Name: Estudiar la base neural de la conducta adaptativa Locomotor en insectos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a registrar la actividad muscular en insectos atados para estudiar los mecanismos neuronales del comportamiento locomotor adaptativo. Este método utiliza electrodos EMG y superficies deslizantes para analizar la fisiología del control motor.

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Damos las gracias a Michael Dubbert, Hoffmann Oliver, Scharstein Hans, Jan Sydow y Anne Wosnitza por su excelente asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por la DFG conceder Bu 857 / 8,10 a AB

1. La superficie de paso La superficie que camina negro se compone de dos placas de metal de níquel recubierto de forma permanente se unió al lado del otro y eléctricamente aisladas entre sí por una franja de 2 mm de ancho de 2-componente adhesivo epoxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemania) directamente debajo del eje longitudinal del el animal. Que producen una superficie total de 13.5x15.5cm (Figura 1). La separación de los planos medio de las piernas izquierda y derecha permite el control independiente de contacto tarsal de una sola pierna en cada lado. <ol><li> La placa se lubrica con una mezcla de glicerina / agua en una proporción de 95 partes de glicerina a 5 partes de NaCl saturado de solución para transmitir deslizamiento y conductividad eléctrica, la viscosidad es de aproximadamente 430cStokes (Shankar y Kumar, 1994). </li><li> La mezcla se aplica directamente sobre la superficie y se dispersa con un trozo de tejido blando para asegurar un espesor total de 0.1-0.2mm. </li></ol> 2. Configuración de la estimulación óptica <ol><li> Episodios son provocados caminar usando dos proyectores según lo descrito por Scharstein (1989) para proyectar un patrón de rayas en dos rondas, pantallas de cristal esmerilado (diámetro 130 mm, pantallas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemania) que se colocan a una distancia de aprox. 70 mm de los ojos, y en un ángulo de 45 ° en la parte delantera izquierda y derecha de la placa (Fig. 1). La longitud de onda del diseño a rayas se mantiene constante en λ = 21 °. La frecuencia de cambio de los estímulos en movimiento puede variar entre 0,35, 0,72, 1,07 y 1.49Hz. Ya que la reacción de los animales depende sólo de la frecuencia ω contraste / λ (ω = velocidad angular, λ = longitud de onda patrón) si el patrón de cambio es lo suficientemente alta (Fermi y Reichhardt, 1963), que no varió a lo largo de los experimentos λ . La luminancia de las rayas brillantes en la parte del animal es de aproximadamente 15cd/m2 y el contraste 0,8. El ojo compuesto de los insectos palo (Carausio morosus) tiene 24 omatidios en el eje dorso-ventral (Friza, 1928) y algunos más en el eje rostro-caudal. A medida que el ángulo de divergencia del ojo de un insecto palo es en promedio de 6,2 ° (Jander y Volk Henrichs, 1970) nuestra longitud de onda patrón fue de aproximadamente 4 veces el ángulo de la omatidios. Los experimentos se configuran en una jaula de Faraday oscuro y se realizó en un cuarto oscuro a 20-22 ° C. </li><li> Caminar hacia adelante es inducida por un patrón progresivo en ambas pantallas, donde las rayas en cada pantalla se mueven hacia el exterior, o de un solo rayo negro sobre fondo blanco situado entre las pantallas </li><li> De giro es inducida por las rayas en movimiento en la misma dirección en ambas pantallas. No hemos encontrado una correlación entre la velocidad de las bandas en movimiento y el ángulo de la curva. Una vez que la luminancia del patrón de rayas se fija para inducir a caminar, por lo general no se precisa ningún ajuste adicional, pero se puede ajustar para diferentes animales, según las necesidades de la tensión de las lámparas de halógeno de los proyectores. </li></ol> 3. Preparación de los animales de experimentación <ol><li> Mujer insectos palo adulto (Carausio morosus) se pegan (cemento dental, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Alemania) con la parte ventral hacia abajo sobre una delgada vara de balsa (3x5x100mm, WxHxL), que se inserta en un tubo de latón que tiene varios conectores. El animal se lleva a cabo durante aproximadamente un minuto hasta que la cola es por lo menos parcialmente endurecidos. </li><li> La cabeza y las piernas sobresalen de la parte frontal y lateral de la varilla para permitir su libre circulación. El área de las coxas de todas las piernas, así como la mayor parte del abdomen tiene que ser dejado libre de pegamento. </li><li> Cabeza de insecto, el tórax y los extremos distales