Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Este experimento está diseñado para identificar proteínas que se unen a lípidos y para analizar la interacción entre proteínas y lípidos en un entorno de membrana definido. Las proteínas de lisado celular se incuban con vesículas lipídicas recién preparadas a partir de fosfatidilserina y ceramida. A continuación, se añaden perlas magnéticas conjugadas con Xin V a la mezcla de reacción para anclar las proteínas asociadas a las vesículas lipídicas a las perlas magnéticas. Posteriormente, las vesículas lipídicas con proteínas se purifican mediante clasificación magnética de células activadas.

Para identificar los resultados demostrados de la proteína unida al lípido, utilice la técnica de inmunotransferencia SDS-PAGE para mostrar la purificación Lyx de la PKC atípica endógena y recombinante y un dominio específico de unión a ceramida expresado en células MDCK. La principal ventaja de esta técnica novedosa frente a métodos existentes como ELISA o la espectroscopía de resonancia de plasmón superficial para la unión a superficies, es que la interacción entre lípido y proteína se lleva a cabo en un entorno similar a una membrana y que las proteínas ligadas pueden purificarse y analizarse. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de enfermedades que involucran lípidos, ya que en estas enfermedades la interacción fisiológica entre lípidos y proteínas está alterada.

Para algunas de estas enfermedades, los blancos proteicos ni siquiera se conocen y deben identificarse. Para diseñar una terapia basada en lípidos, comience con liposomas preparados a partir de una mezcla seca de cantidades equimolares de fosfatidilserina y ceramida C16 en 100 microlitros de tampón sical. Somete a ultrasonido durante una hora tras añadir 300 microlitros de tampón iCal, suplementado con cloruro de manganeso 0,1 milimolar. Centrifuga las muestras a 12 000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y luego resuspende el sedimento de vesículas lipídicas grandes en 100 microlitros de tampón sical. Añade un nanomolar de colorante fluorescente vibrant cm DII e incuba a 37 grados Celsius durante una hora para facilitar la visualización de la fracción SLE tras la separación máxima. Recupera un sedimento rosa de fosfato teñido con vibrant cm DAI, liposomas de ceramida siriana, mediante centrifugación y resuspende en 100 microlitros de tampón tris.

A continuación, para preparar un lisado celular libre de detergentes, sonicar las células en 300 microlitros de tampón hipertónico de 10 milimolar de tris, cloruro de hidrógeno que contenga inhibidores de proteasa y fosfatasa y centrifugar. Para eliminar los restos membranosos, añadir ahora el lisado celular claro a la suspensión física de lípidos e incubar la mezcla durante dos horas a cuatro grados Celsius. Dado que los lisados celulares pueden contener membranas endógenas con fosfatidilserina, se recomienda eliminar estas membranas del lisado mediante pasos adicionales de centrifugación.

Suplemente la mezcla de reacción con 20 microlitros de un tampón de unión XNV y 50 microlitros de una solución que contiene perlas magnéticas conjugadas con XNV; incube durante una hora a cuatro grados Celsius y realice la clasificación magnética de células activadas según lo recomendado en el protocolo del fabricante. A continuación, supervise la fluorescencia vibrante de CM DII en las fracciones de flujo y elución utilizando un lector de fluorescencia de microplacas para determinar la presencia y cantidad de les lipídicos en un ensayo de competencia de anticuerpos. Para verificar la especificidad de la reacción de unión de A PKC con las vesículas de ceramida fosfo Serina, incube un microgramo del anticuerpo policlonal de conejo anti P KC Zeta con un lisado celular durante una hora a cuatro grados Celsius, seguido de la incubación con las vesículas lipídicas.

Continúe con el análisis por electroforesis SDS-PAGE e inmunotransferencia de la unión proteica a los serinles de fosfoceramida en el eluido máximo para la reconstrucción in vitro de un complejo de polaridad lípido-proteína. Comience con la preparación de un precipitado rosado de vesículas de fosfoceramida serina marcadas con CM-DII brillante, como se mostró anteriormente; re suspenda las vesículas en 100 microlitros de tampón tri, suplementado con 100 micromolar de GTPγS, un milimolar de GDP y una combinación de proteínas recombinantes de interés. A continuación, incube la reacción a cuatro grados Celsius durante tres horas. Luego, agregue cinco microlitros de una solución stock 20x de un tampón X en V y 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con X en V.

Incubar la mezcla con agitación suave durante otros 30 minutos a cuatro grados Celsius. Continuar realizando la clasificación magnética de células activada NX NV según lo recomendado por el protocolo del fabricante para facilitar la precipitación. Suplementar la fracción de elución con 10 microgramos de albúmina e pura.

Concentre las proteínas mediante precipitación con flúor de weyl. La fase inferior consiste en cloroformo-metanol con cm dii vibrante enriquecido. La fase intermedia marronosa contiene las perlas magnéticas y las proteínas precipitadas.

Cuantifique las vesículas lipídicas ellu mediante la detección del colorante rosa y brillante cm dii en la fase orgánica de cloroformo-metanol de la reacción weyl flu. Utilice cantidades iguales de vesículas lipídicas para normalizar las cantidades de proteína entre muestras y analice mediante electroforesis SDS-PAGE. Inmunoensayo tipo blot.

Un lisado libre de detergente de células MDCK que expresan la PKC Zeta de longitud completa con su extremo C-terminal unido a una proteína verde fluorescente o a un dominio de unión a ceramida. En el extremo C-terminal de la PKC Zeta se incubó con fosfoserina.

Después de la elución de la columna Max, las proteínas se analizaron mediante inmunotransferencia. El fragmento de unión a ceramida C20 Zeta, EGFP y la proteína quinasa C zeta de longitud completa se recuperaron del EIT de la columna Max, lo que concuerda con la especificidad y eficacia del procedimiento lyx. El control negativo EGFP, que no se unió al fosfato ni a nuestras vesículas de ceramida siria, no fue detectable en el EIT.

Cuando Linx se complementa con otros métodos como electroforesis SDS-PAGE y transferencia western o análisis proteómico, se pueden responder preguntas adicionales, como qué proteínas forman parte del complejo de proteínas ligadoras de lípidos. Tras su desarrollo, LabX ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de lípidos individuales exploren la apoptosis inducida por ceramidas y la polaridad celular en células madre neurales y células epiteliales.