El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica
13 de febrero de 2011
Se describe un protocolo para observar y analizar las trayectorias de células rodando por patrones asimétricos receptor de sustratos. Los datos resultantes son útiles para la ingeniería de patrones receptor sustratos para etiquetas sin separación celular y el análisis.
Este protocolo observa y analiza las trayectorias de rodadura celular sobre patrones asimétricos de receptores para facilitar la ingeniería de sustratos con patrones de receptores para la separación y el análisis de células sin etiquetado. Comience con la impresión por microcontacto de moléculas de PEG sobre un sustrato de oro para crear patrones alternos de monocapas autoensambladas, seguido del relleno posterior del sustrato con P-selectina y receptores. A continuación, incorpore el sustrato a la cámara de flujo. Introduzca las células HL-60 en la cámara.
Registre una secuencia de imágenes de la interacción de rodadura de células HL 60 sobre patrones de P-selectina y analice las imágenes convertidas a partir del video. Las trayectorias del borde celular en rodadura, la longitud y las velocidades de rodadura en el plano, región y borde se pueden obtener mediante un programa en MATLAB. Este método puede proporcionar información sobre cómo se desplazan las células HO 60 sobre patrones asimétricos de receptores bajo flujo de cizalladura.
Esto puede aplicarse para cuantificar otras interacciones en la superficie celular, mediante el análisis directo de las células al observar sus trayectorias sobre patrones de receptores, y para el diseño de dispositivos microscópicos de agarre para la separación celular. La impresión por microcontacto se utiliza para crear patrones alternados de monocapas autoensambladas de moléculas de PEG sobre un sustrato de oro.
Primero, entinte el sello de PDMS con una solución de PEG cinco milimolar en etanol. Seque la superficie durante 20 minutos. Coloque suavemente el sello sobre la superficie de oro durante 40 segundos y asegúrese de que haya un buen contacto entre la superficie de oro y el sello.
No se requiere presión excesiva. Enjuague la superficie con etanol y seque con una corriente de nitrógeno. Ahora, utilizando una cámara de perfusión, incube los sustratos con una solución de P-selectina a 15 microgramos por mililitro durante tres horas a temperatura ambiente para imprimir las áreas restantes con P-selectina, enjuague la cámara, y luego complete las superficies con BSA al uno miligramo por mililitro durante una hora para bloquear interacciones no específicas.
Lave la superficie con tampón DPBS antes de realizar el experimento de rodadura celular. Monte la cámara de flujo y luego haga pasar una suspensión de 10 a la quinta células por mililitro. Células HL 60 sobre el patrón, superficies en una cámara de flujo rectangular con ángulos de inclinación del patrón de receptores de 10 grados.
A temperatura ambiente de 24,5 grados Celsius. Ajuste la bomba de jeringa para generar un flujo de 75 microlitros por minuto con un esfuerzo cortante laminar correspondiente de 0,5 dinas por centímetro cuadrado. Ahora, con un microscopio invertido y una cámara montada, registre el movimiento de rodadura de HL 60.
Interacciones con p adhesivo, select y sustratos. Utilice un objetivo de cuatro x a una velocidad de un cuadro por segundo durante duraciones de 300 segundos. Realice tres experimentos independientes.
Presente los datos como media y desviación estándar de los valores promedio obtenidos de cada experimento. Las imágenes de microscopio convertidas a partir del video de HL 60. Rolling. Las interacciones con el adhesivo p, selectina y sustratos demuestran regiones brillantes y oscuras que corresponden a las regiones del receptor de selectina p y PEG, respectivamente.
Las trayectorias se delimitan aquí mediante un programa personalizado de MATLAB. El ángulo de inclinación del borde fue de 10 grados y el esfuerzo cortante fue de 0,5 dinas por centímetro cuadrado. Análisis adicionales se basan en la distribución de la longitud de seguimiento del borde, el valor promedio de la longitud de seguimiento del borde, así como VE y VP, las velocidades de desplazamiento en el borde y en el interior de las bandas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar las trayectorias celulares en los patrones asimétricos de receptores.
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Descripción general
Este protocolo observa y analiza las trayectorias de rodado celular sobre patrones de receptores asimétricos para facilitar la ingeniería de sustratos con patrones de receptores destinados a la separación y análisis de células sin marcado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biomateriales
- Microfluídica
Antecedentes
- La laminaridad celular es un proceso crítico en diversas interacciones biológicas.
- Los patrones asimétricos de receptores pueden influir en el comportamiento celular.
- Las técnicas libres de marcadores son esenciales para la separación y el análisis de células.
- La impresión por microcontacto es un método útil para crear sustratos con patrones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para observar el movimiento rodante de células sobre sustratos con patrones de receptores.
