Name: Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a evaluar la respuesta citotóxica de células NK contra células T infectadas con VIH-1 mediante ensayos de liberación de cromo y citometría de flujo. Este método permite estudiar interacciones receptor-ligando en inmunología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Cuando se hace correctamente los ensayos descritos en este protocolo debe proporcionar una imagen representativa de la capacidad de las células NK a degranulación en contra y lisis de VIH-1 las células infectadas (ver Figura 5). Degranulación de las células NK en la respuesta al VIH de las células infectadas y las células NK lisis infectadas por el VIH debe ser directamente proporcional 10. Resultados confiables para los dos ensayos con células NK funcionales para medir las respuestas citotóxicas para las células infectadas con VIH dependen del aislamiento de las células NK altamente purificada, así como una población altamente purificada de células infectadas. Después de haber purificado las células NK y el VIH-1 las células infectadas son fundamentales para el logro de un efector bastante precisa de la relación de células objetivo. Del mismo modo, la eliminación de células muertas y la apoptosis de las poblaciones de células diana es importante antes de 51 Cr etiquetado o la incubación con las células efectoras. 51Cr puede ser internalizado por las células que se someten a la apoptosis como la presencia de células muertas o apoptosis durante la fase de etiquetado de isótopos dará como resultado una liberación espontánea de alto y se distorsiona la lisis% calculado específicos. Además, la presencia de células muertas o apoptosis puede desencadenar la degranulación de las células NK que resulta en niveles anormalmente altos de expresión CD107a. Pipeteo preciso es necesario cuando la eliminación de los sobrenadantes libres de células después de la incubación de las células NK y células diana en los 51 ensayos de liberación de Cr, como las diferencias en el volumen de sobrenadante retirado de cada réplica y se traducirá en alta desviaciones estándar. Se pueden hacer modificaciones a estos protocolos para evaluar el papel de los receptores específicos NK en la activación de las células NK lisis de células infectadas con VIH mediante la incubación de los efectores u objetivos antes de co-cultivo con anticuerpos antagonistas de receptores específicos o ligandos 6,11. Tratados de citoquinas de las células NK (por ejemplo, IL-2, IL-15) se puede utilizar para evaluar la funcionalidad de estimular las células NK 12. Del mismo modo, dependiente de anticuerpos ensayos de citotoxicidad celular se puede realizar utilizando estos protocolos. Anticuerpos anti-VIH (por ejemplo, anti-gp120) se pueden añadir a las células diana para el reconocimiento de la célula NK receptor de baja afinidad Fc CD16 13. Estos ensayos, aunque creada para medir las respuestas de las células NK citotóxicas para las células infectadas con VIH, también puede ser modificado para medir la capacidad de las células NK para producir citoquinas tras el reconocimiento de células infectadas por el VIH. A pesar de que se describe en este protocolo el uso de células in vitro infectadas como células diana se han descrito recientemente la generación de las células diana de pacientes infectados con el VIH. Para ello es necesario el aislamiento de las células CD4 + células T seguida por la expansión de las células durante un período de dos semanas después de la estimulación con mitógenos, en presencia de interleucina-2 11. Después del período de dos semanas de la expansión, los protocolos descritos en este artículo se utilizan para aislar las células diana.

