Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C
1 de febrero de 2011
El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.
El objetivo general del siguiente experimento es analizar y cuantificar cinco metilcitosinas y cinco hidroxietilcitosinas dentro de un locus específico del ADN genómico. Esto se logra bloqueando el grupo hidroxilo de la cinco hidroxietil aina, lo que convierte un sitio de MSP escindible en uno no escindible. Como segundo paso, el ADN genómico se digiere con las enzimas de restricción MSP uno y HPA dos, que utilizan sus diferentes sensibilidades a la metilación para identificar sitios de cinco hidroxietilcitosina relacionados con la glucoglucosa.
A continuación, se utiliza PCR para analizar el locus. Los resultados obtenidos muestran la presencia de cinco hidroxietil citosina en un locus específico. La PCR cuantitativa (qPCR) puede emplearse para cuantificar la cantidad de cinco metil citosina y cinco hidroxietil citosina.
La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la secuenciación con bisulfito, es que se puede discriminar entre cinco metilamina y cinco hidroxietilamina. Los experimentos que se realizarán hoy, Romas Vice Villa, Romas fue un desarrollador principal de este kit en New England Biolabs. Antes del inicio de este protocolo, se purificó el ADN genómico a partir de tejido cerebral de B Sea según se describe en el procedimiento escrito, en un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Mezcle el ADN genómico, UDP-glucosa, tampón NEB buffer 4 y suficiente agua libre de nucleasas para llevar el volumen total a 310 microlitros.
Divida esta mezcla de reacción en dos tubos de 155 microlitros cada uno. Luego agregue 30 unidades o tres microlitros de transferasa beta glucosídica T4 a un tubo. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
No agregue el T cuatro BGT al segundo tubo, ya que es la reacción control, pero asegúrese de agregar tres microlitros de agua. Incube ambos tubos a 37 grados Celsius durante 12 a 18 horas, período durante el cual el BGT añadirá glucosa al grupo hidroxilo de los grupos de citosina hidroxietilo cinco en la muestra. Para comenzar la digestión con enzima de restricción, retire una alícuota de 50 microlitros de la mezcla de reacción y colóquela en cada uno de tres tubos PCR de 0,2 mililitros etiquetados del uno al tres.
Luego, alícuota 50 microlitros de la mezcla control en cada uno de tres tubos en tira para PCR etiquetados del cuatro al seis. Añada 100 unidades de msp, una en los tubos uno y cuatro. A continuación, añada 50 unidades de HPA dos en los tubos dos y cinco y mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
No agregue nada a los tubos tres y seis ya que son controles. Incube los seis tubos a 37 grados Celsius durante al menos cuatro horas. Luego agregue un microlitro de proteinasa K a cada tubo e incube a 40 grados Celsius durante 30 minutos.
Finalmente, inactivar la proteinasa K incubando a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Este procedimiento se demuestra utilizando NE B'S long amp TAC para PCR de punto final. Sin embargo, se pueden sustituir otros reactivos y procedimientos de PCR en un tubo de reacción PCR de 0,2 mililitros sobre hielo.
Añada cinco x tampón de reacción long amp TAC, dNTPs, cebadores directo y reverso, el ADN molde obtenido previamente, ADN polimerasa long AMP T y agua libre de nucleasas suficiente para alcanzar un volumen final de 50 microlitros. Mezcle suavemente la reacción si es necesario y recopile todo el líquido en el fondo del tubo mediante una centrifugación rápida. Transfiera los tubos de PCR del hielo a un termociclador con el bloque precalentado a 94 grados Celsius e inicie el programa de ciclado para una PCR rutinaria de tres pasos.
Debe haber un paso inicial de desnaturalización a 94 grados Celsius durante 30 segundos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 grados Celsius durante 15 segundos, hibridación a 55-65 grados Celsius durante 30 segundos y una extensión a 65 grados Celsius durante 20 segundos o 50 segundos por kb. A esto debe seguirle una extensión final única a 65 grados Celsius durante cinco minutos. También se puede realizar PCR en tiempo real para cuantificar las cantidades de cinco metilcitosina y cinco hidroxietilcitosina.
Consulte el manual del producto disponible en nb.com para obtener información específica. Se realizó una comparación de cinco cantidades de hidroxietil amina en el locus 12 mediante PCR de punto final y PCR en tiempo real; se analizaron cuatro muestras diferentes de tejido BSY de ratón, incluyendo cerebro, hígado, corazón y bazo.
La variación en la cinco hidroxietil citosina es evidente en la banda de gel marcada de las muestras de PCR de punto final con fines comparativos. Los datos de PCR en tiempo real se normalizaron respecto al ADN sin cortar y se utilizó una curva estándar para determinar el número de copias. Las muestras se normalizaron dividiendo el número de copias de las muestras por el número de copias del control sin digerir.
Aquí, la variación en la cinco hidroxietil citosina puede observarse comparando las barras amarillas. Algunas observaciones sobre la realización de la técnica. Es fundamental que todas las reacciones enzimáticas se lleven a cabo completamente. Para la BGT, es importante que la reacción se realice durante la noche para poder aislar completamente todos los sitios de ADN para Ms.P uno; para HEPA dos, es importante que las reacciones duren al menos cuatro horas para asegurar que se alcance la finalización.
Y finalmente, proporcionamos controles de ADN y controles de cebadores para que pueda realizar reacciones de control simultáneamente.
