Name: Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Aprende a fabricar hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección con máscara. Este método emplea un dispositivo de micromatriz digital para crear patrones geométricos específicos que guían el crecimiento de neuritas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer al laboratorio del profesor Anthony Windebank por compartir su experiencia en la disección de DRG y la cultura, así como el profesor Chen Shaochen útil para los debates sobre la instalación de DMD. Esta investigación fue financiada en parte por la Universidad de Tulane y subvenciones de la Junta de Regentes de Louisiana (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) y el NIH (NS065374).

1. DMD de configuración <ol><li> La junta DMD, guía de luz UV (con colimador) y lente objetivo de 4x, están todos montados verticalmente sobre una mesa de aislamiento de vibración. </li><li> La guía de luz UV debe ajustarse de modo que la luz incide en la serie del espejo en un ángulo de 45 º respecto al plano de los espejos, y 24 ° por debajo del plano de los espejos (Figura 1). </li><li> La lente del objetivo está montado de modo que la distancia de la DMD en la lente del objetivo se corresponde con la longitud focal asociada a la lente. </li><li> Un microscopio invertido se coloca por debajo de la lente del objetivo, de tal manera que la luz enfocada reflejada por la DMD pueden ser visualizados a través del microscopio. La distancia desde la lente del objetivo a la superficie de la polimerización de aproximadamente debe corresponder a la distancia de trabajo de la lente. La etapa en el microscopio se puede utilizar para ajustar la distancia de enfoque fino de la imagen. Esta distancia puede variar dependiendo de la superficie de polimerización elegido. </li></ol> 2. Construcciones de doble hidrogel para cultivos de explantes de tejidos A. DRG adhesión explante <ol><li> Recubrir las paredes de los 6 y colágeno recubiertas insertos de cultivo celular (Corning) con Rain-X, teniendo cuidado de evitar la propia membrana. (Por otra parte, una pluma barrera hidrofóbica puede ser utilizado.) </li><li> Inserta hidratar durante la noche con 1,5 ml de medio de adherencia en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. Medio de la adhesión es de tamaño medio neurobasal con suero fetal bovino al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mg / ml de NGF. </li><li> La cosecha de embriones ganglios de la raíz dorsal (GRD) de los cachorros E-15 de rata. DRG debe ser chapada en colágeno recubiertas de 6 y se inserta, hasta cuatro por cada inserción. </li><li> Incubar inserta durante 2 horas para permitir la DRG adhesión a la membrana. </li></ol> B. Dinámica fotopolimerización máscara Un dispositivo digital de microespejos (DMD) es una resolución de 1024 x 768 matriz de espejos individuales, similar a la de los televisores de proyección, lo que refleja la luz de forma selectiva sobre la base de la posición del espejo. Para nuestros propósitos, la DMD se utiliza a los rayos ultravioleta del patrón (UV) en hidrogeles photocrosslinkable, la creación de geometrías especificable hidrogel de una manera sencilla y rápida. La Figura 1 muestra la configuración de la trayectoria de la luz UV y la DMD. A pesar de nuestra DMD es una unidad independiente, el dispositivo también puede ser integrado para su uso con muchos microscopios existentes. <ol><li> Eliminar todo el líquido sobrante de insertar y añadir 500 l de medio de polimerización en el interior del inserto. Medio de polimerización contiene 10% de PEG (1000 MW) y el 0,5% Irgacure 2959 disuelto en medio neurobasal suplementado con 20 mg / ml de NGF y el 1% penicilina / estreptomicina. </li><li> Colocar la parte inferior del equipo DMD en un portaobjetos de vidrio de lluvia X tratados. </li><li> Cargar la imagen en blanco y negro adecuado para ser utilizado como una "fotomáscara" en la DMD, a través del uso de la interfaz gráfica de usuario incluye el programa ALP-3 básicos. Para nuestros propósitos, una forma de bifurcación fue elegido para permitir la aplicación de sistemas de guía de las neuritas. </li><li> Utilizando un microscopio invertido para la visualización, alinear los explantes de tejido con la ubicación adecuada en la fotomáscara una fuente de luz visible se refleja en el DMD. </li><li> Cambiar la fuente de luz visible de la fuente de luz UV, e iluminar la solución de PEG hasta reticulación es suficiente. (Para las condiciones dadas y 5,0 vatios / cm 2 de incidentes en la DMD, la reticulación se puede completar en tan sólo 55 segundos.) Repita para todos los GRD cuatro en la inserción. </li><li> Lave cada insertar tres veces con DPBS estéril y 1% Pen-Strep. </li><li> Añadir medio de cultivo 1,5 ml por debajo de los insertos de cultivo celular, y hasta que se estabilice en una incubadora durante 30 minutos. Medio de crecimiento es de medio neurobasal contiene 2% de B-27, Pen 1% / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mg / ml de NGF. </li></ol> C. Secundaria hidrogel Puramatrix <ol><li> Para aplicaciones neuronal, el 1% Puramatrix se diluye