<table><tbody><tr><td>Tubos Vacutainer (heparina sódica)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células T CD4+ RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit de expansión de células T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>HBSS CMF (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento negativo de células NK</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento positivo CD4+</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Kit de eliminación de células muertas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Cromo</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para contador gamma</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>Contador gamma automático 2470</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y uso de vih-1 en células cd4 infectadas primaria + t-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Asesinas naturales (células NK) son un componente esencial de la respuesta inmune innata a células infectadas por virus. Es importante entender la capacidad de las células NK para reconocer y lisar el VIH-1 las células infectadas por la identificación de cualquier aberración en función de las células NK contra las células infectadas con VIH podría conducir a terapias que mejoren su actividad citolítica. No hay necesidad de utilizar infectadas por el VIH primaria de células T explosiones como células diana en lugar de infectados-T-líneas celulares en los ensayos de citotoxicidad. Líneas de células T, incluso sin la infección, son muy susceptibles a la lisis de las células NK. Además, es necesario el uso de células autólogas primaria para prevenir las principales clases complejo de histocompatibilidad que los desajustes entre el objetivo y la célula efectora que dará lugar a la lisis. Los primeros estudios evaluar las respuestas de las células NK citolítica de primaria de las células infectadas no muestran matando significativa de 1,2 células infectadas. Sin embargo, con VIH-1 primario de células T como las células diana en ensayos de células NK funcionales ha sido difícil debido a la presencia de contaminación de las células no infectadas 3. Esta célula infectada inconsistentes con la proporción de células no infectadas se traducirá en una variación en la muerte de las células NK entre las muestras que no puede ser debido a la variabilidad en función de los donantes de las células NK. Por lo tanto, sería beneficioso para trabajar con una población de células infectadas purificada a fin de normalizar el efector para apuntar relaciones entre los experimentos de células 3,4. Aquí se demuestra el aislamiento de una población altamente purificada del VIH-1 las células infectadas por el aprovechamiento de la capacidad del VIH-1 para abajo modular CD4 en las células infectadas y la disponibilidad de kits comerciales para eliminar las células muertas o moribundas 3-6. La infección primaria purificada de células T explosiones se puede utilizar como objetivos, ya sea en un ensayo de desgranulación o citotóxicos, células NK purificadas como la población 5-7 efector. El uso de las células NK como efectores en un ensayo de desgranulación evalúa la capacidad de una célula de NK para liberar los contenidos lítica de los lisosomas especializados 8 llamada &quot;gránulos citolíticos&quot;. Mediante la tinción con un anticuerpo conjugado con fluorocromo contra CD107a, una proteína de membrana lisosomal que se expresa en la superficie de las células NK, cuando los gránulos citolíticos fusionan con la membrana plasmática, se puede determinar qué porcentaje de las células NK en respuesta a la degranulación objetivo el reconocimiento de la célula. Por otra parte, la actividad lítica de las células NK puede ser evaluado en un ensayo citotóxico que permite la determinación del porcentaje de células diana zadas por la liberación de 51 Cr desde el interior de la célula diana en la presencia de células NK.

Ensayos de citotoxicidad para medir las respuestas de las células asesinas naturales lítica de células infectadas con VIH se ve limitada por la pureza de las células diana. Estamos aquí demostrar el aislamiento de una población altamente purificada de VIH-1 primario de células T explosiones mediante el aprovechamiento de la capacidad del VIH-1 s de abajo modular CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

