Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de cultivo celular con hidrogeles duales y microestructurado para estudios neuronales. Esto se logra primero sembrando implantes de tejido, como ganglios de la raíz dorsal embrionarios, sobre insertos permeables para cultivo celular. A continuación, se crea un micro patrón en un hidrogel fotoenlazable utilizando un dispositivo microdigital de espejos o DMD como máscara fotodinámica.

A continuación, se añade el hidrogel autoensamblable como Pure, que puede contener una suspensión de células disociadas. Es necesario un tiempo adecuado de incubación antes del análisis celular. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la viabilidad de las células neuronales y el crecimiento de neuritas mediante configuraciones geométricas específicas definidas por la DMD.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que se puede crear, modificar y proyectar rápidamente una masa fotodinámica desde una distancia para adaptarse a casi cualquier sustrato, como insertos permeables para cultivo celular. Aunque este método puede proporcionar información sobre los sistemas neuronales, también puede aplicarse a otros sistemas que se beneficien de restricciones geométricas específicas, como la señalización celular, la migración celular, el contacto célula a célula o la morfogénesis, por mencionar algunos. Las luces UV del tablero DMD y el objetivo de cuatro aumentos están montados verticalmente sobre una mesa de aislamiento de vibraciones.

Se coloca un microscopio invertido debajo del objetivo de manera que la luz enfocada reflejada desde el DMD pueda visualizarse a través del microscopio. Para obtener más detalles sobre el montaje del DMD, consulte el protocolo escrito adjunto. Primero, prepare los insertos para cultivo celular recubiertos con colágeno de seis pocillos para recibir cultivos X de explantes: recubra las paredes de los insertos para cultivo celular con Rain X, teniendo cuidado de no aplicar Rain X sobre la membrana misma.

Luego, agregue 1,5 mililitros de medio aian a los insertos e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, después de obtener ganglios de la raíz dorsal embrionarios de crías de rata E15, coloque hasta cuatro GRD sobre cada inserto de seis pocillos recubierto con colágeno e incube durante dos horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para permitir que el GRD se adhiera a la membrana.

Después del período de incubación, los ganglios dorsales estarán listos para la fotopolimerización. Un dispositivo digital de microespejos es una matriz de 1024 por 768 microespejos individuales, que refleja selectivamente la luz según la posición del espejo. En este procedimiento, el dispositivo se utiliza para proyectar luz ultravioleta sobre hidrogeles fotoenlazables, creando geometrías específicas de hidrogel de forma sencilla y rápida.

Aunque nuestro DMD es una unidad independiente, el dispositivo también puede integrarse para su uso con muchos microscopios existentes. Primero, retire las plantas DRGX del incubador y aspire todo el líquido excesivo del inserto. Luego, agregue 500 microlitros de medio de polimerización en el interior del inserto.

Transfiera los insertos con las plantas DRGX a una placa de vidrio para lluvia extrema y coloque la placa debajo del DMD. Utilice el programa de interfaz gráfica de usuario básico ALP tres para cargar la imagen en blanco y negro que se usará como máscara fotográfica en el DMD. En este caso, se eligió una forma bifurcada para permitir la implementación de sistemas de guía de neuritas utilizando un microscopio invertido y una fuente de luz visible DI.

Alinee el explante de tejido con la ubicación adecuada en la máscara fotográfica utilizando la luz reflejada por el DMD como guía. A continuación, cambie la fuente de luz visible por una fuente de luz UV. Ilumine el medio de polimerización dentro del cultivo celular.

Inserte hasta que la reticulación del PEG esté completa. Repita para cada ganglio dorsal en la inserción. Luego lave cada inserción tres veces con solución salina tamponada con fosfato estéril que contenga 1% de penicilina-estreptomicina.

Finalmente, agregue 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo de los insertos para cultivo celular y deje que se equilibre en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 30 minutos. Durante el período de incubación, someta la matriz pura a ultrasonido durante 30 minutos. Para solubilizar los péptidos, diluya la solución suministrada al 1 % hasta una concentración del 0,15 % en agua estéril y suplemente con un microgramo por mililitro de laminina soluble.