de cada fémur y la tibia están marcados con pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemania) se mezcla con cemento dental para el seguimiento de video más tarde. </li></ol> 4. La colocación de electrodos EMG La actividad muscular de los músculos de la pierna diferente, como en este ejemplo, el transportador de ángulos y músculos retractores coxas, que se encuentran en el tórax y la prolongación causa (movimiento hacia adelante) y retracción (movimiento hacia atrás) de la pierna, se registra por medio de electrodos de EMG implantado en el tórax. Todos los registros de EMG son diferencialmente amplificadas. La señal fue amplificada 100 veces en un pre-amplificador (electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia), la banda de filtrado paso-, (100Hz-2000Hz), amplificada (10x), e importados a través de un convertidor AD en Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Los electrodos están hechos de cables de cobre recubiertos (ELEKTRISOLA, Eckernhagen, Alemania; diámetro exterior 47μm). Para uno de los electrodos, dos cables son los primeros untado con pegamento, entonces, los dos hilos pegajosos están trenzados uno alrededor del otro </li><li> En un extremo de los extremos de hilos trenzados se sueldan a un mini-plug. En el otro extremo de los cables se cortan los extremos para proporcionar limpio sin aislamiento para la inserción en el animal. </li><li> Los electrodos de EMG son Plugged en el conector pequeño en el extremo del tubo de latón. </li><li> Un pin minuten se usa para perforar orificios en la cutícula </li><li> Los extremos cortados de los electrodos se separan y se inserta en un músculo de aproximadamente 1 mm de distancia el uno del otro, que, en nuestra experiencia, da una buena señal-ruido. Se debe tener cuidado de no introducir los electrodos demasiado profunda en el músculo con el fin de evitar su daño. La figura 2 muestra la ubicación de los electrodos en el tórax del animal. La Figura 3 muestra un animal con los cables de electrodos en su lugar. </li><li> Nosotros usamos una pequeña gota de pegamento histoacrylic (3M Vetbond, San Pablo, MN, EE.UU.) para mantener los cables en su lugar. </li><li> Un cable de tierra se introduce en el abdomen. </li></ol> 5. Grabación del contacto del tarso Contacto del tarso se registra siempre en conjunto con los rastros de EMG. Puesto que la superficie resbaladiza se divide en dos mitades, un máximo de dos contactos del tarso contralateral pueden ser registrados en el mismo tiempo. Para ello, la pierna se utiliza como un "interruptor" para cerrar un circuito entre la placa y el amplificador. La corriente puede ser aplicada a las placas por separado a través de dos tomas de corriente en la base de cada plato. Podemos generar dos señales de onda cuadrada con 2-4mV amplitudes con un generador de pulsos (modelo MS501, electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia) que son de fase retrasada en 90 °. Las señales son atenuadas por 60dB (/ 1000) y aplicado a las dos mitades de la superficie resbaladiza. En este experimento se usan sólo una de las dos señales. Es a la vez alimenta a un lock-in-amplificador como una señal de referencia. El lock-in amplificador de dos fases (la electrónica del taller, Instituto Zoológico, Colonia) de forma selectiva sólo amplifica las señales de la misma frecuencia y fase que la señal de referencia siempre. Un segundo canal sólo detecta la señal · Fase 90 retraso. Las señales de ruido en las frecuencias que no sean la referencia de frecuencia son rechazados y no afectan la medición. La señal de salida del amplificador se alimenta a un convertidor AD (1401k Micro II, CED, Cambridge, Reino Unido) y Spike2 digitalizadas utilizando. Entre la toma de contacto y de elevación inicial del tarso en y desde la superficie resbaladiza, la corriente fluye a través de la placa tarso y la tibia en el alambre de cobre (ver a continuación: 5.3 a 5.8). El amplificador elegido tiene una alta resistencia de entrada (1MΩ) y el voltaje de la señal es muy pequeña con el fin de no afectar el comportamiento de caminar del animal. La corriente que circula por el tarso y la tibia es de entre 2 y 4NA. El plazo de entrega de señal durante la toma de contacto, entre la entrada en el lubricante y el contacto con la superficie es menor que 1 ms. La transición de la señal de contacto durante el despegue es menos pronunciada y más retraso. Esto se debe a la ruptura tardía del lubricante del tarso por un efecto de capilaridad y debido al movimiento de la pierna, sin completar el despegue en la fase de impulsión. <ol><li> El tubo de latón con