de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 0,15% en H 2 O estéril y se complementa con 1 mg / ml laminina soluble. </li><li> Todos los medios se debe quitar el exceso de los huecos de PEG, que contienen los explantes de DRG, utilizando un aplicador con punta de algodón estéril, Kimwipe o micropipeta. </li><li> Puramatrix se añade a los vacíos de PEG con una micropipeta con el fin de llenar el espacio vacío sin desbordarse. Dependiendo del volumen de vacío, por lo general ~ 1 l se utiliza por construir. </li><li> Puramatrix comienza el proceso de auto-ensamblaje de inmediato al entrar en contacto con una solución salina fisiológica, es decir, el PEG hinchada, pero 1,5 ml de medio de cultivo se agrega debajo de la inserción y se colocan en la incubadora durante una hora para asegurar la gelificación total. </li><li> Inicialmente, Puramatrix es ligeramente ácida, por lo que cambiar los medios de comunicación después de una hora para permitir que el pH se equilibre. </li><li> Cambios en los medios de comunicación se requiere aproximadamente cada 48 horas. Tenga cuidado de que todos los medios de comunicaciónañadido por debajo de la inserción, para proteger la integridad de Puramatrix mecánicamente débil. </li></ol> Agarosa <ol><li> Para aplicaciones neuronal, agarosa se diluye a una solución al 1% en medio de cultivo y se coloca en un baño de agua a 60 º C hasta que la agarosa se disuelva completamente (aproximadamente 1 hora). La solución se complementa con 1 mg / ml laminina soluble. </li><li> Todos los medios se debe quitar el exceso de los huecos PEG. </li><li> Agarosa se añade a los vacíos de PEG con el fin de llenar el espacio vacío sin desbordarse. Dependiendo del volumen de vacío, por lo general ~ 1 l se utiliza por construir. </li><li> 1,5 ml de medio de cultivo es pre-enfriado (8 ° C) en una placa de 6 pocillos, y los insertos de agarosa que contienen se transfieren a los medios de comunicación refrigerados y mantenidos en un refrigerador a una temperatura de 8 ° C durante al menos tres minutos para permitir a la agarosa gel. </li><li> Finalmente, los insertos son transferidos a 1,5 ml de medio de cultivo pre-calentado (37 ° C) y se mantienen en la incubadora a 37 ° C, con los cambios de los medios de comunicación necesarios cada 48 horas. </li></ol> 3. Hidrogel de doble encapsulación de células en 3D Encapsulación de hidrogel doble es adecuada cuando se utiliza el gel de auto-montaje. El gel photocrosslinkable, en este caso, PEG, sirve de soporte estructural para la presentación geométrica del gel de auto-montaje, por ejemplo Puramatrix o agarosa. Algunos de los métodos, en particular el tipo de gel y la elección de fotomáscaras, dependerá de la aplicación particular que desee. <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. Para la supervivencia de aplicación de células, que simplemente optaron por una presentación cilíndrica de Puramatrix para ayudar en la obtención de imágenes de las células. Los investigadores que estudian la señalización celular podría estar interesado en una geometría compartimentos para permitir la difusión de las moléculas quimiotácticas. Además, una aproximación de una arteria se muestra para representar a su posible aplicación a la investigación de los vasos sanguíneos. </li><li> El tratamiento de las paredes de una inserción de poliéster de cultivo celular con Rain-X, y el lugar bajo la lluvia en la DMD-X diapositivas recubiertos. </li><li> Añadir 500 l de medio de polimerización de la inserción. Inducir reticulación PEG por la exposición a la luz UV durante 55 segundos. </li><li> Lavar tres veces con DPBS estéril y 1% de Pen-Strep. </li><li> Retire todos los medios el exceso de los huecos PEG. </li><li> Centrifugar las células a la densidad deseada en una pastilla. Se debe tener cuidado de eliminar todo el medio del pellet de células antes de la mezcla, como Puramatrix comienza auto-ensamblaje de inmediato al entrar en contacto con una solución salina. Suspender las células dentro de un 0,15% Puramatrix diluida en estéril H 2 O complementado con un 10% de sacarosa. </li><li> Inyectar el Puramatrix / celular / sacarosa mezcla dentro de los huecos en PEG. </li><li> Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento por debajo de la inserción, y permitir que el gel dentro de la incubadora durante una hora. </li><li> Cambiar los medios de comunicación después de una hora, y cada ~ 48 horas después. </li></ol> 4. Hidrogel solo encapsulación de células en 3D A la encapsulación de hidrogel solo sería apropiado para cualquier situación en la que las células pueden ser examinados en el interior de un hidrogel photocrosslinkable. <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. Para los estudios de supervivencia de las células, una vez más eligió una máscara circular básica para representar a un cilindro. Máscaras similares a los mostrados en el método 4 de nuevo se podría aplicar para el campo de la investigación correspondiente. </li><li> El tratamiento de una célula de poliéster insertar la cultura con la lluvia-X, y de lugar en DMD en la lluvia-X diapositivas recubiertos. </li><li> Las