Name: Electrofisiología del Escorpión Peg sensilla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende electrofisiología de sensilla en escorpiones mediante grabaciones extracelulares con aceite mineral. Este método permite aislar estímulos químicos en sensilas individuales para estudiar fisiología sensorial.

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Damos las gracias al fondo de la vida, de la Universidad de Oklahoma Programa de Licenciatura de Investigación de Oportunidades, y el Departamento de Zoología de la financiación de este trabajo. También agradecemos al Dr. Hoefnagels Mariëlle ayuda editorial.

1. Pre-registro, preparación de animales vivos <ol><li> Quitar el escorpión de su frasco en casa y colocarlo en un recipiente de vidrio pre-enfriado, al lado, coloque el frasco que contiene el escorpión en un entorno de congelación (-5 ° C) durante un mínimo de dos minutos. Este tiempo puede variar de acuerdo a la edad, tamaño, especie, etc de los específicos de escorpión en estudio. Pero, en general, la fase de congelación medio ambiente se completa una vez que el animal no se mueve. </li><li> Después de dos minutos, retire el inmovilizado escorpión del envase de vidrio en frío y luego colocar la parte ventral hacia arriba en un portaobjetos de microscopio. Asegurar el aguijón, cola, piernas y pedipalpos con la arcilla moldeable (a base de aceite, Van Aken Plastalina). </li><li> Hacer una plataforma en la que poner pectinas del escorpión. Ajustar la longitud de la plataforma y el ancho de acuerdo al tamaño de los géneros Pecten. Por lo general, nuestras plataformas están construidas con microscopio de vidrio cubierta y son aproximadamente 10 (L) x 18 (W) mm. </li><li> Se adhieren a doble cara cinta adhesiva a la plataforma de Pecten, el recorte de la cinta (si es necesario) para que quepa. </li><li> Para hacer que una cámara de pectinal, poner tres de los cuatro lados de la plataforma en la pre-fundido de cera (nosotros usamos la cera de abejas 100% de los chips) a una profundidad de 3-4 mm. Nos derretir la cera mediante la colocación de los chips en una placa de Petri de vidrio, que se encuentra en un plato caliente. Una vez que la cera en los bordes de la cámara de pectinal se enfría a temperatura ambiente, debe crear las paredes de cera alrededor de 1 mm de alto. </li><li> En el animal, localizar el punto de inserción pectinal, y coloque el borde sin encerar de la plataforma (la cinta de lado hacia arriba) justo por detrás de él. Después, estabilizar la plataforma (para que no se mueva más adelante) presionando suavemente su derecha e izquierda bordes periféricos en contra de la arcilla utilizada para restringir las patas del animal. </li><li> Use unas pinzas de punta fina para colocar con cuidado el Pecten o pectinas dentro de la cámara. En concreto, el uso de fórceps, mantenga el Pecten a lo largo de la columna vertebral pectinal, y pase suavemente el Pecten de debajo de la cubierta de vidrio y lo baja en el suelo de la plataforma adhesiva. Establecer un vínculo pecten-a-cinta con cuidado la aplicación de presión a la columna vertebral pectinal. </li><li> Ahora aplique la cera derretida (se utiliza una espátula de metal previamente calentado) hasta el borde sin encerar de la plataforma. El objetivo es doble, para asegurar el Pecten y para encerrar totalmente la cámara para la futura introducción de aceite mineral. Tenga cuidado al aplicar la cera sobre Pecten del animal, ya que es posible dañar el Pecten con la cera que está demasiado caliente. </li><li> La construcción de la cámara de Pecten se ha completado. A continuación, establecer una conexión con el electrodo indiferente hemolinfa de los animales mediante la inserción de un alambre