el palo de balsa a la que se pega el animal se introduce en un micromanipulador para permitir el ajuste de altura del animal a entre 7 y 12 mm por encima de la superficie resbaladiza, lo que corresponde a la altura durante la marcha libre. </li><li> A fin de medir el flujo de corriente cuando el tarso del insecto de la pierna se supervisa en el suelo, un cable (47μm de diámetro) se corta en trozos de aproximadamente 15 cm de largo. </li><li> El aislamiento de una de cobre se elimina por la quema de la basura con el alcohol. </li><li> Un bucle se forma con un extremo del cable y se deslizó sobre el tarso de los animales </li><li> El lazo se ata en el extremo distal de la tibia de un buen contacto entre el animal y el alambre. </li><li> El cable se fija en el tórax del animal con una gota de pegamento de dos componentes (ProTempII, véase más arriba), y se conecta al amplificador diferencial a través de una pinza de cocodrilo. </li><li> Para mejorar la conductividad del cable en sus extremos, una gota de crema de electrodo se aplica (Marquette Hellige, Freiburg, Alemania) en las áreas de contacto. </li><li> La intensidad de la señal y luego se examina en el monitor. Debido a las propiedades del filtro de paso bajo del lock-in-amplificador (10 ms de tiempo constante) y la lift-off/touch-down gradual del tarso, la señal no es una señal cuadrada exacta. Uno tiene que fijar umbrales adecuados cerca del punto de transición para determinar el momento exacto del contacto del tarso y comprobar manualmente cada caso determinado por el software de digitalización. Con base en el contacto del tarso, que define el momento en el tarso de una pierna que se dio fue en el suelo como la posición y el momento en que estaba en el aire como la fase de impulsión. </li><li> La señal de disparo de la cámara se graba al mismo tiempo con el seguimiento de EMG y la señal de contacto del tarso, y permite un marco preciso de correlación del marco de la conducta y las huellas registradas. </li></ol> 6. Grabación óptica del movimiento de las piernas para el Análisis Digital La frecuencia de intensificación de los insectos palo en superficies resbaladizas puede alcanzar los 3-4 Hz (Graham y Cruse, 1981). <ol><li>Antes de grabar secuencias de a pie, se coloca un espejo en un ángulo de 45 ° detrás del animal para tener un monitor adicional visual para la toma de contacto. La cámara se activa el exterior y las imágenes se introducen en un PC a través de una interfaz FireWire. </li><li> Grabamos caminar secuencias de arriba con una cámara de video de alta velocidad (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemania) a 100fps para analizar los movimientos de las piernas de forma digital, y se correlacionan con la actividad de EMG y el contacto del tarso. </li><li> Durante la grabación de las secuencias de a pie, el animal se ilumina con azul matrices de LED (30-50V DC, 24cd luminancia, Electrónica Taller, Instituto de Zoología de la Universidad de Colonia), que se ajustan en la intensidad para iluminar los marcadores fluorescentes. De acuerdo con la literatura (Schlegtendal, 1934), los insectos palo no poseen visión en color y no hemos observado un efecto adverso de la iluminación de la luz ultravioleta sobre la respuesta de inflexión. Un filtro amarillo en el frontal de la lente de la cámara suprime la corta longitud de onda de la luz de activación y da un mayor contraste para las grabaciones de vídeo. </li><li> Los archivos de video pueden ser analizadas utilizando software de seguimiento de movimiento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak servicio, Berlín, Alemania). </li></ol> 7. Grabación de las secuencias de Ruta <ol><li> Como control, en primer lugar una secuencia de a pie con un animal intacto se registra. </li><li> La velocidad del patrón de rayas está establecido, y el patrón y la grabación de vídeo se inicia aproximadamente al mismo tiempo. </li><li> Si el animal no se inicia la locomoción espontánea, puede ser estimulado en el abdomen con un cepillo (Bassler y Wegener, 1983), o por un soplo de aire a las antenas. En este caso, los animales tocado en el lado izquierdo del abdomen tienden a girar a la izquierda y viceversa. El patrón de rayas es mantenerse en movimiento hasta que el animal deja de caminar o hasta que al cabo de 3 minutos de grabación continua. </li><li> Con el fin de probar hasta qué punto la actividad muscular en una pierna depende de la información sensorial de las piernas de vecinos, el animal es inducido a autotomize sus piernas. El sitio de autotomía se cierra de forma natural en cuestión de segundos. Un ejemplo de un animal con el frente y las patas traseras autotomized se muestra en la Figura 3. </li><li> Por ejemplo, para los experimentos con animales que tienen una sola pierna medio, nos induce autotomía de las patas a favor y en metathoracic apretando el fémur proximal con un par de pinzas (Schmidt y Grund, 2003) o cortar las piernas a nivel de las coxas después de la grabación de los animales intactos. Después de que un mínimo de 30 minutos de tiempo de recuperación se da a los animales. </li><li> Luego grabamos nuevas secuencias de caminar como antes. En los preparativos reducida, a menudo la necesidad de inducir a pie con trazos de pintura del pincel. </li></ol> 8. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Montaje experimental; A:. Fotografía de un insecto palo atado por encima de la superficie resbaladiza, marcado con pigmentos fluorescentes para el seguimiento de la pierna y por cable para la grabación de EMG y medición sin contacto del tarso. B: diagrama de cableado para la grabación de doble contacto tarsal pierna al caminar sobre la superficie resbaladiza. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posiciones para la colocación de los electrodos de EMG en los músculos transportador y el retractor en el tórax de la pierna palo medio de insectos. ML: pierna medio, FL: frente a la pierna <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 insecto palo con alambres de EMG en los músculos a favor y retractor de la pierna media en el lugar, las patas delanteras y traseras se han quitado para estudiar el efecto de la presencia de las piernas de vecinos de la cinemática y la actividad muscular de las piernas en el medio la preparación reducido. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rastro Ejemplo de retractor actividad EMG con señal de referencia de contacto tarsal en una pierna dentro de media durante el giro. En el inicio de la traza (caja azul primero) el retractor está activo durante el apoyo, mientras que la pierna tiene contacto con el suelo ("circuito cerrado"), lo que indica que el partido de ida hace hacia delante pasos, después de un cambio a corto (caja azul segundo), la retractor está activo durante el swing, mientras que la pierna está en el aire ("circuito abierto", tercera caja azul), que muestra la existencia de pasos hacia atrás indica. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Captura de pantalla de una grabación del transportador (trazo superior) y el retractor (en el centro de seguimiento) los músculos y al mismo tiempo la huella grabada en contacto tarsal (traza inferior). Tenga en cuenta la actividad alterna en las huellas de EMG, que corresponde a la actividad de los dos músculos en el ciclo de paso, que es la actividad de un transportador justo antes y duranteswing, cuando la huella de contacto del tarso señales de pérdida de contacto con el suelo, y la actividad retractor durante y después de la toma de contacto del tarso, cuando la pierna está en posición. El inserto muestra el archivo de vídeo juego correspondiente a esta grabación que se utiliza para verificar el comportamiento del animal.

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<li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Mathematical+and+Physical+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 Forthcoming.</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 Forthcoming.</li>
<li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth%2C+Agrius+convolvuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li>
</ol>

Hemos descrito una configuración que permite la generación inducida ópticamente de convertir a la conducta y permite en gran medida de la disociación de la actividad neuronal generada a pie de los efectos pasivos causados ​​por el desplazamiento mecánico de las demás partes a pie en el suelo. Flujo de información de potencial entre las piernas a través del sistema nervioso por las fuerzas de reacción del suelo o el contacto del tarso, por otro lado, todavía es posible y permite que el investigador para estudiar la influencia de dicha información en la preparación reducido. Las principales ventajas de la configuración de la superficie resbaladiza incluyen que los animales muestran una tendencia muy alta a caminar, y contrariamente a caminar o pisar una treadwheel, el animal puede realizar movimientos de balanceo y la fase de apoyo en todas las direcciones de andar natural. Además, los grados de libertad para todas las piernas que el animal pueda realizar la curva de caminar si se trata de una preparación intacta o semi-intacta. Porque las piernas no se puede