células en cualquier concentración deseada se pueden añadir directamente a la solución de PEG al 10%, mezclando bien para asegurar una distribución homogénea. </li><li> Añadir 500 l de medio de polimerización de la inserción. Inducir reticulación PEG por la exposición a la luz UV durante 55 segundos. </li><li> Lavar tres veces con DPBS estéril y 1% de Pen-Strep. </li><li> Rellenar con medio de crecimiento por debajo y por encima de la inserción, el cambio de cada ~ 2 días. </li></ol> 5. De película delgada de polimerización de hidrogel <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. </li><li> Tratar de colágeno recubiertas de células de poliéster insertar la cultura con la lluvia-X, y el lugar en el Rain-X diapositivas recubiertos. </li><li> Añadir medio de polimerización suficiente para cubrir sólo la parte inferior de la pieza (~ 250 a 300 l para las inserciones de placa de 6 pocillos). Permita que el medio para penetrar la membrana inserción durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el exceso de medio de polimerización de la inserción con una micropipeta o Kimwipe. Agregue una cantidad suficiente de UV-transparente de aceite para cubrir totalmente la parte inferior de la inserción. Permitir la inserción de sentarse por 15-30 minutos a temperatura ambiente, tiempo suficiente para que el aceite para formar una capa distinta por encima de la saturación medio de polimerización de la membrana de inserción. </li><li> Coloque el inserto y se deslizan bajo la DMD. Inducir reticulación PEG por la exposición a los rayos UV. Debido a la delgadez de la capa de PEG, la reticulación se puede completar en tan sólo 15 segundos a 5,0 W / cm 2 en el incidente de la DMD. </li><li lave la inserci de tres veces con dpbs est y pen-strep. persistencia un residuo aceitoso es una preocupaci detergente suave como tween puede ser a soluci lavado><li> Tienda de la inserción en una placa de tejido de 6 pocillos. Añadir medio de cultivo de células en suspensión, en la concentración deseada, y una pipeta un volumen suficiente de la suspensión de células dentro de la inserción de cultivo celular para obtener la densidad celular deseada. A continuación, agregue un medio de crecimiento bastante por debajo de la inserción a mantener totalmente la viabilidad celular (~ 1,5 ml). </li><li> Después de 48 horas han transcurrido, lave la pieza tres veces con DPBS estéril y 1% de la pluma Strep-para desalojar a cualquier célula no adherida. Cambiar los medios de comunicación, aproximadamente una vez cada 48 horas. </li></ol> 6. Resultados representante Ejemplos de hidrogel de doble construcciones que contengan explantes DRG se muestran en la Figura 2. Tenga en cuenta que la migración celular y la extensión de las neuritas se limita a la región de células permisivas del hidrogel de doble construcción. La Figura 3 muestra las células disociadas encapsulado de manera similar en el interior de las construcciones de hidrogel dual. Debido a la naturaleza dinámica de la fotomáscara DMD, la geometría para la encapsulación sólo está limitado por las dimensiones y la resolución de la óptica. Encapsulación de células también era posible dentro de un hidrogel solo fotopolimerizable, PEG, y una prueba de viabilidad en vivo / muerto se llevó a cabo como se evidencia en la Figura 4. Encapsulación de PEG se entiende sólo como un ejemplo, como PEG no representa un ambiente ideal para las células nerviosas. Por lo tanto, se dio cuenta de la viabilidad celular en las construcciones de nuestra PEG es comprensiblemente baja. Finalmente, los ejemplos de la utilización de películas delgadas de PEG como una capa de modelado restrictivas para la adhesión celular en las inserciones de cultivo celular se muestra en la Figura 5. Además, los ejemplos de posibles "malos" los resultados se ofrecen en la Figura 6. Los resultados representan sólo una pequeña fracción de los posibles usos de los métodos desarrollados en nuestro laboratorio. Tienen el propósito de demostrar la facilidad, versatilidad y la viabilidad de nuestro enfoque, y podría ser tratado como "prueba de principio" para que los investigadores desarrollen sus posibles adaptaciones propias. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de la trayectoria de la luz utilizada para la fotolitografía. Recuadro: La luz UV se enciende la DMD en un ángulo de 45 ° y 24 ° por debajo del plano de la serie del espejo. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Etiquetada crecimiento y la proliferación en el GRD que contienen construcciones de doble hidrogel. AD) Las imágenes retratan polimerizado construye PEG (gris) con neuritas etiquetados con beta tubulina III (verde), los núcleos de células teñidas con DAPI (azul). Los explantes de DRG se encuentran en Puramatrix y ubicados en las regiones del patrón circular, con neuritas cada vez mayor hacia la bifurcación (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Construcciones de doble hidrogel que contiene las células marcadas con calceína AM, un marcador de células vivas, después de 48 horas en medio de crecimiento. AD) Diversas formas de PEG, lleno de Puramatrix contiene neuronas disociadas DRG (~ 5x10 3 células / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Hidrogel única construcción que contiene células vivas marcadas con calceína AM (verde) y las células muertas de la etiqueta con el homodímero de etidio-1 (roja) a las 24 horas en medio de cultivo (5x10 3 células / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> PEG Figura 5. Celular restrictivas polimerizada como una película delgada con un "patrón de prueba" a que se adhieran de forma selectiva las células disociadas de la membrana de colágeno recubiertas de soporte permeable. A, B) Las células vivas se etiquetan a las 48 horas con calceína AM (verde), mientras que las células muertas se etiquetan con homodímero de etidio-1 (roja). La adhesión celular mínima ocurre en el área que contiene la película delgada PEG. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Imágenes representativas de resultados no deseados. A) la polimerización parcial de PEG, dando lugar a una PEG inutilizable construir. Polimerización inadecuada puede ocurrir debido a la presencia de un menisco en el medio pre-polímero, una cantidad insuficiente de medio de polimerización, la exposición UV insuficiente o inadecuado enfoque de la óptica. B) Imagen de retratar polimerizado construye PEG (gris) con neuritas etiquetados con beta tubulina III (verde), los núcleos de células teñidas con DAPI (azul). Las neuritas fueron capaces de crecer fuera de los canales de dibujos PEG. Esto ocurre a menudo en la condición de que se desborda Puramatrix en la parte superior de la porción de PEG durante la inyección.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

El método descrito en este documento podría ser utilizado por cualquier investigador que buscan sistemas de celdas de simple y reproducible la cultura. En teoría, debido a la amplia variedad de hidrogeles fotopolimerizables disponibles, el medio ambiente podrían ser adaptados para permitir su uso con cualquier tipo de célula, incluyendo explantes de todo el tejido. Además, el sistema dual de hidrogel permite un mejor control espacial en la presentación de la auto-polimerización de los hidrogeles, que tiende a crear formas amorfas por su cuenta. El resultado de &quot;2,5 D&quot; construye hidrogel micropatterned proporcionar una matriz 3D para el crecimiento neuronal se presenta en una configuración 2D que permite la evaluación microscópica conveniente. El sustrato sobre el que los geles son polimerizados también se puede variar, lo que permite un mayor control en el diseño experimental. Nuestros métodos están optimizados para su uso con soportes de cultivo celular permeable, como se ha visto una mejor viabilidad (Figura 4), en comparación con la polimerización en portaobjetos de vidrio (datos no mostrados). Sin embargo, otras superficies de polimerización pueden ser más aplicables para diferentes aplicaciones: fabricación de placas de vidrio utilizados en los experimentos de microfluidos o formaciones de células agregado, por ejemplo. Nuestra experiencia con estos sistemas de cultivo ha llevado a la identificación de posibles áreas de dificultad. En primer lugar, las técnicas de cuidado es necesario para mantener la esterilidad de las construcciones. Debido a la naturaleza voluminosa de la configuración de DMD, es difícil de realizar los pasos de polimerización bajo condiciones estériles. Para combatir este problema, el paso de enjuague se describe en los métodos es útil, y los antibióticos deben ser utilizados en todos los medios de comunicación. Además, el espesor final y la forma de la construcción polimerizado depende en gran medida el comportamiento de los fluidos de la pre-mezcla de polímeros, y la presencia de un menisco puede dar lugar a construcciones de gel que son demasiado delgados o polimerizado incompleta (Figura 6). A dos pasos se pueden tomar para minimizar la formación de un menisco en el interior se inserta el cultivo de células. Para los hidrogeles de espesor (&gt; 200 m), una simple capa de lluvia-X alrededor de la pared interior de la pieza es suficiente. Sin embargo, como se describe brevemente más arriba, para las construcciones finas (&lt;200 micras), una capa de aceite se requiere tanto para minimizar el menisco y negar bloqueo del oxígeno de la polimerización por radicales libres. Resolución se encontró que depende del espesor, con una disminución de tamaño de la característica realiza con geles cada vez más grueso. La resolución también variaba dependiendo de si la función representa un alivio positivo o negativo en el hidrogel. Sin embargo, hemos logrado una resolución suficiente para las construcciones con tamaños mínimos de la escala de aproximadamente 100 micras con los objetivos de centrarse sólo microscopio óptico. Nuestros experimentos han demostrado que las construcciones de hidrogel de doble descritas aquí representan una excelente base para la formación básica de los modelos in vitro del crecimiento de las neuritas y la orientación. La técnica empleada micropatterning es una adaptación de los métodos existentes 18,19, pero nuestra puesta a punto hizo hincapié en un diseño fácil de implementar y se ha optimizado para la producción de construcciones de hidrogel de doble en las inserciones de cultivo celular, insertos de cultivo celular fueron vitales para la mejora de la viabilidad celular y como reticulación alrededor de explantes de tejido previamente adherentes. El alcance de los resultados mostrados se ve limitada por los intereses de nuestro laboratorio, sin embargo, creemos que los métodos descritos en esta publicación sea de utilidad para los investigadores en busca de un relativamente barato, método rápido y fácil de usar para la fabricación de cultivo de células en 3D modelos.