de plata entre dos segmentos de la cola. </li></ol> 2. Grabación simultánea extracelular y estimulación química <ol><li> Nosotros preparamos los animales 24 horas antes de realizar extracelular, punta de las grabaciones, que, entre otras razones (es decir, el ajuste de los animales de posición fija), da tiempo a medida que las pipetas de un estimulante específico (sensillum-dependiente) la punta de diámetro. Nosotros usamos un extractor de micropipeta para el logro de dichas especificaciones. Idealmente, el diámetro de las pipetas es ≈ 2 m mayor que el diámetro de los poros sensillas. Nos ajustamos nuestras especificaciones micropipeta en consecuencia, para cada animal. </li><li> 1 h antes de la grabación, se añade 5 l de aceite mineral a la cámara de pectinal, sumergiendo el Pecten en aceite. Entonces, la posición del animal debajo de un microscopio de alta potencia, que durante mucho tiempo de trabajo los objetivos de la distancia y el epi-iluminación. </li><li> Para estimular la vinculación química sensilla, se introducen sustancias sápidas acuosa (es decir, ácido cítrico y sal) a través del medio de aceite. En primer lugar, se utiliza una micropipeta de relleno para inyectar el estimulante dentro de la pipeta estimulante. Nota: todas las soluciones estimulantes deben contener un electrolito de la conductancia eléctrica. </li><li> A continuación, después de colocar la pipeta estimulante en un micromanipulador (en el equipo de grabación), insertar el electrodo de registro en el extremo romo, abierto de la pipeta estimulante. Es importante asegurar el contacto entre el electrodo de metal y una solución electrolítica estimulante. </li><li> Una vez que la preparación es una toma de tierra (a través del electrodo indiferente), sólo inferior de la pipeta a través del medio del petróleo y en un poro sensillas. La duración de la estimulación química por sensillum pectinal puede variar de tanto como treinta minutos a tan sólo un segundo. Por lo general, se pueden degustar las clavijas múltiples (&gt; 30) por la pipeta. En el caso de que la pipeta estimulante se tapa con escombros minutos, simplemente el intercambio de la pipeta obstruida por una pipeta nueva, sin uso. </li></ol> 3. La preparación de un animal durante varios días de experimentación <ol><li> Si el animal se va a utilizar durante un período de tiempo prolongado, se recomienda volver a utilizar la cámara pectinal y sustitución de la gota de aceite mineral para cada sesión de grabación. Después de la sesión de un día determinado de la grabación, retire el animal de la grabación de puesta a punto y realizar un lavado de aceite mineral. </li><li> Especificacionesficamente, añadir una gota (5 l) de aceite mineral a la cámara, y retirar todo el aceite. Esto ayuda a minimizar la presencia del estimulante residual, que puede haberse escapado hacia fuera de la pipeta durante la sesión de grabación. </li><li> Antes de la sesión siguiente, agregue una gota de aceite como se describió anteriormente. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Dependiendo del aparato de control utilizado (por ejemplo, el amplificador en particular, la digitalización de hardware, etc), un resultado representativo es un registro extracelular con una S: N de al menos 3:1. Construcción exitosa de la cámara de aceite mineral es necesario para aislar a la estimulación química sensilla individual, ya que proporciona un medio para la entrega de químicos estimulantes del gusto polar (a base de agua) 8. Si hay muy poco aceite o ninguno en absoluto, la solución estimulante se extenderá desde el sensillum registrado a su sensilla vecinos, lo que es probable que cause una enfermedad prolongada y sin control de la estimulación química 8.

