luego añada un microlitro de agua destilada estéril y seis microlitros de tampón 10X para ADN ligasa T4.Cubra la mezcla con cera líquida. Desnaturalice los oligonucleótidos a 50 grados Celsius durante un minuto y deje enfriar gradualmente hasta 10 grados Celsius en un gradiente de 0,5 grados Celsius por minuto. Utilizando un termociclador, añada un microlitro de ligasa de ADN T4 de 400 unidades por microlitro e incube la reacción a 15 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, purifique el ADN ligado al conector utilizando un kit de purificación rápida de PCR Kaya y eluya en 50 microlitros de agua destilada estéril. Luego, elija un cebador para la región específica de ADN que se investigará en cuanto a interacciones de largo alcance. En este ejemplo, Abel se utilizará como cebador o cebo.Prepare el ADN purificado para la primera ronda de PCR combinando un microlitro del ADN purificado con un microlitro de un cebador específico de la sonda uno de 20 micromolar, 46 56, y un microlitro de un cebador específico del conector de 20 micromolar, 29 63. Luego agregue tres microlitros de tres x ClinTech, una mezcla de ADN polimerasa que previamente se ha mezclado con 32 P-D-C-T-P según el protocolo escrito, seguido de tres microlitros de agua destilada estéril. Realice la amplificación por PCR utilizando el ciclo térmico de PCR con inicio en caliente descrito en el protocolo escrito después de que el ciclo de PCR haya finalizado.Purifique los productos de la PCR de primera ronda utilizando un kit de purificación rápida de PCR kaya. Eluya en 30 microlitros de agua destilada estéril. Utilice un microlitro del producto de la primera PCR diluido 100 veces para realizar una segunda ronda de PCR usando cebadores anidados, añadiendo un microlitro de cebador específico de la amplicón uno de 20 micromolar, 46 26, y un microlitro de cebador específico del conector de 20 micromolar, 29 61.Nuevamente, agregue tres microlitros de tres veces ClinTech, ADN polimerasa, un cóctel y tres microlitros de agua destilada estéril. Realice la segunda ronda de PCR utilizando un programa de termociclado de 25 ciclos de 95 grados Celsius durante 20 segundos, 67 grados Celsius durante 40 segundos y 72 grados Celsius durante un minuto, seguido de una extensión a 72 grados Celsius durante cinco minutos.Visualice los productos de PCR mediante la realización de un gel de PAGE al 5 % con urea y luego escanee la pantalla expuesta en un imagenador de fósforo. Cada banda de PCR puede recuperarse del gel disolviendo las tiras de gel en un tubo Eppendorf que contiene 60 microlitros de agua destilada estéril e incubando a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Centrifugue brevemente los productos de gel disueltos a 10,000 RPM durante 10 segundos.Para recopilar todas las muestras. Retire un microlitro para usarlo como molde de ADN para realizar la PCR con la reparación de cebadores. 29 61 46 26.Utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, tras la purificación, se puede realizar un análisis de secuenciación con una herramienta en línea para determinar la ubicación cromosómica. Una vez en el sitio de bioinformática genómica, haga clic en blatt para generar una nueva ventana y pegue la secuencia de ADN. Después de enviar la secuencia de ADN, aparecerán los resultados de la búsqueda BLATT.Haga clic en el navegador sobre el resultado con 100 % de identidad para revelar la ubicación de la secuencia de ADN. La región able one se utilizó como cebo para determinar sus interacciones de ADN a largo alcance. Se seleccionaron dos sitios BGL two y un sitio BAM H one para el ensayo A CT en la segunda ronda del conjunto de cebadores de PCR; el 46 26 29 61 se utilizó para amplificar able M1; el 46 30 29 61 se utilizó para able M two y el 46 36 29 61 se utilizó para able M three.Un patrón típico de gel revela de una a varias bandas, como se muestra aquí para el clon M1 capaz, el clon M2 capaz y el clon M3 capaz. Se muestra la secuencia de ADN del clon M1 capaz para demostrar que cada fragmento proveniente de un ensayo A CT consta de dos segmentos de ADN combinados. Un segmento se deriva de la región de ADN cebo, mientras que el segundo segmento proviene del compañero asociado.Los segmentos se unen entre sí mediante la primera secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. La secuencia de reconocimiento de la segunda enzima aparecerá al final de la secuencia del compañero asociado. El fragmento M1 clonable contiene ADN de la región de ABLE uno localizada en el cromosoma nueve Q 32.4, y el compañero asociado se encuentra en el cromosoma tres P tres, que fue identificado como proc dos.De manera similar, la proteína asociada M dos se localizó en el cromosoma cinco Q 21.1, mientras que el clon M tres se identificó como una asociación intracromosómica cerca del locus ABLE uno, en contraste con los ensayos 3C. La metodología descrita en este video permitirá seleccionar las interacciones de largo alcance más prevalentes. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR, es posible identificar también asociaciones adicionales menos frecuentes utilizando la región de impronta y control o ICR en el locus IGF two H 19 como ADN cebo en células de fibroblastos de ratón; se aplicaron diferentes programas de ciclado en la primera y segunda ronda de PCR en el ensayo A CT.El ensayo A CT también puede utilizarse para identificar diferencias en la arquitectura nuclear e interacciones de largo alcance entre células normales y células cancerosas. Se homogenizaron tejido colon normal y tejido de cáncer de colon, y se realizó el ensayo A CT siguiendo los procedimientos descritos aquí. Se muestra aquí la estructura del ADN de la región ICR en el locus IGF two H 19 y el gen IGF two dpn.Dos sitios para el ensayo A CT están etiquetados; los cebadores utilizados en la PCR de segundo ciclo están marcados con flechas y números en diferentes colores. El patrón del gel del ensayo A CT representa los resultados de la PCR utilizando el cebador 29 61 junto con cada uno de los pares de cebadores 41, 61, 41 63, 51 45 y 51 51. Las bandas únicas que aparecen solo en tejido normal del colon están marcadas con flechas amarillas, y aquellas bandas que aparecieron únicamente en tejido de cáncer de colon están indicadas con flechas rojas tras su desarrollo.Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología de mercado exploren la arquitectura nuclear y la regulación génica de manera tridimensional.

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Investigación

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Biología

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