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Digital de Micromirrores</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Soporte Permeable Recubierto con Colágeno Transwell</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>También denominado Inserto de Cultivo Celular en el manuscrito</td></tr><tr><td>Soporte Permeable de Poliéster Transwell</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>También denominado Inserto de Cultivo Celular en el manuscrito</td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suero Bovino Fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Factor de Crecimiento Nervioso</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Aceite</td><td>Se han utilizado tanto aceite de canola como aceite de silicona</td><td></td><td>Debe ser transparente a la UV y minimizar la formación de menisco +/-</td></tr><tr><td>OmniCure Serie 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección máscara

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Cada vez más, con dibujos ambientes de cultivo celular se están convirtiendo en una técnica relevante para estudiar las características celulares, y muchos investigadores creen en la necesidad de entornos 3D para representar los experimentos in vitro que imitan mejor en calidades 3.1 vivo. Los estudios en campos como la investigación sobre el cáncer 4, 5 neural ingeniería, la fisiología cardíaca 6, y la interacción célula-matriz 7,8 han demostrado el comportamiento celular difiere sustancialmente entre los cultivos en monocapa tradicional y construye en 3D. Los hidrogeles son utilizados como escenarios en 3D, debido a su variedad, versatilidad y capacidad de adaptar la composición molecular a través de funcionalización 9.12. Existen numerosas técnicas para la creación de estructuras como las células de apoyo matrices, incluyendo electrospinning 13, sellos de elastómero 14, la impresión de inyección de tinta 15, 16 photopatterning aditivo, fotomáscara estática proyección litografía 17, y microstereolithography máscara dinámica 18. Por desgracia, estos métodos implican varios pasos de producción y / o equipos no son fácilmente adaptables a las células convencionales y los métodos de cultivo de tejidos. La técnica empleada en este protocolo se adapta los dos últimos métodos, utilizando un dispositivo digital de microespejos (DMD) para crear dinámicas de máscaras para la reticulación geométrica específica poli-(etilenglicol) (PEG) hidrogeles, inducida por UV inició polimerización por radicales libres. El resultado de &quot;2,5 D&quot; estructuras de proporcionar un entorno limitado en 3D para el crecimiento neuronal. Contamos con un enfoque de doble hidrogel, donde PEG sirve como una estructura celular región de restricción el suministro de un informe de lo contrario, pero la célula permisiva-auto-montaje de gel hecho a partir de cualquiera de Puramatrix o agarosa. El proceso es rápido simple fabricación de paso, que es altamente reproducible y adaptado fácilmente para su uso con los métodos convencionales de cultivo de células y sustratos. Explantes de todo el tejido, como los ganglios de la raíz dorsal de embriones (GRD), se pueden incorporar en las construcciones de hidrogel doble para los ensayos experimentales, tales como crecimiento de las neuritas. Además, las células disociadas se puede encapsular en el hidrogel photocrosslinkable o auto polimerización, o de forma selectiva adheridos a la membrana permeable con el apoyo de células restrictivas photopatterning. Uso de la DMD, hemos creado hidrogel construcciones de hasta ~ 1 mm de grosor, pero de película delgada (&lt;200 micras) las estructuras de PEG se vieron limitadas por bloqueo del oxígeno de la reacción de polimerización por radicales libres. Estamos posteriormente desarrolló una técnica que utiliza una capa de aceite por encima del líquido de polimerización que permite la polimerización fina estructura PEG. En este protocolo, se describe la creación rápida de sistemas de hidrogel en 3D para la producción de células neuronales microfabricated y cultivos de tejidos. Las construcciones de hidrogel de doble demostrado en este comunicado representan versátil en modelos in vitro que pueden resultar útiles para los estudios de la neurociencia participación de la supervivencia celular, la migración, y / o el crecimiento de las neuritas y la orientación. Por otra parte, como el protocolo puede trabajar para muchos tipos de hidrogeles y las células, las posibles aplicaciones son variadas y extensas.