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
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<li>Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+scorpion+sensory+organs+II.+Pecten+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Br.+Arachnol.+Soc%22%5BJournal%5D)">The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla.</a> Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).</li>
<li>Carthy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+function+of+the+sensory+pegs+on+the+scorpion+pecten%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten.</a> Experientia. 22, 89-91 (1966).</li>
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<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

Anteriormente hemos publicado estos métodos en dos revistas, Knowlton y Gaffin (2009) y Knowlton y Gaffin (en prensa).

El protocolo anterior describe cómo preparar un desierto de pastizales escorpión (Paruroctonus utahensis) para el estudio electrofisiológico. En concreto, se muestra cómo construir una cámara para controlar extracelular punta de las grabaciones de las neuronas pectinal quimiosensoriales en aceite. Debido a que el petróleo y el agua no se mezclan, es posible aislar la estimulación química (con base de agua, estimulantes) para sensilla solo. Cabe destacar que P. utahensis, es un animal relativamente pequeño (≈ 2,5 a 5 cm) y la aplicación de este protocolo para los animales más grandes pueden requerir muchos ajustes de tamaño, tales como el tamaño de la plataforma del animal, de cámara, y la cantidad de aceite aplicada. Recomendamos la realización de estudios piloto para probar la mínima cantidad de aceite necesaria para la entrega controlada de los estimulantes químicos a base de agua. Además, no se encontraron efectos del petróleo sobre la actividad neural de referencia dentro de pectinal sensilla 8. Esto debe ser confirmado por los sistemas de otro modelo, así, antes de evaluar chemoresponsiveness. Este método puede ser utilizado en combinación con otro método para probar los efectos de interacción entre chemoresponse sensilla en el campo sensorial. Por ejemplo, es posible punta de registro (en aceite) de una sensillum como base-registro (a través de un electrodo de tungsteno) a partir de una sensillum vecinos 9. Tal configuración de la grabación se puede utilizar para evaluar si o no químicamente estimular una sensillum afecta a la actividad neuronal de la base de sensillum grabado. Hasta la fecha, nadie ha probado esto de escorpión pectinal sensilla, y sigue siendo una pregunta abierta para otros sistemas quimiosensoriales así. En resumen, creemos que el método de la punta de grabación en los avances de petróleo del alcance de las investigaciones electrofisiológicas en la base neural de gustation artrópodos. En este manuscrito, que proporcionan un protocolo para la preparación de animales para este método, y esperamos que proporciona una base sólida para un mayor estudio de los sistemas nervioso periférico sensorial.

<table><tbody><tr><td>Pestaña Lift-N-Press</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>Cinta adhesiva de doble cara</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>Llenador de micropipetas</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio estándar</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>Pipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Sostenedor de micr&amp;#8211;electrodos</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

electrofisiología del escorpión peg sensilla

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

Se describe una modificación de un 1,2 técnica existente punta de grabación para la investigación electrofisiológica corto, como clavijas sensorial sensilla 3,4. En la superficie ventral de la mitad de todos los escorpiones son dos apéndices llamados pectinas, que han densos campos de mecano-y quimiosensoriales clavija 5,6 sensilla. Un método para evaluar chemoresponsiveness de estos sensilla utiliza un electrodo de tungsteno para la grabación de la actividad neuronal extracelular dentro de un sensillum como un olor volátiles se introduce en el campo sensorial 5,7. Las limitaciones de este método incluyen la entrega de datos es lenta y la introducción descontrolada de estimulantes, y la eliminación de, el campo de tipo de cambio. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva punta de grabación de la técnica que utiliza el aceite mineral no polar como un medio a través del cual puedan entregar a base de agua estimulantes del gusto de cada clavija de 8,9 sensilla. Hemos aplicado con éxito este método para obtener chemoresponses sensillas al ácido cítrico, etanol, y la sal. A continuación se describe el protocolo experimental para un estudio de 9. Creemos que este nuevo método puede ser útil para el estudio de las propiedades de respuesta de otros sistemas de artrópodos quimiosensoriales, incluidos los de los insectos 10, 11 y 12 de crustáceos.

Este artículo describe un método electrofisiológico para aislar a la estimulación química sensilla individuales a través extracelular, punta-grabaciones en aceite mineral.

