Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento
21 de abril de 2011
Una técnica es descrita para cuantificar la respuesta in vivo fisiológicas de las neuronas de mamíferos durante el movimiento y correlacionar la fisiología de las neuronas con morfología neuronal, fenotipo neuroquímicos y microcircuitos sináptica.
El objetivo general de este procedimiento es registrar la respuesta fisiológica de neuronas individuales durante el movimiento y caracterizar además la morfología y la neuroquímica de estas neuronas. Esto se logra primero anestesiando y preparando quirúrgicamente al animal. El siguiente paso consiste en registrar electrofisiológicamente la respuesta intracelular de neuronas individuales durante el movimiento.
Después de perfundir el animal y procesar el cerebro, el paso final consiste en visualizar y analizar la respuesta fisiológica y la morfología neuronal. En última instancia, las técnicas de registro neuronal intracelular, inmunoquímica y análisis se combinan para mostrar las modulaciones en el potencial de membrana de neuronas individuales durante el movimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo celular es que se conservan las conexiones neuronales y las entradas sinápticas, y las neuronas no se encuentran exautotomizadas ni colocadas en medios artificiales. El día anterior, el experimento inyecta un trazador neuronal, como la peroxidasa de rábano picante, en regiones diana periféricas para etiquetar de forma retrógrada las neuronas motoras.
Al día siguiente, anestesie la rata y colóquela sobre una almohadilla calefactora, ase el área de la piel sobre el cráneo posterior con cortadoras para animales utilizando técnica aséptica. Haga una incisión a lo largo del muslo interno, inserte una cánula en la vena femoral para administrar anestesia adicional. Inserte otra cánula en la arteria femoral para monitorear la presión arterial.
Finalmente, inserte una cánula en la tráquea. A continuación, coloque la rata en un marco estereotáxico. Realice una craneotomía para exponer el cerebelo, teniendo cuidado de evitar el seno venoso grande ubicado directamente debajo de la unión entre los huesos parietales e interparietales.
A continuación, cubra la superficie del cerebro con aceite mineral tibio. Ahora pegue la mandíbula a una varilla acoplada a un vibrador electromagnético. El movimiento de la mandíbula se controla mediante señales de comando al vibrador procedentes de un generador de señales.
A continuación, coloque un electrodo de tierra bajo la piel adyacente a la craneotomía. Para preparar los electrodos intracelulares, tire y llene microelectrodos con una solución del colorante IDE o tetraetilrodamina. La impedancia del electrodo es de 60 a 80 megaohmios para axones de gran diámetro y de 80 a 150 megaohmios para axones aferentes pequeños e interneuronas.
A continuación, coloque el microelectrodo en la etapa de cabeza del electrometro utilizando un pequeño telescopio fijado en posición detrás de la cabeza del animal. Visualice el microelectrodo a través del ocular rojo cerrado de 20 x del telescopio. El área objetivo se encuentra aproximadamente a 0,5 milímetros del borde inferior del colículo inferior.
Ahora haga una pequeña abertura en la piamadre para permitir la localización precisa de la superficie del cerebro. Sobrecorrija la realimentación de capacitancia de modo que, cuando el electrodo toque el cerebro, se produzca una señal de retroalimentación. Avance el electrodo hasta que entre en el cerebro.
El siguiente paso consiste en activar el desplazamiento repetido de la mandíbula. Luego, utilizando un motor paso a paso, avance el electrodo hacia el cerebro. Cuando un implante neuronal se indique por una caída repentina en el potencial de corriente continua y por actividad sináptica en curso, detenga el avance del electrodo.
Cuando se considere que la penetración es estable, inicie movimientos rampa y mantenidos, así como movimientos sinusoidales de las mandíbulas. Registre la respuesta neuronal y caracterice la neurona según su respuesta. A continuación, para mapear el campo receptivo de la neurona, utilice una sonda roma para explorar la piel alrededor de la cabeza y la cavidad intraoral.
Explore la respuesta del neutrón a otros estímulos, como la contracción muscular o estímulos nocivos. Cuando las grabaciones estén completas, inyecte de uno a cuatro nanoamperios de corriente continua durante un tiempo total de inyección de 15 a 70 nanoamperios-minuto. Monitoree la penetración del electrodo y suspenda la inyección de corriente.
Si el potencial de membrana se vuelve más positivo que menos 30 milivoltios, el siguiente paso es seccionar el tejido cerebral. Después de sacrificar y perfundir al animal, retire el cerebro. Luego corte secciones de 50 a 100 micrones en el plano frontal, sagital u horizontal.
Para visualizar la relación entre la neurona sensorial marcada y una variedad de neuronas motoras, procese el tejido con H-R-P-D-A-B o rojo Texas, según el tejido; se pueden realizar análisis adicionales con un microscopio fluorescente o confocal o mediante software cuantitativo de colocalización. Si se desea, se puede realizar un procesamiento inmunoquímico para sinaptofisina con el fin de localizar con precisión las sinapsis dentro de las neuronas marcadas. Esta figura muestra una neurona del tronco encefálico que fue inyectada con IDE tras la caracterización electrofisiológica.
Basándose en la respuesta neuronal durante el movimiento, esta neurona puede identificarse como una neurona aferente del huso muscular secundario. El contorno marrón indica la ubicación del núcleo motor del trigémino. Esta figura muestra la respuesta fisiológica de una neurona sensorial durante el desplazamiento de la mandíbula.