- Analizar las trayectorias de las células rodantes para mejorar la ingeniería de sustratos.
- Proporcionar información sobre la dinámica del movimiento celular bajo condiciones de flujo.
Métodos Utilizados
- Impresión por contacto microscópica de moléculas de PEG sobre un sustrato de oro.
- Creación de patrones alternos de monocapas autoensambladas.
- Relleno posterior del sustrato con P-selectina y receptores.
- Incorporación de la cámara de flujo e imagen de células HL-60 rodando sobre los patrones.
Resultados principales
- Se registraron secuencias de imágenes de las interacciones de células HL-60.
- Las trayectorias de las células que rodaban se analizaron mediante MATLAB.
- Se obtuvieron datos sobre la longitud del seguimiento del borde y las velocidades de rodamiento.
- Se obtuvieron conocimientos sobre el movimiento celular sobre patrones asimétricos de receptores.
Conclusiones
- El protocolo permite un análisis detallado de la dinámica del rodamiento celular.
- Se pueden diseñar patrones asimétricos de receptores para lograr una separación eficaz de células.
- Este método contribuye al entendimiento del comportamiento celular en flujo de cizalladura.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender las trayectorias de rodadura celular sobre patrones asimétricos de receptores permite el diseño racional de dispositivos de separación microfluídicos libres de marcadores. Este protocolo proporciona datos cuantitativos sobre la longitud de seguimiento del borde y la velocidad de rodadura bajo un esfuerzo cortante definido, lo que apoya la modelización predictiva del comportamiento celular en flujo. Estas perspectivas reducen la iteración empírica en la ingeniería de dispositivos para flujos de trabajo de purificación celular y análisis fenotípicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la cinética de unión ligando-receptor bajo condiciones fisiológicas de cizalladura, aportando información para la validación de dianas en vías mediadas por adhesión.
- Valor operativo: Proporciona un método sin marcadores para evaluar la actividad funcional del receptor sin necesidad de etiquetas fluorescentes ni reporteros genéticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de la velocidad de rodadura celular y la longitud de seguimiento del borde para análisis comparativo entre densidades de receptores o geometrías de patrones.
- Valor operativo: Estandariza la preparación del sustrato mediante impresión por microcontacto e integración en cámaras de flujo para ensayos de adhesión reproducibles.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la reducción mecanicista de riesgos en estrategias de separación basadas en adhesión mediante la vinculación del diseño de patrones de receptores con resultados observables en las trayectorias celulares.
- Valor operativo: Permite el cribado de fenotipos celulares basado en el comportamiento de rodadura, útil para enriquecer subpoblaciones en modelos preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja en la fase inicial del descubrimiento para orientar el desarrollo de ensayos y la generación de herramientas preclínicas, particularmente para dianas en las que la adhesión bajo flujo es un indicador funcional.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre interacciones receptor-ligando bajo flujo de cizalladura, aclarando las contribuciones mecanicistas al rodamiento celular.
- Selección: Proporciona métricas cuantitativas y estandarizadas de adhesión que permiten comparar líneas celulares o moduladores de receptores.
- Análisis: Genera distribuciones de la longitud de seguimiento del borde y de la velocidad de rodamiento, proporcionando una base estadística para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona la dinámica de rodamiento in vitro con la utilidad potencial en dispositivos de separación celular sin marcadores para el procesamiento de muestras preclínicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar el comportamiento celular mediado por adhesión en múltiples dianas y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos de separación basados en adhesión al cuantificar los parámetros de trayectoria bajo cizallamiento controlado.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la impresión por microcontacto estandarizada, el relleno posterior de receptores y el montaje estandarizado de la cámara de flujo.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de dispositivos al permitir la validación funcional temprana de los patrones de receptores.
- Impacto en el portafolio: Apoya las decisiones de continuar o descartar tecnologías de separación microfluídicas al proporcionar datos empíricos sobre el rendimiento de los patrones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en impresión por microcontacto, química de superficies y control de flujo microfluídico.
- Depende del acceso a microscopía óptica invertida, cámara de alta velocidad y herramientas de seguimiento de partículas basadas en MATLAB.
- Necesita la estandarización entre equipos en la fabricación de sustratos y en el reporte de condiciones de flujo para lograr reproducibilidad en múltiples sitios.
- La adaptación a tipos celulares alternativos requiere la validación de pares ligando-receptor y la optimización de los parámetros de esfuerzo cortante.
- Está limitado por la naturaleza transitoria de las interacciones en el borde celular, lo que restringe la reconstrucción completa de trayectorias y exige un análisis segmentado.
