La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

La ionización secundaria por electropulverización, espectrometría de masas o CS EMS permite el análisis de volátiles bacterianos sin necesidad de ninguna muestra. Pre-tratamiento. El espacio de cabeza del cultivo bacteriano es desplazado por el dióxido de carbono a la cámara de reacción cssi. A medida que los volátiles atraviesan la cámara de reacción SSI, pasan a través de la nube de electropulverización y se ionizan.

Una vez ionizados, los volátiles se introducen en el espectrómetro de masas para su análisis. El exceso de gas portador y los volátiles bacterianos no reactivos se pasan a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier agente bacteriano como medida adicional de protección de ventilación a una campana química. En última instancia, este protocolo CSI MS ofrece huellas dactilares volátiles bacterianas en cuestión de minutos.

Anticipamos que esta tecnología podría usarse en muchas aplicaciones, incluida la exhalación, el análisis del aliento para enfermedades infecciosas, o incluso aplicarse a los sistemas alimentarios donde podríamos detectar rápidamente patógenos que están en o N en nuestros alimentos. Hay varias ventajas principales de esta técnica. Con respecto a los métodos existentes como GCMS tamizado, MS y PT, RM S primero, los volátiles no requieren ningún tratamiento previo antes del análisis.

En segundo lugar, es posible fragmentar iones específicos en la mezcla volátil, lo que facilita la identificación de compuestos. Y tercero, es rápido. Por lo general, tarda menos de cinco minutos.

Para analizar cada muestra, elija el recipiente adecuado para el cultivo de su cultivo, teniendo en cuenta los requisitos de crecimiento de la especie, así como la entrega eficiente de volátiles al espectrómetro de masas. En esta demostración, hemos seleccionado botellas de medios de pira estándar de 100 mililitros. Los volátiles bacterianos son entregados al espectrómetro de masas por una corriente de gas portador para ensamblar el portador.

Las líneas de gas se ajustan a las botellas de cultivo con tapas roscadas que tienen al menos dos puertos de señuelo. Inserte las líneas de entrada y salida de gas a través de los puertos de señuelo y conecte los puertos adicionales antes de cultivar sus muestras. Presurice los recipientes y sumérjalos en agua para verificar si hay fugas.

Las fugas de gas son una de las principales causas de resultados atípicos en forma de débiles o ausentes. Las señales de iones volátiles crecen de la noche a la mañana. Cultivos de E. coli, K 12, y Pseudomonas aerogen, PAO uno en LB Lennox preparando dos réplicas biológicas para cada especie.

Prepare nueve frascos de cultivo estériles que contengan 50 mililitros de LB Lennox y un frasco no inoculado para usarlo como inoculado en blanco cada cultivo nocturno en dos frascos de muestra. Creando réplicas técnicas, incubar los cultivos y el blanco durante 24 horas a 37 grados centígrados. Dado que el CEMS está diseñado específicamente para muestrear volátiles, limite el uso de productos de cuidado personal fragantes antes de usar el instrumento herméticamente.

Tape todos los productos químicos volátiles en el laboratorio y controle las corrientes de aire tanto como sea posible durante las pruebas para evitar la contaminación de su instrumento y las líneas de transferencia de gas. Con agentes biológicos viables, instale filtros del tamaño de poro adecuado en la línea de gas portador. Los filtros no interferirán con la transferencia de volátiles a la cámara de reacción de desisi, pero pueden afectar ligeramente la eficiencia de la transferencia de aerosoles.

Para verificar que el suministro de voltaje esté apagado y que el sistema esté descargado de electricidad, verifique las luces indicadoras del proveedor de voltaje apagado. Asegúrese de que el voltaje en el multímetro sea cero y conecte a tierra los cables eléctricos. En este momento, instale la solución de electropulverización para su análisis.

En el modo de iones positivos, utilizamos una solución de electropulverización de 0,1 % de ácido fórmico, 5 % de metanol y 94,9 % de agua Para lograr una intensidad y estabilidad de señal óptimas, encienda el gas portador de dióxido de carbono y ajuste el caudal a dos litros por minuto. Aplique presión al depósito de electropulverización para iniciar la entrega de la solución de electropulverización a la cámara de reacción a un caudal de cinco nanolitros por segundo. A continuación, encienda el suministro de voltaje y ajuste el voltaje a 2,5 kilovoltios.

El voltaje aplicado afecta la intensidad de los iones de la señal y la estabilidad del cono Tailor de electrospray para voltajes de nuestro sistema entre dos y cinco kilovoltios. Proporcione los mejores resultados en el modo de iones positivos, tenga cuidado, ya que en este punto las superficies metálicas de la fuente de ionización son capaces de producir un choque peligroso. Ahora configure un método de ajuste para monitorear el espectro SEMS.

Desactive la casilla de verificación Adquisición de varios canales o MCA. Establezca el tiempo de adquisición en 10 a 15 minutos e inicie la adquisición de datos. Observe los espectros del fondo de gas portador y realice ajustes precisos en el voltaje aplicado para obtener un cromatograma de iones totales estable y escaneos reproducibles.

Continúe recopilando espectros y TIC A durante cinco minutos para asegurarse de que el instrumento esté estabilizado con el instrumento asegurado. Introduzca los parámetros de adquisición según corresponda para el experimento. Registre el espectro de fondo de un gas portador para futuros experimentos.

Para recoger un Spectrum en blanco. Dirija el flujo de gas portador a través de las líneas de derivación y luego conecte la muestra en blanco con las válvulas cerradas a las líneas de transferencia del instrumento. Abra las válvulas del frasco de muestra y cierre las válvulas de las líneas de derivación.

Para espectros reproducibles. Deje que el sistema se equilibre durante 30 segundos, tiempo durante el cual la humedad en la cámara de reacción se estabiliza. Para asegurarse de que el sistema esté equilibrado, controle el TIC, que cambiará durante el período de equilibrio seguido de la estabilización.

Una vez que el sistema esté equilibrado, inicie la recolección del espectro. Después de recolectar el espectro, retire la botella de muestra abriendo primero las líneas de derivación de gas portador. A continuación, cierre de las válvulas de muestra.

Y por último, retirar el frasco de muestra. Enjuague el sistema con el gas portador durante dos a cuatro minutos para eliminar la humedad y los volátiles absorbidos de las líneas de transferencia y evitar el arrastre de muestra a muestra. Recopile datos volátiles de huellas dactilares para cada muestra bacteriana, recopilando de forma intermitente espectros en blanco adicionales para garantizar una sustracción completa en blanco.

Las huellas dactilares volátiles del modo de iones positivos para E. coli y p aerogen. Cultivados aeróbicamente en LB Lennox durante 24 horas a 37 grados centígrados son distintos. El espectro volátil de E. coli está dominado por indu con una relación masa-carga de 118, mientras que el espectro de pseudomonas aerogen contiene una mayor variedad de picos adicionables a proteínas.

Al intentar este procedimiento, es importante que registre los parámetros instrumentales que ha optimizado para su análisis, como el voltaje aplicado, la composición de la solución de electropulverización y el caudal de gas portador. También es importante que mantenga registros de sus espectros representativos para que pueda reproducir sus análisis en el futuro. No olvide que trabajar con bacterias patógenas y alto voltaje podría ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como limitar el acceso a css CMS durante el experimento. Por lo tanto, ahora debería poder obtener de forma reproducible un CSS, espectros EMS para los volátiles bacterianos en su sistema. Buena suerte.