Técnicas sencillas se describen para la producción rápida de microfabricated sistemas de cultivo neuronal mediante un dispositivo digital de microespejos para la litografía de proyección dinámica máscara regular de los sustratos de cultivo celular. Estos sistemas de cultivo pueden ser más representativos de la arquitectura biológica natural, y las técnicas descritas podrían ser adaptados para numerosas aplicaciones.

Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

Cada vez más, los entornos de cultivo celular con patrones se están convirtiendo en una técnica relevante para estudiar las características celulares, y muchos investigadores creen en la ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de cultivo celular con hidrogeles duales y microestructurado para estudios neuronales. Esto se logra primero sembrando implantes de tejido, como ganglios de la raíz dorsal embrionarios, sobre insertos permeables para cultivo celular. A continuación, se crea un micro patrón en un hidrogel fotoenlazable utilizando un dispositivo microdigital de espejos o DMD como máscara fotodinámica.A continuación, se añade el hidrogel autoensamblable como Pure, que puede contener una suspensión de células disociadas. Es necesario un tiempo adecuado de incubación antes del análisis celular. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la viabilidad de las células neuronales y el crecimiento de neuritas mediante configuraciones geométricas específicas definidas por la DMD.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que se puede crear, modificar y proyectar rápidamente una masa fotodinámica desde una distancia para adaptarse a casi cualquier sustrato, como insertos permeables para cultivo celular. Aunque este método puede proporcionar información sobre los sistemas neuronales, también puede aplicarse a otros sistemas que se beneficien de restricciones geométricas específicas, como la señalización celular, la migración celular, el contacto célula a célula o la morfogénesis, por mencionar algunos. Las luces UV del tablero DMD y el objetivo de cuatro aumentos están montados verticalmente sobre una mesa de aislamiento de vibraciones.Se coloca un microscopio invertido debajo del objetivo de manera que la luz enfocada reflejada desde el DMD pueda visualizarse a través del microscopio. Para obtener más detalles sobre el montaje del DMD, consulte el protocolo escrito adjunto. Primero, prepare los insertos para cultivo celular recubiertos con colágeno de seis pocillos para recibir cultivos X de explantes: recubra las paredes de los insertos para cultivo celular con Rain X, teniendo cuidado de no aplicar Rain X sobre la membrana misma.Luego, agregue 1,5 mililitros de medio aian a los insertos e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, después de obtener ganglios de la raíz dorsal embrionarios de crías de rata E15, coloque hasta cuatro GRD sobre cada inserto de seis pocillos recubierto con colágeno e incube durante dos horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para permitir que el GRD se adhiera a la membrana.Después del período de incubación, los ganglios dorsales estarán listos para la fotopolimerización. Un dispositivo digital de microespejos es una matriz de 1024 por 768 microespejos individuales, que refleja selectivamente la luz según la posición del espejo. En este procedimiento, el dispositivo se utiliza para proyectar luz ultravioleta sobre hidrogeles fotoenlazables, creando geometrías específicas de hidrogel de forma sencilla y rápida.Aunque nuestro DMD es una unidad independiente, el dispositivo también puede integrarse para su uso con muchos microscopios existentes. Primero, retire las plantas DRGX del incubador y aspire todo el líquido excesivo del inserto. Luego, agregue 500 microlitros de medio de polimerización en el interior del inserto.Transfiera los insertos con las plantas DRGX a una placa de vidrio para lluvia extrema y coloque la placa debajo del DMD. Utilice el programa de interfaz gráfica de usuario básico ALP tres para cargar la imagen en blanco y negro que se usará como máscara fotográfica en el DMD. En este caso, se eligió una forma bifurcada para permitir la implementación de sistemas de guía de neuritas utilizando un microscopio invertido y una fuente de luz visible DI.Alinee el explante de tejido con la ubicación adecuada en la máscara fotográfica utilizando la luz reflejada por el DMD como guía. A continuación, cambie la fuente de luz visible por una fuente de luz UV. Ilumine el medio de polimerización dentro del cultivo celular.Inserte hasta que la reticulación del PEG esté completa. Repita para cada ganglio dorsal en la inserción. Luego lave cada inserción tres veces con solución salina tamponada con fosfato estéril que contenga 1% de penicilina-estreptomicina.Finalmente, agregue 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo de los insertos para cultivo celular y deje que se equilibre en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 30 minutos. Durante el período de incubación, someta la matriz pura a ultrasonido durante 30 minutos. Para solubilizar los péptidos, diluya la solución suministrada al 1 % hasta una concentración del 0,15 % en agua estéril y suplemente con un microgramo por mililitro de laminina soluble.Después de 30 minutos, retire los cultivos del incubador y aspire todo el medio en exceso del inserto. Luego, visualizando el hueco bajo