Después de 30 minutos, retire los cultivos del incubador y aspire todo el medio en exceso del inserto. Luego, visualizando el hueco bajo el microscopio, aspire el medio desde el interior del área vacía en la construcción de PEG que contiene el explante de DRGX, pipeteando alrededor de un microlitro de la solución pura de matriz dentro del hueco alrededor del explante X. Asegúrese de que la matriz pura no rebase el hueco del pilar.

Luego, pipetee 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto y colóquelo en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una hora. Para asegurar la total humectación después de este tiempo, reemplace el medio de crecimiento y luego devuelva los cultivos al incubador. El medio de crecimiento se reemplaza cada 48 horas de cultivo.

Se muestran aquí ejemplos de construcciones de hidrogel dual que contienen plantas DRGX. Las plantas DRGX han sido marcadas con indicadores de crecimiento y proliferación. El constructo de PEG polimerizado aparece gris, las NEURITAS del DRG marcadas con beta tres tubulina aparecen verdes y la tinción DPI marca los núcleos celulares que se observan en azul.

Observe que la migración celular y la extensión de retículos se limitan a la región permisiva para células del constructo de hidrogel dual. La encapsulación en hidrogel dual es adecuada cuando se utiliza cualquier gel de autoensamblaje o gel fotoentrecruzable. En este caso, el PEG actúa como soporte estructural para la presentación geométrica del gel de autoensamblaje.

Por ejemplo, matriz pura o aris. El tipo de gel y la elección de la máscara fotográfica dependerán de la aplicación deseada específica. Trate las paredes de un inserto para cultivo celular de poliéster con rain X como se ha demostrado previamente.

Transfiera el inserto a una placa recubierta con rain X y colóquela debajo del DMD. A continuación, agregue 500 microlitros de medio de polimerización al inserto. Cargue la máscara adecuada en el DMD para este experimento de supervivencia.

Se utiliza una presentación cilíndrica de matriz pura para facilitar la obtención de imágenes de las células. Exponga el inserto a luz UV durante 55 segundos para inducir el entrecruzamiento de los grupos peg tras el entrecruzamiento. Lave el vacío recién formado con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1%.

Utilice una micropipeta o un aplicador estéril de algodón para eliminar todo el líquido excesivo del espacio vacío. Prepare Matrixx puro mediante sonicación durante 30 minutos, dilúyalo al 0,15 % en agua estéril, suplementado con un microgramo por mililitro de laminina soluble y 10 % de sacarosa. A continuación, peletee las células que se van a cultivar mediante centrifugación.

Aspire completamente el medio del pellet celular y re suspenda el pellet a una concentración de aproximadamente cinco veces 10 a la tres células por mililitro en la solución de matriz pura al 0,15%. Es fundamental que todo el medio sea aspirado del pellet celular, ya que la matriz pura comienza la autoensamblaje al entrar en contacto con la solución salina. A continuación, pipetee alrededor de un microlitro de la mezcla de células en matriz pura suplementada dentro del hueco del perno.

Este volumen generalmente es suficiente para llenar el espacio vacío sin desbordar, pipeteando 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto. A continuación, coloque el hidrogel secundario de matriz pura en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una hora para asegurar la gelificación completa. Transcurrido este tiempo, aspire el medio y agregue medio fresco debajo del inserto, teniendo cuidado de no dañar la matriz pura, que es mecánicamente débil.

Devuelva los cultivos al incubador de cultivo de tejidos y cambie el medio cada 48 horas. A continuación se muestran ejemplos de neuronas de ganglios dorsales vivas encapsuladas dentro de una variedad de constructos de hidrogel dual. Después de 48 horas en medio de crecimiento, las células se marcaron con calcio, un marcador de células vivas que aparece en color verde.

Aquí, debido a la naturaleza dinámica de la máscara fotográfica DMD, la geometría disponible para la encapsulación solo está limitada por las dimensiones y la resolución de la óptica. Una encapsulación individual de hidrogel es adecuada cuando las células pueden examinarse dentro de un hidrogel fotoenlazable fiel al cultivo celular de poliéster. Inserte con rain X y coloque debajo del DMD sobre un portaobjetos recubierto con rain X.

Como antes, pipetee las células que se van a cultivar directamente en el medio de polimerización a la concentración deseada y mezcle bien para asegurar una distribución homogénea. Luego, pipetee 500 microlitros de la mezcla de células en el medio de polimerización dentro del inserto. Seleccione la máscara adecuada y colóquela sobre el DMD para inducir la reticulación de PEG mediante exposición a luz UV durante 55 segundos.

