Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

El objetivo general del siguiente experimento es descubrir e identificar socios de ADN asociados de largo alcance. Esto se logra mediante la fijación, la lisis celular y la digestión del ADN por la primera enzima de restricción, seguida de la ligadura para crear un ADN quimérico compuesto por segmentos de los dos genes asociados. Los siguientes enlazadores se añaden al ADN quimérico después de la segunda digestión de restricción Para facilitar su amplificación, la amplificación por PCR se realiza utilizando cebadores específicos de ADN enlazador y cebo para obtener cantidades suficientes de los fragmentos de ADN asociados Se obtienen resultados que muestran el largo alcance asociado al ADN asociado con el ADN cebo basándose en el análisis de la secuencia de los fragmentos de ADN amplificados.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la captura de confirmación cromosómica o la tres C, es que A-C-T-S-A se puede utilizar para identificar a un socio de ADN asociado desconocido de largo alcance de manera efectiva. Mientras que tres C surgieron para la verificación de interacciones previamente sospechadas. Para comenzar este protocolo de cultivo, las células humanas en una incubadora reciben un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados hasta que tienen un 80 a 90% de confluente.

Para esta demostración se utilizan células de leucemia ácida de graduación humanas. Recoja las celdas vertiéndolas en un tubo NOC de 50 mililitros y centrifugue a 1200 RPM durante 15 minutos. Después de la centrifugación, retire el medio por aspiración.

Agregue cinco mililitros de medio de cultivo para resuspender los gránulos de celdas. Después de contar las células con un hemocitómetro, tome aproximadamente una vez 10 a la séptima celdas a un volumen de 40 mililitros con RPMI 1640, medio que contiene 10% de FBS. A continuación, añade 1,7 mililitros de formaldehído al 37% para fijar la cromatina diluida.

Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos agitando suavemente. Después de la incubación, apague la reacción con 2,4 mililitros de glicina dos molares. A continuación, centrifuga la muestra durante 15 minutos a 1200 RPM y cuatro grados centígrados.

Después de eliminar la supernatina, lavar el pellet una vez con 40 mililitros de PBS helado y luego centrifugar la muestra para recuperar el pellet de celda lavada, resuspender el pellet resultante en 40 mililitros de tampón de lisis helada con inhibidores de proteasa recién añadidos y PMSF 0,1 milimolares, incubar la muestra en una cámara fría con rotación durante 90 minutos. Finalmente, centrifugar la muestra a 2.500 RPM durante 15 minutos y eliminar la super natina y obtener los núcleos aislados. Vuelva a suspender los núcleos en 0,5 mililitros de un tampón XNEB tres y agregue 15 microlitros de 10%SDS.

Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante una hora agitando. Luego agregue 45 microlitros de Triton X 100 al 20% para secuestrar la SDS y vuelva a incubar a 37 grados centígrados durante una hora con agitación y alícuota de uno por 10 al sexto. Los núcleos, o alrededor de 15 microgramos, se utilizan para la digestión enzimática de restricción a 55 microlitros de solución de núcleos.

Agregue 433 microlitros de un tampón XNEB tres y 12 microlitros de BGL dos. Para hacer un volumen total de reacción de digestión de 500 litros, incube la reacción a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente inactivar la enzima de restricción añadiendo 95 microlitros de 10%SDS y desnaturalizar la enzima calentándola a 65 grados centígrados durante 20 minutos.

Al baño maría, añadir siete mililitros de un tampón de ligadura x y 360 microlitros de Triton X 100 al 20%. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante una hora. Baja la temperatura a 16 grados centígrados y añade 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.

T cuatro ADN ligasa. Deje que la reacción de ligadura se incube a 16 grados centígrados durante cuatro horas y luego a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez completada la ligadura, agregue 300 microgramos de proteinasa K e incube a 65 grados centígrados durante la noche.

A continuación, añadir cinco microgramos de ARN e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Purifique el ADN por extracción de fenol cloroformo y precipite el ADN en isopropanol, disuelva el ADN precipitado en 150 microlitros de agua destilada estéril. Para agregar enlazadores al ADN quimérico, primero digiera el ADN incubando dos microgramos de ADN purificado con cinco unidades de msp, uno a 37 grados Celsius durante cuatro a seis horas después de la digestión, inactive MSP uno a 65 grados Celsius durante 10 minutos.

Luego precipite el ADN en etanol con un microlitro de cinco miligramos por mililitro. El glucógeno disuelve el paladar de ADN resultante en 50 microlitros de agua destilada estéril. A continuación, mezcle 50 microlitros de MSP, un ADN tratado con dos microlitros de un oligonucleótido enlazador L de 20 micromolares y un microlitro de un oligonucleótido S de 20 micromolares, luego agregue un microlitro de agua destilada estéril y seis microlitros de tampón de ligasa de ADN 10 XT cuatro XT.

Cubre la mezcla con cera líquida. Desnaturalice los oligonucleótidos a 50 grados centígrados durante un minuto y deje que se enfríen gradualmente hasta 10 grados centígrados en un gradiente de 0,5 grados centígrados por minuto. Usando un termociclador, agregue un microlitro de 400 unidades por microlitro T cuatro ligasa de ADN e incube la reacción a 15 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, purifique el ADN ligado enlazador utilizando un kit de purificación de PCR rápida kaya y eluya en 50 microlitros de agua destilada estéril. Eligen un cebador para la región específica del ADN que se va a investigar para las interacciones de largo alcance. En este ejemplo, Abel se utilizará como cebador o cebo.