La respuesta del neurona se representa como frecuencia instantánea de disparo. Obsérvese que la respuesta imita de cerca el desplazamiento mandibular, lo que indica que esta neurona en particular proporciona retroalimentación sensorial relacionada con la posición mandibular. Esta figura muestra un neurona sensorial que respondió durante la exploración muscular.
La neurona fue teñida con ide tras el procesamiento inmunoquímico. Los botones sinápticos que aparecen como hinchazones rojas se observan co-localizados con la sinaptofisina amarilla. El verde es una tinción fluorescente de misil.
Esta figura es una animación de un axón de una neurona aferente primaria del huso muscular. Se utilizaron múltiples secciones ópticas de la neurona marcada para generar la animación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como electro microscopía, microscopía confocal, y marcado neuronal anterógrado o retrógrado para responder preguntas adicionales sobre las características ultraestructurales de la neurona, la colocalización de neurotransmisores con sinapsis y la conectividad neuronal.
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Resumen
Este artículo describe una técnica para cuantificar la respuesta fisiológica in vivo de neuronas de mamíferos durante el movimiento. Correlaciona la fisiología neuronal con la morfología, el fenotipo neuroquímico y la microcircuitría sináptica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Neuroanatomía
Antecedentes
- Registrar las respuestas fisiológicas de las neuronas es fundamental para comprender su función.
- Los métodos existentes suelen interrumpir las conexiones neuronales.
- Esta técnica preserva el entorno natural de las neuronas.
- Se utilizan trazadores neuronales para marcar neuronas específicas y estudiarlas.
Objetivo del estudio
- Registrar la respuesta fisiológica de neuronas individuales durante el movimiento.
- Caracterizar la morfología y neuroquímica de estas neuronas.
- Analizar la relación entre la actividad neuronal y la estructura.
Métodos Utilizados
- Anestesiar y preparar quirúrgicamente al animal.
- Grabación electrofisiológica de respuestas intracelulares durante el movimiento.
- Perfundir al animal y procesar el cerebro para su análisis.
- Visualizar y analizar la morfología neuronal y las respuestas fisiológicas.
Resultados principales
- Se demostraron modulaciones en el potencial de membrana de las neuronas durante el movimiento.
- Se mostraron conexiones neuronales e insumos sinápticos preservados.
- La combinación de técnicas proporcionó información sobre el comportamiento neuronal.
- Se destacaron las ventajas frente a los métodos tradicionales de cultivo celular.
Conclusiones
- Esta técnica ofrece un enfoque novedoso para estudiar la fisiología neuronal in vivo.
- Mejora la comprensión de la relación entre la actividad neuronal y la morfología.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar diversas funciones neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender cómo responden las neuronas individuales durante el movimiento es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Esta técnica permite obtener información mecanicista al correlacionar la actividad fisiológica con la morfología y la neuroquímica en circuitos intactos, lo que refuerza la confianza predictiva en el compromiso de la diana. Aborda una brecha clave en la investigación sensoriomotora donde los métodos estáticos o extracelulares no logran capturar la dinámica funcional durante el comportamiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas al vincular los patrones de disparo neuronal durante el movimiento con tipos celulares y vías específicas.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la observación directa de la modulación neuronal en condiciones fisiológicamente relevantes.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los objetivos al caracterizar los fenotipos neuroquímicos y la conectividad sináptica de las neuronas moduladas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas neuronales validados con respuestas fisiológicas cuantificadas para la selección de compuestos posteriores.
- Reproducibilidad: Estandariza la caracterización morfológica y neuroquímica para garantizar lecturas consistentes entre experimentos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma al permitir un mapeo neuronal detallado que puede combinarse con inmunoquímica o microscopía electrónica para análisis multiplexados.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traductiva: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al preservar la circuitría nativa durante estudios de movimiento in vivo.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Disminuye la ambigüedad en la función del objetivo al correlacionar la actividad con características ultraestructurales y entradas sinápticas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones de continuar/no continuar mediante un perfilado neuronal integral que respalda la alineación de biomarcadores y la validación de rutas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la caracterización preclínica, al proporcionar datos estructurales y funcionales sobre las neuronas activas durante el movimiento.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al registrar respuestas intracelulares durante comportamientos motores definidos, como el movimiento de la mandíbula.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante la visualización y cuantificación reproducibles de la morfología neuronal y la modulación fisiológica.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas del potencial de membrana y datos de colocalización neuroquímica que permiten la comparación objetiva de estados neuronales.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al preservar la microcircuitría sináptica, posibilitando la continuidad desde la respuesta fisiológica hasta la validación estructural.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de caracterización reutilizable, aplicable a sistemas sensoriales, motores e interneuronales en diversos modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la correlación de fisiología, morfología y neuroquímica.
- Valor operativo: Garantiza estandarización y reproducibilidad mediante preparación quirúrgica fija, protocolos de electrodos y pasos de procesamiento de tejidos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos de dianas mediante la caracterización exhaustiva de neuronas in vivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos multimodales que informan las decisiones de selección y avance de dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología intracelular, preparación quirúrgica y técnicas de inyección de trazadores neuronales.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo electrometros, generadores de señales, motores paso a paso y sistemas de microscopía para imágenes de luz, electrónica o confocal.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de anestesia, métodos de perfusión y corte de tejidos para garantizar la consistencia de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar la técnica a diferentes tipos neuronales o regiones cerebrales más allá del sistema trigeminal.
- Está limitado por la dificultad técnica de mantener grabaciones intracelulares estables durante el movimiento, lo cual depende de la impedancia del electrodo y de la estabilización del cerebro.