Las células asesinas naturales (NK) son un componente vital de la respuesta inmunitaria innata frente a las células infectadas por virus. Es importante comprender la capacidad de las NK...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la respuesta citotóxica de las células NK frente a células infectadas por el VIH-1. Esto se logra primero aislado e infectando células T positivas para CD4 provenientes de sangre venosa. Luego, las células asesinas naturales se aíslan del mismo donante.A continuación, se aíslan las células T CD4 positivas no infectadas apartándolas de las células infectadas. Finalmente, las células infectadas y las células NK se utilizan como dianas y efectoras, respectivamente, en uno de dos ensayos para evaluar la citotoxicidad de las células NK. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que las células NK pueden responder a células infectadas con VIH V1 mediante la sobreexpresión de CD107a, cuya expresión se determina mediante análisis citométrico de flujo, o mediante la liberación de cromo 51 detectada por un contador gamma.Este método puede responder preguntas clave en el campo del VIH-1, como si las células NK responden a células infectadas por VIH-1, qué interacciones receptor-ligando son importantes en las interacciones entre células NK y T, y si las proteínas virales del VIH-1 modulan la respuesta de las células NK frente a células infectadas por VIH-1. Después de estimular células T CD4 positivas aisladas de sangre periférica humana y estimuladas con microesferas conjugadas con anti-CD3 y anti-CD28 durante 72 horas, cuente la población resultante de células T mediante un hemocitómetro y luego divida la cultura en dos grupos, aproximadamente dos veces 10 a la seis células T en un tubo cónico de 15 mililitros para usar como grupo control no infectado, y coloque el resto de la suspensión de células T CD4 positivas en un tubo cónico de 50 mililitros para el grupo de infección.Centrifugar ambos grupos a 300 G a 22 grados Celsius durante 10 minutos y luego aspirar el sobrenadante. Suspender las células T CD4 positivas del tubo de 50 mililitros directamente en fluidos de cultivo que contengan viriones y agregar polibreno a una concentración final de 10 miligramos por mililitro. Luego, centrifugar para infectar las células a 1200 ×g durante dos horas a 20-25 grados Celsius.Aquí, las células están siendo infectadas con DHIV tres a una multiplicidad de cinco. Tras completar la infección por centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda las células infectadas a una densidad de tres por 10 a la seis por mililitro en RPMI completo suplementado con 100 unidades por mililitro de IL-2.Luego, cultive las células no infectadas y las células recién infectadas durante 72 horas en una placa de seis pocillos. Si se utilizó un virus incompetente para la replicación, o durante cinco a siete días si se utilizó un virus competente para la replicación, recolecte el sobrenadante que contiene los cultivos de linfocitos T positivos para CD4 infectados y centrifugue las células a 300 ×g durante 10 minutos a 22 °C con la frenada activada. Aspire el sobrenadante y resuspenda. Suspender el sedimento en dos mililitros de PBS con 2 %FBS y dos milimolares de EDTA y cuente las células en un hemocitómetro utilizando un kit de aislamiento positivo para CD4.Elimine las células T no infectadas positivas para CD4. Siga las instrucciones del fabricante para el aislamiento de células T positivas para CD4, con la excepción de que se utiliza una relación de una partícula anti-CD4 por célula. Luego, elimine las células muertas de la población celular purificada que alberga el virus utilizando un kit de eliminación de células muertas.Según las instrucciones del fabricante, recolecte la población de linfocitos T vivos y centrifugue las células purificadas a 300 G durante 10 minutos. Con el freno activado, retire luego el sobrenadante, suspenda el botón celular. Suspéndalas en un mililitro de RPMI completo y cuente las células. Los linfocitos NK de sangre periférica se aíslan primero del mismo donante del que se obtuvieron los linfocitos T positivos para CD4.Después del cultivo nocturno, cuente las células NK con un hemocitómetro, centrifúgelas a 300 G durante 10 minutos con la frenada activada y luego resuspenda las células en RPMI completo, ajustando la concentración final a 10⁶ células por mililitro. A continuación, recoja y centrifugue las suspensiones de linfocitos T purificadas, infectadas y no infectadas (control) a 300 G durante 10 minutos. Con la frenada activada, retire el SANE y resuspenda los sedimentos.En RPMI completo a dos veces 10 a la seis células por mililitro para un control positivo, aproximadamente dos veces 10 a la seis células susceptibles a lisis por NK. Las células K562 se utilizan en este video; centrifugue las células K562 a 300 × g durante 10 minutos con la frenada activada, luego retire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en RPMI completo a dos veces 10 a la seis células por mililitro.Después