Para estudios de supervivencia celular, se utiliza una máscara circular básica para representar un cilindro; lave el inserto tres veces con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1 %, luego pipetee 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto y suficiente medio de crecimiento encima para sumergir completamente el inserto. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, con cambios de medio cada 48 horas. A continuación, se muestra un ejemplo de neuronas corticales disociadas vivas encapsuladas dentro de PEG. Las células vivas están marcadas con amarillo de calcio y aparecen verdes, mientras que las células muertas están marcadas con homodímero de AHy uno y aparecen rojas.

La encapsulación en PEG tiene solo fines ilustrativos, ya que el PEG no representa un entorno ideal para las células neuronales. La geometría elegida representa un medio sencillo para estudiar la viabilidad celular, pero podría adaptarse a una amplia gama de estructuras. Los hidrogeles en forma de película delgada pueden utilizarse para generar patrones específicos de células restringidas.

Nuevamente, trate el inserto de cultivo celular de poliéster con rain X como antes y colóquelo sobre una portaobjetos tratada con rain X. Luego, pipetee de 250 a 300 microlitros de medio de polimerización en la parte inferior del inserto de cultivo celular tratado. Este volumen es suficiente para cubrir apenas el fondo del inserto; incube a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos para permitir que el medio penetre la membrana del inserto. Aspire el medio excedente del inserto con una micropipeta.

Luego, pipetee una cantidad suficiente de aceite transparente a la UV en el fondo del inserto para cubrir completamente el área. Incube el inserto a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, tiempo suficiente para que el aceite forme una capa bien definida por encima del medio de polimerización. Para saturar la membrana del inserto, cargue una máscara adecuada en el DMD.

Después de colocar el inserto y la cubierta bajo el DMD, induzca el entrecruzamiento de los pegs mediante exposición a luz ultravioleta. Lave el inserto tres veces con DPBS estéril y 1% pen-strap. Tras el lavado, transfiera el inserto a una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos, recoga y peletee las células que se van a cultivar. Aspire el medio y resuspenda el sedimento celular en medio de crecimiento a la concentración deseada, entre 10⁴ y 10⁶ células por mililitro.

Luego, pipetee un volumen suficiente de la suspensión celular dentro del inserto de cultivo celular para obtener la densidad celular deseada. Añada medio de crecimiento suficiente debajo del inserto para mantener completamente la viabilidad celular. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono tras 48 horas de incubación.

Lave el inserto tres veces con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1 % para desprender cualquier célula no adherida. A continuación, agregue medio de crecimiento fresco a los pocillos. Devuelva la placa al incubador de cultivo celular y realice cambios de medio cada 48 horas.

Aquí, el PEG restrictivo para células se ha polimerizado como una película delgada utilizando un patrón de prueba para adherir selectivamente células disociadas a la membrana recubierta con colágeno de soportes permeables. Las células se marcaron tras 48 horas de incubación. Las células vivas marcadas con calcienina aparecen verdes, mientras que las células muertas se marcan con homodímero de etidio y aparecen rojas.

Puede observarse que ocurre un mínimo de daño celular en el área que contiene su fina película de PEG. Este es un ejemplo de un resultado indeseable. La polimerización parcial del PEG ha producido un constructo de PEG inutilizable.

La polimerización inadecuada puede ocurrir debido a la presencia de un menisco en el medio prepolimérico, cantidades insuficientes de polimerización, medio insuficiente, exposición inadecuada a la luz UV o enfoque incorrecto de la óptica. Este es un ejemplo de una encapsulación tridimensional deficiente de hidrogel dual de cultivo vegetal A-D-R-G-X. En esta imagen, puede observarse que las neuritas visibles en verde lograron crecer fuera de los canales de los pernos trazados.

Esto ocurre a menudo si la matriz pura se desborda sobre la porción de PEG durante la inyección. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos estándar como el registro de parche o la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como la electrofisiología o la expresión fenotípica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la fotolitografía por proyección de máscara dinámica para definir la presentación geométrica de sistemas de hidrogel simples o duales para el estudio de cultivos celulares neuronales.