mueve en forma pasiva por el simple movimiento hacia delante del animal o el movimiento del sustrato por debajo, cada movimiento refleja la potencia del motor de la pierna (Cruse, 1976; Graham y Wendler, 1981). La configuración es muy adecuado para investigar las bases neuronales de los comportamientos de adaptación, tales como dar vuelta o hacia adelante frente a caminar hacia atrás, porque se puede combinar registros electrofisiológicos de la actividad motora con el análisis de la cinemática de movimiento de las extremidades. Hemos utilizado la respuesta optomotor el insecto palo para sacar a caminar. Las respuestas de los animales al patrón de la raya de rotación se muestran dispuestos a realizar la curva de pie, mientras que atados por la superficie resbaladiza. Lo más sorprendente para nosotros, solo las piernas en una sola pierna preparados cualitativamente muestran el mismo patrón en movimiento como en el animal intacto. Así pues, tenemos razones para creer que el control de la curva de caminar puede funcionar en gran parte sin la coordinación de la información sensorial de las piernas de vecinos. Será importante para poner a prueba en los experimentos, además, si la actividad de las neuronas motoras de las piernas se elimina también influenciados por el patrón optomotor. La configuración se puede modificar fácilmente para permitir el estudio de otras tareas, como hacia adelante y caminar hacia atrás, colocando una sola raya en la parte delantera del animal o tirando suavemente de las antenas. La medición precisa del contacto con el suelo nos permite relacionar la actividad muscular y la posición de las piernas. La alta resolución temporal de esta señal de contacto eléctrico es mejor que 1 ms y nos lleva a una nueva visión sobre el momento en que el cambio de giro a la fase de apoyo. La resolución es peor para la posición de giro de transición debido a la demora en la corte de la realización de lubricante y la falta de necesidad de completar el despegue durante la prolongación de la superficie resbaladiza. Sin embargo, el conocimiento en el columpio precisa para la transición postura es un primer paso muy útil si queremos entender los mecanismos que controlan el tiempo los músculos y las actividades coordinadas de músculos de las piernas en diferentes contextos de comportamiento (ver también: Büschges et al, 2008;. Büschges y Gruhn 2008). A modo de ejemplo, se utilizó el retractor y el músculo coxas transportador de la pierna y media, precisamente relacionada su actividad con el cambio de giro a la fase de apoyo, mientras que al mismo tiempo controlar el contexto del comportamiento en el que se utilizó la pierna. Para ello, nos induce a pie y registraron la actividad muscular continua. Una pierna dado puede ser un interior o una pierna fuera, dependiendo del sentido de giro. En el partido de medio paso a paso, actuando como una pierna interior en el sentido funcional, se puede observar que los músculos retractores y transportador puede trabajar tanto como los músculos de la posición funcional, porque la pierna de forma intermitente produce retrocesos, además de un paso adelante dirigido (ver Fig. 4 ). El electromiograma (EMG) de los músculos se rectificaron y normalizado a la hora de la toma de contacto y la latencia de los picos de los músculos primero se calculó. Curiosamente, las latencias de ambos músculos en lo que respecta a depender del despegue y aterrice sobre la función del músculo como el swing o postura respectivos muscular (ver Fig. 4) y no en el propio músculo, y sólo muestran pequeñas alteraciones en la momento de inicio de actividad. La mayoría de las explicaciones para el cambio de estado de giro a la postura de asumir que las señales sensoriales de disparo de contacto tarsal del inicio de la postura. La pregunta interesante de cómo las latencias cortas entre la toma de contacto y la activación muscular en el insecto palo se produjo y en qué la información sensorial que dependen ahora se pueden abordar con la configuración modificada. En resumen, se muestra una configuración de superficie deslizante que nos permite obtener de forma fiable caminar en línea recta y la curva de los insectos palo parado. Cinemática, la actividad muscular y el tiempo de contacto del tarso hacia abajo y el despegue puede ser monitoreada y correlación en los dos diferentes de comportamiento contexts al mismo tiempo. Esto nos da una excelente herramienta para estudiar la relación detallada entre la actividad muscular y el contexto del comportamiento de una sola pierna, así como en el animal intacto y los mecanismos subyacentes.

