La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

El objetivo general del siguiente experimento es refinar la expresión de GAL cuatro mediante el uso de lipasa específica de tejido con herramientas de conversión de GAL 80. Esto se logra generando una colección de líneas de moscas transgénicas Philippe y determinando el patrón de expresión de lipasa en el SNC en cada línea. Usando un reportero de GFP, los informes de INMUNOQUÍMICA y GFP pueden diferenciar la GL de la expresión neuronal para intersectar la expresión de GAL cuatro en líneas de interés ET líneas de cambio a través de las moscas que contienen una herramienta de conversión GAL 80 en la progenie.

El análisis clonal se puede utilizar para analizar el refinamiento de la expresión de GAL cuatro, como en el ojo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que las líneas basadas en el juego de pistas mejoradoras junto con las herramientas de conversión GAL 80 se pueden utilizar con una colección rápida de GAL four alliance ya disponible en la comunidad de moscas. Además, este concepto puede ampliarse a otros organismos modelo emergentes de GALI cuatro UAS, como el pez cebra.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el mapeo de circuitos neuronales subyacentes al comportamiento. Aunque este protocolo demuestra el uso de la base volteada en un subconjunto de células fotorreceptoras, el método interseccional se puede aplicar al análisis de otros tejidos, incluidos los tejidos no neuronales. A medida que más se caracterizan las líneas de lipasa de la trampa potenciadora.

La gota es una técnica importante ampliamente utilizada por los biólogos de moscas. Una advertencia de la mayoría de las cuatro líneas de GAL es que se expresa de manera demasiado amplia para ser utilizada para el mapeo del comportamiento cerebral utilizando los métodos de los dedos. No es posible afinar la expresión de GAL cuatro en camisetas de interés antes de usar un transgén ET flip para restringir parcialmente la expresión de GAL cuatro líneas de expresión.

En primer lugar, es útil conocer el patrón de expresión del transgén ET flip x dos en la etapa tardía en desarrollo de la lava y en los adultos visualizar la expresión de flip a En el SNC se establece un cruce entre machos con el transgén ET t flip X dos de interés y hembras vírgenes que albergan un reportero de GFP para la expresión de et flip de la progenie. Recoge larvas errantes de tercer estadio F1 para su disección. Colóquelos en un plato protector S limpio y elimine cualquier residuo con un pincel y enjuague el plato una vez con una vez PBS.

Ahora llene el plato con hielo frío una vez PBS para anestesiar las larvas para acceder al SNC de una lava, sostenga su gancho bucal con un par de pinzas. Agarra la cutícula cerca de la esférica anterior que se extiende y pélala hacia atrás. El SNC permanece unido al gancho bucal junto con algunas otras estructuras.

Ahora, con fórceps, retira todo el exceso de estructuras que rodean el SNC a medida que diseccionas el SNC. Transfiéralos individualmente a un plato Pyrex de tres mundos lleno de PBS. Una vez diseccionados todos los SNC, fíjalos sumergiéndolos completamente en 200 microlitros de PFA al 4% sobre hielo.

Si un SNC flota, no se ha limpiado completamente de todo el tejido circundante. En caso de que esto ocurra, use un par de pinzas para volver a sumergir el SNC en el fijador después de la fijación durante 15 minutos, lave el tejido con PB S3 helada varias veces y luego lave el tejido tres veces más con PBT helado. El tejido ahora está listo para ser visualizado o marcado por anticuerpos o almacenado en PBT a cuatro grados Celsius para más tarde.

La tinción de la misma cruz utilizada para hacer que las larvas recojan adultos F1 antes de la disección. Sumergió de cinco a 10 moscas y enfrió etanol al 95% durante 30 segundos para eliminar la cera de la superficie de la cutícula. Para eliminar el etanol, lave a los adultos tres veces con hielo frío una vez PBS y después del tercer lavado, transfiera uno de ellos a un plato protector de sil de 35 milímetros lleno de hielo frío una vez PBS para preparar a un adulto para la disección.

Colócalo con el lado ventral hacia arriba e inserta un alfiler de minion a mitad de camino a través del abdomen. Comience a diseccionar usando fórceps para quitar las patas. A continuación, retira la cutícula de la cabeza asegurándola en los accesorios y, al mismo tiempo, pelando la cutícula desde debajo del ojo hacia la parte superior de la cabeza.

Con cuidado, con pinzas afiladas, retire y rastree los tejidos que rodean el cerebro porque los tejidos de la pista tienen una fuerte autofluorescencia y hace que el cerebro flote durante la fijación. El cerebro es solo una parte del SNC adulto. La otra parte es el cordón nervioso ventral o VNC en el tórax y también debe ser diseccionado.

