Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

Una técnica es descrita para cuantificar la respuesta in vivo fisiológicas de las neuronas de mamíferos durante el movimiento y correlacionar la fisiología de las neuronas con morfología neuronal, fenotipo neuroquímicos y microcircuitos sináptica.

El objetivo general de este procedimiento es registrar la respuesta fisiológica de las neuronas individuales durante el movimiento y caracterizar aún más la morfología y la neuroquímica de estas neuronas. Esto se logra primero anestesiando y preparando quirúrgicamente al animal. El siguiente paso es registrar electrofisiológicamente la respuesta intracelular de las neuronas individuales durante el movimiento.

Después de perfundir al animal y procesar el cerebro, el paso final es visualizar y analizar la respuesta fisiológica y la morfología neuronal. En última instancia, las técnicas de registro neuronal intracelular, inmunoquímica y análisis se combinan para mostrar las modulaciones en el potencial de membrana de neuronas individuales durante el movimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cultivo celular, es que se conservan las conexiones neuronales y las entradas sinápticas, y las neuronas no se autotomizan ni se colocan en medios artificiales. El día anterior, el experimento inyecta un trazador neuronal, como el rábano de indias, peroxidasa en las regiones diana periféricas para etiquetar las neuronas motoras retrógradas.

Al día siguiente, anestesiar a la rata y colocarla en una almohadilla térmica, afeitar la piel, cubrir la parte posterior del cráneo con tijeras de cortar animales utilizando una técnica aséptica. Haga una incisión a lo largo de la parte interna del muslo, inserte una cánula en la vena femoral para anestesia adicional. Inserte otra cánula en la arteria femoral para controlar la presión arterial.

Finalmente, inserte una cánula en la tráquea. A continuación, coloca a la rata en un marco estereotáxico. Realizar una craneotomía para exponer el cerebelo, teniendo cuidado de evitar el gran seno venoso ubicado directamente debajo de la unión entre los huesos parietal e interparietal.

A continuación, cubra la superficie del cerebro con aceite mineral calentado. Ahora pega la mandíbula a una varilla acoplada a un vibrador electromagnético. El movimiento de la mandíbula se controla mediante señales de comando al vibrador desde un generador de señales.

A continuación, coloque un electrodo de conexión a tierra debajo de la piel adyacente a la craneotomía. Para prepararse para los electrodos intracelulares, tire y llene los microelectrodos con una solución de colorante IDE o de varilla de tetraetilo Domine. Esa impedancia del electrodo es de 60 a 80 mega ohmios para axones de gran diámetro y de 80 a 150 mega ohmios para axones aferentes pequeños e interneuronas.

A continuación, coloque el microelectrodo en la etapa de la cabeza del electrómetro utilizando un pequeño telescopio que se fija en su posición detrás de la cabeza del animal. Visualice el microelectrodo a través del redle cerrado de 20 x del telescopio. El área objetivo es de aproximadamente 0,5 milímetros hasta el borde inferior del colículo inferior.

Ahora haga una pequeña abertura en la piamadre para permitir la ubicación precisa de la superficie del cerebro. Compensa en exceso la retroalimentación de capacitancia para que cuando el electrodo toque el cerebro, se produzca una señal de retroalimentación. Avance el electrodo hasta que ingrese al cerebro.

El siguiente paso es activar el desplazamiento repetido de la mandíbula. Luego, usando un motor paso a paso, avance el electrodo hacia el cerebro. Cuando un empalamiento neuronal está indicado por una caída repentina en el potencial de CC y una actividad sináptica en curso, deje de avanzar el electrodo.

Cuando la penetración se considere estable, inicie la rampa y la retención y los movimientos sinusoidales de la mandíbula. Registre la respuesta neuronal y caracterice la neurona en función de su respuesta. A continuación, para mapear el campo receptivo de la neurona, use una sonda roma para explorar la piel alrededor de la cabeza y la cavidad intraoral.

Explora la respuesta de la neurona a otros estímulos como la contracción muscular o los estímulos nocivos. Cuando se completen las grabaciones, inyecte de uno a cuatro nanoamperios de corriente continua para una inyección total de 15 a 70 nanoamperios por minuto. Controle la penetración del electrodo e interrumpa la inyección de corriente.

Si el potencial de membrana se vuelve más positivo que menos 30 milivoltios, el siguiente paso es seccionar el tejido cerebral. Después de sacrificar y perfundir al animal, extraiga el cerebro. A continuación, corte secciones de 50 a 100 micras en el plano frontal, sagital u horizontal.

Para visualizar la relación entre la neurona sensorial marcada y una variedad de neuronas motoras, procese el tejido para H-R-P-D-A-B o rojo de Texas, dependiendo del tejido, se pueden realizar análisis adicionales con un microscopio fluorescente o confocal o utilizando software de colocalización cuantitativa. Según se desee, se puede realizar un procesamiento inmunoquímico para que la sinaptofisina localice con precisión las sinapsis dentro de las neuronas marcadas. Esta figura muestra una neurona del tronco encefálico a la que se le inyectó IDE después de la caracterización electrofisiológica.

Sobre la base de la respuesta neuronal durante el movimiento, esta neurona se puede identificar como una neurona aferente del huso muscular secundario. El contorno marrón indica la ubicación del núcleo motor del trigémino. Esta figura muestra la respuesta fisiológica de una neurona sensorial durante el desplazamiento de la mandíbula.

La respuesta de la neurona se representa como frecuencia de disparo instantánea. Tenga en cuenta que la respuesta imita de cerca el desplazamiento mandibular, lo que indica que esta neurona en particular proporciona retroalimentación sensorial relacionada con la posición mandibular. Esta figura muestra una neurona sensorial que respondió durante el sondeo muscular.

La neurona se tiñó con ide después del procesamiento inmunoquímico. Los bastones sinápticos, que aparecen como hinchazones rojas, se ven colocalizados con la sinaptofisina amarilla. El verde es una mancha fluorescente para misiles.

Esta figura es una animación de un axón de una neurona aferente primaria del huso muscular. Se utilizaron múltiples secciones ópticas de la neurona etiquetada para generar la animación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electromicroscopía, la microscopía confocal y el marcaje neuronal de grado anterior o retrógrado para responder preguntas adicionales sobre las características ultraestructurales de la colocalización neuronal de los neurotransmisores con bns sinápticos y la conectividad neuronal.