Electrofisiología del Escorpión Peg sensilla

Describimos una modificación de una técnica de registro con punta existente1,2 para investigar electrofisiológicamente sensilias sensoriales cortas en forma de clavija3,4. En la ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la fisiología quimiosensorial de las pegeas individuales en una pectina de escorpión. Esto se logra primero inmovilizando un escorpión anestesiado con el lado ventral hacia arriba sobre un portaobjetos de vidrio. Utilizando arcilla de modelar para el montaje, es necesario sumergir las pectinas en una cámara personalizada llena de aceite y preparar electrodos llenos con un estimulante químico.Las respuestas quimiosensoriales se registran en cada íla individual del pecten, lo que finalmente produce perfiles de respuesta similares a los estímulos químicos acuosos. Solíamos registrar desde la base de la íla mientras se aplicaban estímulos volátiles sobre los poros. La principal ventaja de la técnica de registro en la punta es que permite aislar la estimulación a un pílulo individual sin afectar la actividad de sus vecinos.Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la biología quimiosensorial, por ejemplo, ¿por qué los animales utilizan tantas sillas repetidas en la detección y percepción química? Los escorpiones pueden no parecer los animales más seguros para estudiar, sin embargo, no todas las especies son peligrosas o difíciles de manejar. Por ejemplo, los escorpiones de las praderas desérticas miden solo de cuatro a cinco centímetros de largo, son fáciles de mantener en el laboratorio y rara vez pican si se manipulan adecuadamente.Si es picado, el veneno activa artificialmente sus neuronas sensoriales, algunas de las cuales transmiten información sobre el dolor. La sensación suele disminuir en aproximadamente 15 minutos. Los escorpiones son sujetos resistentes y pueden soportar varios días de experimentación, volviendo a menudo a sus hábitats.Cuando el experimento haya finalizado y para inmovilizar al escorpión, colóquelo en un recipiente de vidrio previamente enfriado. Luego, coloque el frasco que contiene al escorpión en un entorno congelante durante un mínimo de dos minutos y retírelo del congelador cuando el animal esté inmóvil. Ahora, coloque al escorpión inmovilizado con el lado ventral hacia arriba sobre un portaobjetos de microscopio.Sujete las patas del aguijón y las patas pediformes con arcilla moldeable. Los peines del escorpión son estructuras pareadas similares a peines ubicadas cerca de los órganos sexuales y son únicas en estos animales. Se debe crear una cámara para contener un solo peine sin extraerlo del animal.Primero, prepare una plataforma para que la pectina encaje en una cubreobjetivo de vidrio cortado aproximadamente a cinco milímetros por 18 milímetros. Usualmente funciona bien. Segundo, adhiera cinta adhesiva de doble cara a la plataforma y recorte la cinta para ajustarla si es necesario.En tercer lugar, derrita algunas escamas de cera de abeja al 100 % en un recipiente de vidrio utilizando una placa calefactora. Sumerja ahora tres de los cuatro bordes de la plataforma en la cera derretida hasta una profundidad de tres a cuatro milímetros. La cera enfriada sirve como pared para formar una cámara.Ahora, coloque el borde libre de la plataforma justo posterior al punto de inserción pectoral en el animal. Estabilice la plataforma presionando suavemente sus bordes periféricos derecho e izquierdo contra la arcilla utilizada para restringir las patas del animal, usando pinzas de punta fina. Sujete cuidadosamente uno de los pectines a lo largo de la espina pectoral y sáquelo suavemente de debajo del cubreobjetivo, colocándolo luego sobre la superficie adhesiva de la plataforma.Sujete la pectina aplicando cuidadosamente presión sobre la espina pectal. Complete la cámara utilizando una espátula metálica precalentada para aplicar cera derretida al borde libre de la plataforma. Ahora el animal está casi listo para realizar grabaciones de electrofisiología.Ahora es un momento sencillo para realizar una conexión con un electrodo indiferente. Inserte un alambre de plata entre dos segmentos de la cola en la hemolinfa del escorpión. Presione una parte del alambre que sale del animal contra la arcilla para fijarlo y deje suficiente longitud para que alcance el amplificador.Deje ahora el preparado en reposo durante al menos una hora antes de realizar las grabaciones, para permitir que el preparado se estabilice. Utilice un tirador de micropipetas para fabricar pipetas con un diámetro interno aproximadamente dos micrones mayor que el diámetro del poro del sensor, el cual varía entre animales. Una hora antes de la grabación, llene