Prepare el ADN purificado para la primera ronda de PCR combinando un microlitro del ADN purificado con un microlitro de 20 micromolares aptos para un cebador específico, 46 56, y un microlitro de cebador específico de 20 micromolares 29 63. A continuación, añadir tres microlitros de tres x ClinTech, ADN polimerasa un cóctel que ha sido previamente mezclado con 32 P-D-C-T-P según el protocolo escrito, seguido de tres microlitros de agua destilada estéril. Realice la amplificación de PCR utilizando el ciclo térmico de PCR de inicio en caliente descrito en el protocolo escrito una vez completado el ciclo de PCR.

Purifique los productos de PCR de primera ronda utilizando un kit de purificación de PCR rápida kaya Elute en 30 microlitros de agua destilada estéril. Utilice un microlitro del primer producto de PCR diluido 100 veces para realizar una segunda ronda de PCR utilizando cebadores anidados añadiendo un microlitro de 20 micromolares aptos para un cebador específico, 46 26, y un microlitro de cebador específico del enlazador de 20 micromolares. 29 61.

De nuevo, añade tres microlitros de tres x ClinTech, ADN polimerasa, un cóctel y tres microlitros de agua destilada estéril. Ejecute la segunda ronda de PCR utilizando un programa de ciclo térmico de 25 ciclos de 95 grados Celsius durante 20 segundos. 67 grados Celsius durante 40 segundos y 72 grados Celsius durante un minuto, seguido de una extensión a 72 grados Celsius durante cinco minutos.

Visualice los productos de PCR ejecutando un gel de página de urea al 5 % y, a continuación, escaneando la pantalla expuesta en un generador de imágenes de fósforo. Cada banda de PCR se puede reciclar del gel disolviendo las tiras de gel en un tubo de einor que contiene 60 microlitros de agua destilada estéril e incubando a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Centrífuga. El gel disuelto se produce brevemente a 10.000 rpm durante 10 segundos.

Para recoger todas las muestras. Retire un microlitro para usarlo como molde de ADN para realizar la PCR con la reparación principal. 29 61 46 26.

Utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, después de la purificación y la secuenciación, el análisis se puede realizar con una herramienta en línea para determinar la ubicación cromosómica. Una vez en el sitio de bioinformática del genoma, haga clic en blatt para generar una nueva ventana y pegar la secuencia de ADN. Después de enviar la secuencia de ADN, aparecerán los resultados de la búsqueda BLATT.

Haga clic en el navegador en el resultado con 100%identity para revelar la ubicación de la secuencia de ADN. La región capaz se utilizó como cebo para determinar sus interacciones de ADN de largo alcance. Se eligieron dos sitios BGL dos y un BAM H, un sitio para el ensayo A CT en la segunda ronda del conjunto de cebadores PCR, 46 26 29 61 se utilizó para amplificar el M1 capaz, 46,30 29 61 se utilizaron para M dos y 46, 36 29 61 para M tres capaz.

Un patrón de gel típico revela de una a varias bandas, como se muestra aquí para M1 capaz, M dos y M tres capaz. Se muestra que la secuencia de ADN de M1 clonable demuestra que cada fragmento de un ensayo de TC A consta de dos segmentos de ADN combinados. Un segmento se deriva de la región de ADN del cebo, mientras que el segundo segmento proviene de la pareja asociada.

Los segmentos se unen entre sí mediante la primera secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción. La segunda secuencia de reconocimiento de enzimas aparecerá al final de la secuencia de socios asociada. El fragmento M1 clonado contiene ADN de la región de ABLE uno ubicada en el cromosoma nueve Q 32.4, y la pareja asociada se encuentra en el cromosoma tres P tres, que se identificó como proc dos.

De manera similar, la pareja asociada a M dos se localizó en el cromosoma cinco Q 21.1, mientras que el clon M tres capaz se identificó como una asociación intracromosómica cerca del locus ABLE uno en contraste con los ensayos de tres C. La metodología descrita en este video seleccionará las interacciones de largo alcance más frecuentes. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR R, es posible identificar asociaciones adicionales menos frecuentes, así como el uso de la región de impronta y control o ICR en el IGF dos locus H 19 como cebo en células de fibroblasto de ratón, se aplicaron diferentes programas de ciclo en la primera y segunda rondas de PCR en el ensayo A CT.

El ensayo de TC A también se puede utilizar para identificar diferencias en la arquitectura nuclear y las interacciones a largo plazo entre las células normales y las células cancerosas. Se homogeneizó el tejido normal de colon y el tejido de cáncer de colon y se realizó el ensayo de TC A siguiendo los procedimientos aquí descritos. Aquí se muestra la estructura del ADN de la región ICR en el IGF dos locus H 19 y el IGF dos genes dpn.

Dos sitios para el ensayo A CT están marcados, los cebadores utilizados en la segunda ronda de PCR están marcados con flechas y números en diferentes colores. El patrón de gel del ensayo A CT representa los resultados de la PCR utilizando el cebador 29 61 con el par de cebadores 41, 61, 41 63, 51 45 y 51 51. Las bandas únicas que aparecen solo en el tejido normal del colon se etiquetan con flechas amarillas, y las bandas que aparecieron solo en el tejido del cáncer de colon se etiquetan con flechas rojas después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de mercado exploren la arquitectura nuclear y la regulación génica de manera tridimensional.