<table><tbody><tr><td>Adhesivo epoxi de 2 componentes</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de vidrio (diámetro 130 mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Alemania</td><td>3M Id: 70-2011-0358-0 Número de catálogo: 46430</td><td>Disponible a través de 3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) o proveedores dentales</td></tr><tr><td>Pigmentos fluorescentes</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Alemania</td><td>N.º de cat.: por ejemplo, 56200 Pigmento Fluorescente Amarillo Dorado, 56350 Pigmento Fluorescente Rojo Llama</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; o &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Adhesivo histoacrílico</td><td>3M</td><td></td><td>proveedor: WPI</td></tr><tr><td>Hilo de cobre recubierto</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cremas para electrodos</td><td>Marquette Hellige, Friburgo, Alemania</td><td></td><td>El producto ya no está disponible; sugerimos, por ejemplo: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Generador de pulsos</td><td>Modelo MS501, taller de electrónica, Instituto de Zoología, Colonia, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueo</td><td>Instituto de Zoología</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Convertidor AD</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplificador</td><td>Instituto de Zoología</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de video de alta velocidad</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrices de LED UV</td><td>Instituto de Zoología</td><td></td><td>30-50 V CC, taller de electrónica&lt;br/&gt;
&amp;#955;390-395 nm&lt;br/&gt;Luminancia 24 cd</td></tr><tr><td>Software digitalizador Spike2</td><td>Ver. 5.05, CED, Cambridge, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de seguimiento de movimiento</td><td>Servicio Mikromak, Berlín, Alemania</td><td>WINanalyze, Ver. 1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

estudiar la base neural de la conducta adaptativa locomotor en insectos

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Estudiar la base neural de la conducta a pie, a menudo se enfrenta con el problema que es difícil separar la salida neuronal producido la intensificación de los movimientos de las piernas que el resultado de fuerzas pasivas y las interacciones con otras piernas a través del contacto frecuente con el sustrato. Si queremos entender, que parte de un movimiento dado se produce por la salida del sistema nervioso motor, el análisis cinemático de los movimientos paso a paso, por lo tanto, debe ser complementado con registros electrofisiológicos de la actividad motora. El registro de actividad neuronal o muscular en un animal de comportamiento es a menudo limitada por el equipo electrofisiológicos que pueden limitar el animal en su capacidad para moverse con tantos grados de libertad como sea posible. Esto puede ser evitado mediante el uso de electrodos implantables y luego tener el movimiento de animales en una correa larga (es decir, Clarac et al, 1987;. Duch y Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn y Rathmayer, 2002) o mediante la transmisión de los datos utilizando dispositivos de telemetría (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Ambos métodos elegante, que se utilizan con éxito en las grandes artrópodos, a menudo resultan difíciles de aplicar en los insectos más pequeños que, o bien caminar con facilidad se enredan en la cuerda larga o se ven obstaculizados por el peso del dispositivo telemétrico y sus baterías. Además, en todos estos casos, todavía es imposible distinguir entre la base puramente neuronal de la locomoción y los efectos ejercidos por acoplamiento mecánico entre las piernas caminando a través del sustrato. Una solución para este problema es llevar a cabo los experimentos en un animal atado que es libre para caminar en su lugar y que se suspendió a nivel local, por ejemplo, sobre una superficie resbaladiza, lo que elimina de forma efectiva la mecánica de contacto más baja. Esto ha sido utilizado para estudiar las respuestas de escape (Camhi y Nolen, 1981; Camhi y Levy, 1988), giro (Tryba y Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), caminando hacia atrás (Graham y Epstein, 1985) o cambios en la velocidad (Gruhn et al., 2009b) y permite que el experimentador fácil de combinar intra y extracelular fisiología con el análisis cinemático (Gruhn et al., 2006). Nosotros utilizamos una configuración de superficies resbaladizas para investigar el tiempo de músculos de las piernas en el insecto palo comportarse con respecto a la toma de contacto y de elevación inicial bajo diferentes paradigmas de comportamiento, tales como caminar en línea recta hacia adelante y curvas en los preparativos intacta y reducida.

Se describe un método para registrar la actividad motora, programada para la señal de contacto eléctrico registrado en el tarso un insecto atado, caminar sobre una superficie resbaladiza. Esto se utiliza para estudiar la base neural de la conducta adaptativa bajo la influencia de la reducción de la interacción mecánica entre las piernas a través del sustrato.