la cámara de pectina con cinco microlitros de aceite mineral.Luego, coloque el animal debajo del microscopio de alta potencia con objetivos de larga distancia de trabajo e iluminación epifluorescente para estimular químicamente la pejilla. Cargue la pipeta del estimulante con sabores acuosos mezclados en una solución electrolítica. Utilizando un llenador de micropipetas, luego conecte la pipeta cargada con el estimulante a un micromanipulador.Ahora inserte el electrodo de registro en el extremo abierto de la pipeta del estimulante. Es importante asegurar el contacto entre el electrodo metálico y la solución electrolítica del estimulante. Conecte los cables de los electrodos de registro y indiferente a un amplificador diferencial.El amplificador está conectado a un osciloscopio para visualizar la actividad eléctrica y a un altavoz para detectar auditivamente los cambios eléctricos. La configuración ya está lista para realizar grabaciones. Con el micromanipulador, baje cuidadosamente la pipeta hasta un poro sensorial.Se escuchará un cambio hacia frecuencias más altas cuando se establezca el contacto eléctrico entre el electrolito de la pipeta y el fluido dentro del sensilo perforado. En ese momento, también se pueden escuchar claramente las descargas características de los potenciales de acción nerviosos. La duración de la estimulación química por sensilo puede variar desde hasta 30 minutos hasta tan solo un segundo.Por lo general, una pipeta puede muestrear más de 30 pernos. Reemplace las pipetas obstruidas por pipetas limpias. Las pipetas son fáciles de preparar y la obstrucción no es infrecuente, por lo que siempre mantenga pipetas adicionales listas para usar.Es posible realizar grabaciones de un solo animal durante varias horas en una sesión única antes de tener que cambiar el aceite mineral. Un solo animal puede mantenerse en su lugar en el sistema de grabación durante múltiples sesiones de grabación en varios días consecutivos. Para sesiones posteriores, reutilice la cámara pectoral, pero reemplace el aceite mineral.Simplemente retire todo el aceite antiguo con una pipeta y agregue una gota fresca. Esto ayuda a minimizar la presencia de estimulante residual, que podría haberse filtrado de la pipeta de estimulante durante la sesión de grabación. A continuación se muestran grabaciones representativas en la punta con diferentes estimulantes.Este trazado muestra una respuesta relativamente constante a cloruro de potasio 0.01 molar. Esta púa envía una respuesta al ácido cítrico 0.1 molar que comienza con mucha más intensidad y luego disminuye en intensidad en una fracción de segundo, seguida de una cierta reducción en frecuencia. En una respuesta típica al etanol al 30%, el trazado muestra ráfagas con múltiples picos entre breves intervalos de inactividad al comparar grabaciones del ápice de diferentes respuestas del sensor al mismo estimulante, como el ácido cítrico 0.1 molar.Las respuestas son muy similares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar llenar la pipeta con un estimulante a base de agua, que no se mezcla con el medio oleoso y permite estimular químicamente un lum a la vez. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimular de manera controlada CIN individuales en un pecten de escorpión utilizando aceite mineral como medio.

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Con el fin de observar la ultraestructura de los insectos sensilla, se presentó en el estudio el protocolo de preparación de muestras de escaneo y transmisión electrónica (SEM y TEM, respectivamente). Se añadió Tween 20 en el fijador para evitar la deformación de la muestra en SEM. La microscopía de fluorescencia fue útil para mejorar la precisión del corte en TEM.

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Un método de registro electrofisiológico poco utilizado, el registro de base, permite el análisis de las características de la codificación del gusto que no pueden ser examinadas por los métodos convencionales de registro. El registro de la base también permite el análisis de las respuestas gustativas a estímulos hidrofóbicos que no pueden estudiarse con los métodos electrofisiológicos tradicionales.

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Este estudio presenta una manipulación quirúrgica para exponer el T-DRG en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo , junto con registros sincrónicos de ECG. Este método representa una herramienta de vanguardia para estudiar la estimulación de los nervios eléctricos periféricos y las entradas de los órganos viscerales torácicos, así como sus interacciones a nivel sensorial primario.

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