el microscopio, aspire el medio desde el interior del área vacía en la construcción de PEG que contiene el explante de DRGX, pipeteando alrededor de un microlitro de la solución pura de matriz dentro del hueco alrededor del explante X. Asegúrese de que la matriz pura no rebase el hueco del pilar.Luego, pipetee 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto y colóquelo en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una hora. Para asegurar la total humectación después de este tiempo, reemplace el medio de crecimiento y luego devuelva los cultivos al incubador. El medio de crecimiento se reemplaza cada 48 horas de cultivo.Se muestran aquí ejemplos de construcciones de hidrogel dual que contienen plantas DRGX. Las plantas DRGX han sido marcadas con indicadores de crecimiento y proliferación. El constructo de PEG polimerizado aparece gris, las NEURITAS del DRG marcadas con beta tres tubulina aparecen verdes y la tinción DPI marca los núcleos celulares que se observan en azul.Observe que la migración celular y la extensión de retículos se limitan a la región permisiva para células del constructo de hidrogel dual. La encapsulación en hidrogel dual es adecuada cuando se utiliza cualquier gel de autoensamblaje o gel fotoentrecruzable. En este caso, el PEG actúa como soporte estructural para la presentación geométrica del gel de autoensamblaje.Por ejemplo, matriz pura o aris. El tipo de gel y la elección de la máscara fotográfica dependerán de la aplicación deseada específica. Trate las paredes de un inserto para cultivo celular de poliéster con rain X como se ha demostrado previamente.Transfiera el inserto a una placa recubierta con rain X y colóquela debajo del DMD. A continuación, agregue 500 microlitros de medio de polimerización al inserto. Cargue la máscara adecuada en el DMD para este experimento de supervivencia.Se utiliza una presentación cilíndrica de matriz pura para facilitar la obtención de imágenes de las células. Exponga el inserto a luz UV durante 55 segundos para inducir el entrecruzamiento de los grupos peg tras el entrecruzamiento. Lave el vacío recién formado con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1%.Utilice una micropipeta o un aplicador estéril de algodón para eliminar todo el líquido excesivo del espacio vacío. Prepare Matrixx puro mediante sonicación durante 30 minutos, dilúyalo al 0,15 % en agua estéril, suplementado con un microgramo por mililitro de laminina soluble y 10 % de sacarosa. A continuación, peletee las células que se van a cultivar mediante centrifugación.Aspire completamente el medio del pellet celular y re suspenda el pellet a una concentración de aproximadamente cinco veces 10 a la tres células por mililitro en la solución de matriz pura al 0,15%. Es fundamental que todo el medio sea aspirado del pellet celular, ya que la matriz pura comienza la autoensamblaje al entrar en contacto con la solución salina. A continuación, pipetee alrededor de un microlitro de la mezcla de células en matriz pura suplementada dentro del hueco del perno.Este volumen generalmente es suficiente para llenar el espacio vacío sin desbordar, pipeteando 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto. A continuación, coloque el hidrogel secundario de matriz pura en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una hora para asegurar la gelificación completa. Transcurrido este tiempo, aspire el medio y agregue medio fresco debajo del inserto, teniendo cuidado de no dañar la matriz pura, que es mecánicamente débil.Devuelva los cultivos al incubador de cultivo de tejidos y cambie el medio cada 48 horas. A continuación se muestran ejemplos de neuronas de ganglios dorsales vivas encapsuladas dentro de una variedad de constructos de hidrogel dual. Después de 48 horas en medio de crecimiento, las células se marcaron con calcio, un marcador de células vivas que aparece en color verde.Aquí, debido a la naturaleza dinámica de la máscara fotográfica DMD, la geometría disponible para la encapsulación solo está limitada por las dimensiones y la resolución de la óptica. Una encapsulación individual de hidrogel es adecuada cuando las células pueden examinarse dentro de un hidrogel fotoenlazable fiel al cultivo celular de poliéster. Inserte con rain X y coloque debajo del DMD sobre un portaobjetos recubierto con rain X.Como antes, pipetee las células que se van a cultivar directamente en el medio de polimerización a la concentración deseada y mezcle bien para asegurar una distribución homogénea. Luego, pipetee 500 microlitros de la mezcla de células en el medio de polimerización dentro del inserto. Seleccione la máscara adecuada y colóquela sobre el DMD para inducir la reticulación de PEG mediante exposición a luz UV durante 55 segundos.Para estudios de supervivencia celular, se utiliza una máscara circular básica para representar un cilindro; lave el inserto tres veces con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1 %, luego pipetee 1,5 mililitros de medio de crecimiento debajo del inserto y suficiente medio de crecimiento encima para sumergir completamente el inserto. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, con cambios de medio cada 48 horas. A continuación, se muestra un ejemplo de neuronas corticales disociadas vivas encapsuladas dentro de PEG. Las células vivas están marcadas con amarillo de calcio y aparecen verdes, mientras que las células muertas están marcadas con homodímero de AHy uno y aparecen rojas.La encapsulación en PEG tiene solo fines ilustrativos, ya que el PEG no representa un entorno ideal para las células neuronales. La geometría elegida representa un medio sencillo para estudiar la viabilidad celular, pero podría adaptarse a una amplia gama de estructuras. Los hidrogeles en forma de película delgada pueden utilizarse para generar patrones específicos de células restringidas.Nuevamente, trate el inserto de cultivo celular de poliéster con rain X como antes y colóquelo sobre una portaobjetos tratada con rain X. Luego, pipetee de 250 a 300 microlitros de medio de polimerización en la parte inferior del inserto de cultivo celular tratado. Este volumen es suficiente para cubrir apenas el fondo del inserto; incube a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos para permitir que el medio penetre la membrana del inserto. Aspire el medio excedente del inserto con una micropipeta.Luego, pipetee una cantidad suficiente de aceite transparente a la UV en el fondo del inserto para cubrir completamente el área. Incube el inserto a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, tiempo suficiente para que el aceite forme una capa bien definida por encima del medio de polimerización. Para saturar la membrana del inserto, cargue una máscara adecuada en el DMD.Después de colocar el inserto y la cubierta bajo el DMD, induzca el entrecruzamiento de los pegs mediante exposición a luz ultravioleta. Lave el inserto tres veces con DPBS estéril y 1% pen-strap. Tras el lavado, transfiera el inserto a una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos, recoga y peletee las células que se van a cultivar. Aspire el medio y resuspenda el sedimento celular en medio de crecimiento a la concentración deseada, entre 10⁴ y 10⁶ células por mililitro.Luego, pipetee un volumen suficiente de la suspensión celular dentro del inserto de cultivo celular para obtener la densidad celular deseada. Añada medio de crecimiento suficiente debajo del inserto para mantener completamente la viabilidad celular. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono tras 48 horas de incubación.Lave el inserto tres veces con DPBS estéril y penicilina-estreptomicina al 1 % para desprender cualquier célula no adherida. A continuación, agregue medio de crecimiento fresco a los pocillos. Devuelva la placa al incubador de cultivo celular y realice cambios de medio cada 48 horas.Aquí, el PEG restrictivo para células se ha polimerizado como una película delgada utilizando un patrón de prueba para adherir selectivamente células disociadas a la membrana recubierta con colágeno de soportes permeables. Las células se marcaron tras 48 horas de incubación. Las células vivas marcadas con calcienina aparecen verdes, mientras que las células muertas se marcan con homodímero de etidio y aparecen rojas.Puede observarse que ocurre un mínimo de daño celular en el área que contiene su fina película de PEG. Este es un ejemplo de un resultado indeseable. La polimerización parcial del PEG ha producido un constructo de PEG inutilizable.La polimerización inadecuada puede ocurrir debido a la presencia de un menisco en el medio prepolimérico, cantidades insuficientes de polimerización, medio insuficiente, exposición inadecuada a la luz UV o enfoque incorrecto de la óptica. Este es un ejemplo de una encapsulación tridimensional deficiente de hidrogel dual de cultivo vegetal A-D-R-G-X. En esta imagen, puede observarse que las neuritas visibles en verde lograron crecer fuera de los canales de los pernos trazados.Esto ocurre a menudo si la matriz pura se desborda sobre la porción de PEG durante la inyección. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos estándar como el registro de parche o la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como la electrofisiología o la expresión fenotípica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la fotolitografía por proyección de máscara dinámica para definir la presentación geométrica de sistemas de hidrogel simples o duales para el estudio de cultivos celulares neuronales.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

Describimos la fabricación de láminas de hidrogel microestampadas utilizando un proceso simple, que se puede ensamblar y manipular de forma independiente. Utilizando estas láminas modulares de hidrogel, se puede generar un sencillo sistema de cultivo celular en 3D a macroescala con un microambiente celular controlado.

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

La impresión 3D a escala micrométrica permite la creación rápida de prototipos de dispositivos poliméricos para cultivos de células neuronales. Como prueba de principio, las conexiones estructurales entre las neuronas se vieron limitadas por la creación de barreras y canales que influyen en el crecimiento de las neuritas, mientras que las consecuencias funcionales de dicha manipulación fueron observadas por la electrofisiología extracelular.

Impresión 3D de polimerización de dos fotones de dispositivos de cultivo de células neuronales a microescala

Aprende a fabricar hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección con máscara. Este método emplea un dispositivo de micromatriz digital para crear patrones geométricos específicos que guían el crecimiento de neuritas.

Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

Explorar más videos