Estudiar la base neural de la conducta adaptativa Locomotor en insectos

Al estudiar la base neural del comportamiento de la marcha, a menudo surge el problema de que es difícil separar la salida de pasos producida neuronalmente de aquellas...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la fisiología muscular de las patas, así como su temporización y cinemática en un insecto atado durante diferentes situaciones de caminata. Se utiliza el insecto palo raus miosis para este estudio porque, por ser un insecto, es relativamente grande y presenta ganglios segmentarios claramente separados.Primero, se sujeta al animal y se etiqueta para el seguimiento mediante video fluorescente. A continuación, se colocan electrodos EMG en los músculos protractores y retractores. Luego, se procede con la preparación del insecto sujeto para la grabación del contacto tarsal sobre una superficie resbaladiza.El paso final del procedimiento consiste en la grabación simultánea de la actividad muscular de las patas y el contacto tarsal durante diferentes situaciones de caminata. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran alteraciones en el momento de activación muscular. Dependiendo del contexto conductual, una pata se utiliza en la principal ventaja de este método frente a técnicas existentes como el estudio.Caminar sobre bolas de senderismo elimina el acoplamiento mecánico a través del suelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el control motor, como cuánto contribuye una sola pata a la marcha en un animal con patas motoras. Las implicaciones de esta técnica abren el campo del comportamiento locomotor adaptativo, ya que ahora podemos estudiar los cambios en la velocidad de marcha y en la dirección de la marcha a nivel de una sola pata, demostrando que el montaje será útil.Peter Boha, un técnico en mi laboratorio, dos placas de latón recubiertas de níquel firmemente unidas y aisladas entre sí mediante una tira de dos milímetros de ancho de epoxi de dos componentes. Se utiliza para preparar la superficie resbaladiza por la que caminará el animal; lubrique cada mitad de la placa por separado con una mezcla conductora eléctricamente de glicerina y solución salina, usando un trozo de tejido suave. Cuando se aplica correctamente, la solución debe tener un espesor entre 0,1 y 0,2 milímetros y crear una viscosidad cinemática superficial de aproximadamente 430 centistokes.Dos pantallas circulares de vidrio esmerilado se colocan frente a la placa de manera que, durante un experimento, queden a 70 milímetros de los ojos del animal. Cuando se proyecta un patrón de rayas en movimiento sobre estas pantallas, el animal comenzará a caminar hacia adelante. La marcha se induce mediante un patrón progresivo en ambas pantallas con rayas que se desplazan hacia fuera, o mediante un único haz negro sobre fondo blanco colocado entre las pantallas, lo cual puede provocar secuencias de caminata recta más prolongadas.Si ambos patrones de franjas progresivas que se mueven en la misma dirección inducen giro. Una vez que se ha montado el dispositivo experimental, el animal puede prepararse para un experimento utilizando cemento dental para sujetar, con un insecto palo hembra adulto colocado con el lado ventral hacia abajo sobre un delgado palillo, que está unido a un tubo de latón con una base. La cabeza y las patas sobresalen por delante y a los lados del palillo para permitir su movimiento libre.A continuación, se utilizan pigmentos fluorescentes mezclados con cemento dental para marcar la cabeza, el tórax y el fémur distal y la tibia de cada pata para el seguimiento mediante video posterior. La actividad muscular del animal se registra por medio de electrodos de EMG implantados en el tórax.La señal se amplifica 100 veces en un preamplificador y luego se amplifica 10 veces y se filtra entre 100 hercios y 2000 hercios antes de convertirla en una señal digital. Los electrodos están hechos de dos alambres de cobre recubiertos untados con pegamento, luego torcidos entre sí, se suelda un extremo del alambre trenzado a un conector mini plug y se corta el otro extremo utilizando una punzón de alfiler pequeño para hacer agujeros diminutos en la cutícula por donde pasará el electrodo. Para contactar los músculos, coloque el conector mini plug en un extremo del alambre en el zócalo conectado al tubo de latón al que se sujeta el animal.Introduzca el extremo cortado de un electrodo a través del orificio justo debajo de la cutícula y dentro de un músculo, de manera que los dos hilos de cada electrodo queden colocados en orificios separados aproximadamente un milímetro. Para mantener los hilos en su lugar, utilizamos una pequeña gota de pegamento acrílico histológico. Se inserta un hilo más en el abdomen, que actuará como electrodo de referencia con el fin de comprender la relación entre la cinemática de la marcha del insecto y la fisiología muscular.El contacto del tarso durante la marcha se mide durante la grabación de EMG; queme el aislamiento en el extremo de