Primero, retire la cutícula torácica asegurando la mosca en la base de la pata trasera y tirando suavemente de la cutícula torácica hasta la base del cuello. En segundo lugar, para exponer el VNC, extienda suavemente las dos mitades de la cutícula torácica. En tercer lugar, retire el abdomen del tórax asegurándolo en la base de la segunda pierna y alejando el abdomen desde cerca de la primera noche de agitación abdominal.

En cuarto lugar, limpie el VNC asegurándolo en el área humeral y arrancando suavemente el tejido que rodea el VNC. Desgarre el anillo de tejido conectivo que rodea el conectivo cervical y continúe eliminando el exceso de tejido a medida que recoge el cerebro. Y VNC los transfiere como peras a un plato de Pyrex de nueve mundos lleno de helado una vez que PBS se mantiene en hielo.

Para fijar los tejidos adultos, sumérjalos en 4% de PFA sobre hielo durante 15 minutos. Después del baño, haga tres lavados de PBS con agua fría y tres lavadoras de PBT. El tejido ahora está listo para ser visualizado o marcado por anticuerpos para analizar la expresión del transgén con precisión.

Es útil etiquetar el SNC con marcadores neuronales o gliales para proporcionar un marco de referencia, comenzando por incubar el tejido a cuatro grados centígrados durante la noche con anticuerpos contra las neuronas o la glía al día siguiente. Lavar la preparación cinco veces con PBT e incubar con el anticuerpo secundario fluorescente a temperatura ambiente durante dos horas. Envuelva la placa y el papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo del anticuerpo cuando termine la incubación.

Lave la preparación con PBS y monte toda la preparación en un portaobjetos. Use un anillo de plástico de OSHA para evitar que el tejido sea aplastado por el cubreobjetos. El sistema nervioso ahora está listo para ser examinado en busca de patrones de expresión de GFP y LL bajo un microscopio fluorescente.

Por lo general, se examinan de tres a cinco réplicas para determinar la reproducibilidad del patrón de expresión invertido. El patrón de expresión de flip en el flip, una línea se puede utilizar junto con otros transgenes para cambiar la forma en que se expresa el represor GAL 4 GAL 80. Cambiar la expresión del represor GAL 80 es un método eficaz para realizar cambios.

En la expresión de GAL cuatro, un método es cambiar la expresión de GAL 80 con la expresión transgénica de GAL 80 que inactiva GAL cuatro, que de otro modo impulsa la degeneración ocular en todo el ojo. El hash de línea invertida ET 6 88 A se utiliza aquí para evaluar la eficacia de la herramienta de conversión GAL 80 en un subconjunto de fotorreceptores en la progenie F1, comparando el fenotipo del ojo con el fenotipo del ojo de las cepas parentales. Cualquier aparición de deformidad o despigmentación ocular confirma que el patrón de expresión flip está presente en los fotorreceptores y GAL 80 flipout fue exitoso.

Una estrategia complementaria no redundante es voltear la expresión GAL 80 utilizando la misma línea de inversión de interés. Esta estrategia es muy similar a la otra, pero ahora se suprime la pigmentación y degeneración del ID en la progenie F1. En el flip X dos.

Una vez dominada, la disección del SNC se puede realizar en aproximadamente cinco minutos para los adultos y un minuto para las larvas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante usar pinzas afiladas para extirpar la tráquea y el tejido que rodea tanto a los adultos como a los Libre C, y Ss.It es importante usar un plato sin fijadores para la disección. El volteo de choque térmico se utiliza actualmente para generar clones aleatorios.

Por el contrario, el volteo de trampas potenciadoras permite generar clones reproducibles, lo que facilita el análisis morfológico y conductual. Otro punto fuerte del método de los dedos es que se pueden restringir aún más los patrones de expresión de GAL cuatro mediante el uso de líneas adicionales basadas en el flip de la trampa anan y otras líneas gal. Una debilidad de la configuración de tope de tubulina GAL 80 es que ciertas combinaciones de efectos GA cuatro y UAS como LAG cuatro y U-A-S-K-I-R no son compatibles porque matarán a las moscas.

Este problema se puede superar fácilmente mediante el uso de un efector UAS condicional, como UAS Shiri Ts, que permite examinar un comportamiento a temperaturas restrictivas como se espera. No todas las líneas de lipasa de trampa potenciadora expresarán niveles lo suficientemente altos de lipasa como para ser útiles. No obstante, la técnica del dedo descrita aquí proporciona un nuevo enfoque para que los investigadores de Drosophila refinen el análisis de mosaicos, ya sea para los circuitos de desarrollo o el comportamiento.