Alto Rendimiento de medición y clasificación de P orgánico en las muestras ambientales

El objetivo general de este procedimiento es clasificar el fósforo orgánico hidrolizado por enzimas en extractos de muestras de suelo o estiércol. Esto se logra primero extrayendo las muestras con una solución de hidróxido de sodio y EDTA y ajustando el pH de los extractos. Luego, incube estos extractos ajustados con dos soluciones enzimáticas diferentes.

En una placa de 96 pocillos, el paso final consiste en medir el ortofosfato liberado por la enzima mediante colorimetría del azul de molibdeno. En última instancia, la mayoría de las formas nativas de fósforo de éster mono de ortofosfato y de fósforo diéster pueden clasificarse en muestras de suelo o de estiércol basándose en la liberación diferencial de ortofosfato mediante el método de hidrólisis enzimática. Este método puede realizarse de forma económica en cualquier laboratorio estándar.

La principal ventaja que tiene sobre métodos existentes como la espectroscopía de resonancia magnética nuclear de fósforo 31 es que puede medir el potencial de las enzimas nativas del suelo para liberar ortofosfato a partir de compuestos orgánicos de guisantes en el futuro. Por lo tanto, los datos obtenidos mediante este método pueden ayudar a predecir la fertilidad del suelo o el potencial de que el suelo libere cantidades dañinas de ortofosfato disponible para algas. Añada 30 mililitros de la solución de hidróxido de sodio 0,25 molar a dos gramos de muestra húmeda o seca en un tubo cónico de 50 mililitros.

Incubar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras a 3000 ×g durante 30 minutos, luego transferir 100 microlitros a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que ya contiene tampón acetato. La muestra ajustada tiene un volumen total de un mililitro y un pH de 5,0.

Prepare dos soluciones stock que contengan 0,5 unidades por mililitro de fosfatasa ácida en 10 mililitros de acetato de sodio 0,1 molar recién preparado, pH cinco. Añada ahora nuclease NP uno liofilizada y reconstituida de Penicillium Citron a uno de los tubos de 10 mililitros de las soluciones stock de fosfatasa ácida hasta una concentración final de 2,5 unidades de NP uno por mililitro, mezclando suavemente mediante inversiones repetidas. Centrifugue las dos soluciones enzimáticas a 3000 ×g durante 30 minutos. Para construir una curva de calibración, comience añadiendo un mililitro de una solución stock de fosfato de potasio unimolar a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y realice siete diluciones seriadas de 0,5 mililitros, desechando el primer tubo, de modo que el rango final de dilución sea de 20 µM a 0,625 nM de fósforo.

Ahora transfiera los patrones de ORTOFOSFATO a las dos últimas columnas de la placa, comenzando con cero nm de ortofosfato en la fila A y terminando con 20 nm de ortofosfato en la fila H hacia los tres primeros pocillos de la columna 10. Añada 40 microlitros de solución de enzima PP más GP a los siguientes tres pocillos de la columna 10. Añada 40 microlitros de solución de enzima PP más GP más NP uno.

Finalmente, agregue 40 microlitros de tampón acetato 100 milimolar a los seis pozos. Ahora, cada uno de los primeros seis pozos de la columna 10 debe contener 80 microlitros de solución hacia los dos siguientes pozos. Añada 40 microlitros de solución de acetato de sodio que contenga glucosa 10 M, seis fosfato y 40 microlitros de solución enzimática PP más GP.

Para cada muestra que se analice, distribuya 40 microlitros de extractos de muestra ajustados al pH en los pocillos del uno al nueve en hasta ocho filas después de haber distribuido todas las muestras. Utilice una pipeta multicanal para distribuir la solución enzimática de PP más GP en las columnas del uno al tres, PP más GP más NP en las columnas del cuatro al seis y tampón de acetato de sodio 0,1 molar en las columnas del siete al nueve. Realice este paso rápidamente para asegurar que todas las muestras tengan un tiempo de incubación equivalente.

Cubra la placa de 96 pocillos con una tapa e incube las muestras, soluciones enzimáticas, controles y la curva de calibración exactamente una hora a 37 grados Celsius en agua desionizada. Prepare 50 mililitros de cada una de las cuatro soluciones stock. La solución A debe prepararse diariamente utilizando rápidamente una pipeta multicanal.

Añada 25 microlitros de SDS, 100 microlitros de la solución A, 20 microlitros de la solución B y 50 microlitros de la solución C a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Tape la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, mida la absorbancia a 850 nanómetros en cualquier lector de microplacas ajustable utilizando una aplicación de hoja de cálculo.

Primero, trace la curva de calibración de fósforo inorgánico con cero a 20 nanomoles de fósforo en el eje X y el promedio de las mediciones duplicadas de absorbancia en el eje Y, realice una regresión lineal y determine la ecuación de la línea de mejor ajuste. A continuación, calcule el fósforo inorgánico de fondo promediando los valores de las columnas uno a tres, y luego aplique la curva de calibración al conjunto de datos. A continuación, para determinar el fósforo derivado de los monoésteres de fósforo hidrolizados, promedie los valores triplicados de las muestras de las columnas cuatro a seis y reste la solución de enzima control más el fósforo inorgánico de fondo.

Luego, para calcular el contenido de fósforo a partir del fósforo hidrolizado, los DER promedian los valores de las muestras por triplicado de las columnas siete a nueve y restan la solución de enzima control más el fósforo inorgánico de fondo más el fósforo de éster mono hidrolizado de las columnas cuatro a seis. Una placa típica de 96 pocillos muestra resultados para ocho muestras y una curva de calibración. Los controles se encuentran en la columna 10.

El aumento de la intensidad del color entre las columnas uno a tres y cuatro a seis se debe a los compuestos de fósforo de éster mono hidrolizados; entre las columnas cuatro a seis y siete a nueve se debe a los compuestos de fósforo de éster di hidrolizados. Aquí se utilizó el método de hidrólisis enzimática de alto rendimiento para analizar con éxito la distribución de las clases de fósforo en extractos de una muestra de suelo de Vermont con hidróxido de sodio 0,25 M y EDTA 0,05 M. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir ortofosfato nativo, compuestos de éster mono y éster di de fósforo en extractos de suelo o estiércol utilizando hidrólisis enzimática.

Esta técnica podría ayudar a allanar el camino para que los investigadores en los campos de la química ambiental y la gestión de nutrientes exploren el comportamiento del fósforo orgánico en sistemas de suelo o estiércol.