un trozo de alambre de cobre de 15 centímetros de largo con alcohol para poder medir el flujo de corriente a través del tarso. A continuación, se forma un lazo en un extremo del alambre, se desliza sobre el tarso del animal y se ajusta en el extremo distal de la tibia. Luego, el alambre se fija en el tórax del animal con una gota de cemento dental, y el bolso insertado en el tubo de latón al que se pega el animal se conecta a un micromanipulador.Con el fin de permitir el ajuste de altura del animal entre siete y doce milímetros por encima de la superficie resbaladiza, lo que corresponde a la altura del insecto durante la marcha libre a través de una abrazadera de cocodrilo, el otro extremo del alambre se conecta entonces al amplificador diferencial de detección síncrona. Aplicamos una gota de crema para electrodos en las áreas de contacto para mejorar la conductividad del alambre. En sus extremos, el circuito se completa conectando la placa al amplificador mediante conectores en la base de la placa.Un generador de pulsos crea una señal que se aplica a ambas mitades de la placa a través de estos conectores. Uno de los cables de la placa está conectado al amplificador y se utiliza como señal de referencia. Ahora, con el animal en su lugar y los cables conectados, su pata actúa como un interruptor y una corriente fluirá a través del tarso para cerrar un circuito entre la placa y el amplificador.Esto produce una señal con un tiempo de anticipación inferior a un milisegundo al contacto y una señal retardada al separarse. La intensidad de la señal se prueba moviendo el tarso hacia arriba y hacia abajo. Luego, los cables de EMG se conectan a los amplificadores.La señal de activación para la cámara se registra simultáneamente con el contacto tarsal y el trazado de EMG para permitir la correlación traza por traza. Ahora, puede registrarse una secuencia de caminata con el animal en su lugar y con todo conectado. El patrón visual y la grabación de video se inician simultáneamente para crear una grabación visual del movimiento como control.Utilice una cámara de video de alta velocidad de 100 cuadros por segundo para grabar el movimiento de las patas desde arriba y a través de un espejo colocado en un ángulo de 45 grados detrás del animal. Si el animal no inicia la locomoción espontáneamente, puede estimularse en el abdomen con un pincel o con un soplado en las antenas. El seguimiento de los marcadores fluorescentes en el animal puede mejorarse iluminándolo con una matriz de luces LED azules y colocando un filtro amarillo en el objetivo de la cámara.Esto suprime la longitud de onda corta de la luz de activación y añade contraste al video. Primero registre la secuencia de marcha del animal intacto como control. Cambiar los estímulos visuales modifica la dirección de la locomoción.Si se desea, amputar las patas pellizcando el fémur con un par de pinzas y permitir que el animal se recupere durante 30 minutos. Ahora se puede evaluar el papel fisiológico de las patas faltantes. Los puntos en esta imagen muestran las posiciones de los electrodos en los músculos protractor y retractor de la pata media.En esta preparación de EMG, se han eliminado las patas delanteras y traseras para estudiar el efecto de las patas adyacentes sobre la cinemática y la actividad muscular de las patas medias. Ahora, los datos en este registro de un animal que gira, el trazo superior muestra el registro de contacto tarsal. Mientras que el trazo inferior muestra el EMG del músculo retráctor.Durante los pasos hacia adelante al comienzo del rastro, el retractador está activo durante la fase de apoyo mientras la pata mantiene contacto con el suelo. Tras un breve cambio, la pata realiza pasos hacia atrás y el retractor se activa durante la fase de balanceo, mientras la pata está en el aire. Aquí se muestra una vista completa de todos los datos recopilados mientras el animal camina; en la parte superior se encuentra el registro de EMG del músculo protractor.En el centro se encuentra el trazado de EMG de los músculos retráctores y debajo la señal de contacto tarsal. En el recuadro, puede observarse el movimiento real del animal capturado por la cámara de alta velocidad. La actividad alternante en los trazados de EMG corresponde a la actividad de los dos músculos en el ciclo de pasos.El músculo protractor está activo justo antes y durante la fase de balanceo, y el retráctor está activo después del contacto con el suelo y durante la fase de apoyo. Una vez dominada, la preparación puede realizarse en menos de 90 minutos, y los datos pueden adquirirse durante varias horas tras este procedimiento. Otros métodos, como el análisis cinemático o los registros de una sola célula, pueden realizarse en un animal con comportamiento casi intacto tras su desarrollo.Esta técnica ha ayudado a los investigadores en el campo del control motor a abordar preguntas sobre cómo apéndices individuales generan patrones locomotores flexibles y adaptables.

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