Resumen
El Kit de Análisis EpiMark de 5-hmC y 5-mC permite el análisis y la cuantificación de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina en loci genómicos específicos. Este método utiliza reacciones enzimáticas para diferenciar entre estas dos modificaciones, proporcionando información sobre los patrones de metilación del ADN.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genómica
- Biología molecular
Antecedentes
- La 5-metilcitosina (5-mC) y la 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) son modificaciones epigenéticas importantes.
- Comprender su distribución en el genoma es fundamental para estudiar la regulación génica.
- El kit EpiMark proporciona un método fiable para distinguir entre estas modificaciones.
- Las reacciones enzimáticas facilitan el análisis de loci específicos de ADN.
Objetivo del estudio
- Analizar y cuantificar 5-mC y 5-hmC dentro de regiones genómicas específicas.
- Utilizar el kit EpiMark para mejorar la detección de estas modificaciones.
- Comparar la eficiencia de este método frente a las técnicas tradicionales.
Métodos Utilizados
- Conversión enzimática de 5-hmC en un sitio no escindible utilizando β-glucosiltransferasa.
- Digestión del ADN genómico con las enzimas de restricción MspI y HpaII.
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar regiones diana.
- PCR cuantitativa (qPCR) para medir los niveles de 5-mC y 5-hmC.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa entre 5-mC y 5-hmC en loci específicos.
- Datos cuantitativos que demuestran la presencia de 5-hmC en diversas muestras de tejido.
- Comparación de los resultados obtenidos mediante PCR de punto final y PCR en tiempo real.
- Variación en los niveles de 5-hmC observada en diferentes tejidos de ratón.
Conclusiones
- El kit EpiMark es efectivo para analizar modificaciones de metilación del ADN.
- Este método ofrece una ventaja significativa frente a la secuenciación tradicional con bisulfito.
- Estudios posteriores pueden aprovechar esta técnica para obtener mayores conocimientos sobre la regulación epigenética.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección precisa de 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) específica de locus apoya la validación de dianas epigenéticas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia al distinguir la hidroximetilación funcional del ruido de metilación. Este método enzimático permite la evaluación cuantitativa de estados epigenéticos en sitios genómicos definidos, mejorando la confianza predictiva en estudios de interacción con la diana y modulación de vías. Aborda una brecha crítica en el desarrollo de biomarcadores epigenéticos donde los enfoques basados en bisulfito no logran discriminar entre 5-hmC y 5-metilcitosina (5-mC).
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis epigenéticas al distinguir 5-hmC de 5-mC en loci específicos, aclarando sus funciones mecanicistas en la regulación génica.
- Valor operativo: Ofrece resolución a nivel de locus sin requerir secuenciación, reduciendo la complejidad en cribados epigenéticos de etapa inicial.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo en dianas al confirmar los estados de modificación epigenética asociados con la actividad transcripcional en tejidos relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en amplificación (PCR de punto final o PCR cuantitativa) que permiten el análisis comparativo de los niveles de 5-hmC entre diferentes condiciones experimentales.
- Valor operativo: Utiliza infraestructura estándar de PCR, lo que posibilita la estandarización y escalabilidad del ensayo entre laboratorios.
- Valor de reproducibilidad: Las reacciones de control interno (sin glucosilación) normalizan la eficiencia de digestión, mejorando la fiabilidad de los datos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor Translacional: La aplicabilidad demostrada en tejidos cerebrales, hepáticos, cardíacos y esplénicos de ratón respalda la exploración de biomarcadores transversales a múltiples tejidos.
- Continuidad Preclínica: Permite el seguimiento longitudinal de la dinámica de 5-hmC en modelos de enfermedad, vinculando cambios epigenéticos con resultados fenotípicos.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Ayuda a correlacionar la hidroximetilación específica de locus con la activación de vías, reduciendo la ambigüedad en el mecanismo del objetivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento epigenético tras la identificación del objetivo y antes de la validación funcional, proporcionando fenotipificación molecular de los estados epigenéticos en loci candidatos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al determinar si un sitio CpG de interés alberga 5-hmC, informando la selección de dianas basada en la actividad epigenética.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos y específicos de locus compatibles con el tamizaje de medio rendimiento de moduladores epigenéticos.
- Análisis: La salida de qPCR permite la estimación del número de copias y la normalización, facilitando la comparación estadística entre grupos de tratamiento.
- Investigación Traducional: La detección tisular específica en el cerebro y órganos periféricos apoya la evaluación de la relevancia de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: El protocolo utiliza reactivos y equipos estándar de biología molecular, lo que permite su amplia adopción en equipos de epigenética, neurociencia y genómica funcional.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en estudios epigenéticos al proporcionar una discriminación inequívoca entre 5-mC y 5-hmC.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de conversión con bisulfito o secuenciación, simplificando el flujo de trabajo y reduciendo el tiempo de respuesta.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en programas de dianas epigenéticas al proporcionar datos cuantitativos fiables sobre modificaciones.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en la participación epigenética validada en loci relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de biología molecular, incluyendo digestión con enzimas de restricción y PCR.
- Depende del acceso a la glucosiltransferasa (T4-BGT) y a isoesquisómeros sensibles a la metilación (MspI/HpaII).
- Exige un diseño cuidadoso de cebadores que flanqueen sitios CCGG para asegurar la amplificación específica.
- El rendimiento óptimo requiere reacciones enzimáticas completas (glucosilación nocturna, digestión ≥4 horas).
- Se limita a loci que contienen CCGG; no es aplicable para análisis a nivel genómico o de sitios que no sean CCGG.