de que todas las poblaciones celulares hayan sido lavadas y resuspendidas en sus concentraciones experimentales, coloque las células NK junto con células K562, células T no infectadas o células T infectadas con VIH. En pozos individuales de una placa de fondo en V de 96 pozos, se utilizará solo un réplica por tipo de célula diana para medir la desgranulación inespecífica de las células NK. Añada 100 microlitros de células efectoras NK y 100 microlitros solo de medio a uno.Añada 10 microlitros de anticuerpo anti-CD107a conjugado con fluorocromo a cada pocillo y centrifugue la placa a 20 ×g durante dos minutos con el freno activado a 22 grados Celsius. A continuación, incube la placa a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cuatro horas tras la incubación. Centrifugue la placa a 400 ×g durante cinco minutos con el freno activado a 22 grados Celsius y luego retire el sobrenadante utilizando una pipeta de aspiración de dos mililitros equipada con una punta P200.A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de flujo a cada pocillo y luego marque las células con anticuerpos anti CD 3 14 20 azul Pacífico y anticuerpo anti CD 56 A PC en hielo durante 20 minutos. Después de que las células hayan sido marcadas, agregue 200 microlitros de tampón de flujo a cada pocillo y centrifugue la placa a 400 G durante cinco minutos. Con la desaceleración a 22 grados Celsius, aspire cuidadosamente el tampón de flujo de cada pocillo.Utilizando una pipeta aspiradora de dos mililitros equipada con una punta de micropipeta de 200 microlitros, asegurándose de no perturbar el precipitado, lave las células nuevamente y luego resuspenda los precipitados en 200 microlitros de paraformaldehído al 1% en PBS sin calcio ni magnesio. Finalmente, transfiera las suspensiones celulares a tubos para citometría y lleve el volumen total en los tubos a 300 microlitros añadiendo aproximadamente 100 microlitros de paraformaldehído al 1% en PBS sin calcio ni magnesio a cada uno. A continuación, lea dos veces 10 a la cuarta eventos de células NK mediante citometría de flujo utilizando el software FACSDiva y analice los datos usando el software FlowJo. Etiquete células diana T infectadas con VIH V1 y no infectadas, purificadas, con 125 microcuries de cromo 51 en solución salina por 10 a la sexta células durante dos horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en un tubo cónico de 15 mililitros como control positivo; también etiquete 10 a la sexta células K562 con 100 microcuries de cromo 51 durante dos horas.Bajo las mismas condiciones de cultivo. Utilice RPMI completo para llevar el volumen final de la solución de tinción para cada población celular a 500 microlitros. El volumen de cromo 51 añadido a las células diana se calcula utilizando la calculadora universal de descomposición radiactiva disponible en el sitio web de PerkinElmer, mientras se etiquetan las células diana.Retire las células NK previamente aisladas del cultivo y cuéntelas; centrifugue las células NK a 300 G durante 10 minutos con el freno activado y resuspenda los sedimentos en RPMI completo. Divida las suspensiones celulares resultantes en tres tubos cónicos de 15 mililitros. Ajuste la densidad celular a 10⁵ por mililitro en el primer tubo, 2,5 × 10⁵ por mililitro en el segundo tubo y 5 × 10⁵ por mililitro en el tercero. En el tercer tubo, las células NK se utilizarán como células efectoras en proporciones de 1:1, 2,5:1 y 5:1, respectivamente, en el ensayo de liberación de cromo ⁵¹.Retire las células diana marcadas del incubador y agregue 4,5 mililitros de RPMI completo a cada tubo. Centrifugue los tubos a 300 G durante 10 minutos. Luego, vierta cuidadosamente el sobrenadante en un recipiente para desechos líquidos radiactivos sin perturbar el precipitado.Lave las células diana dos veces más para eliminar todo el cromo 51 no absorbido. El sobrenadante del tercer lavado puede descartarse en un recipiente para residuos líquidos no radiactivos. Ahora, re-suspenda nuevamente las células diana en RPMI completo hasta alcanzar la densidad celular final de 10 a la quinta por mililitro, mostrada como ejemplo de un montaje típico para un ensayo de liberación de cromo 51.Tenga en cuenta que cada grupo se realiza en alícuotas triples: coloque 100 microlitros de blancos marcados en cada uno de los pozos indicados de una placa de fondo en V de 96 pozos, para obtener un número final de células blanco de 10 a la cuarta por pozo. A continuación, añada 100 microlitros de las suspensiones de NK a las células blanco en las proporciones indicadas de células efectoras a células blanco. Luego, añada 100 microlitros de blancos a los pozos correspondientes en los que no están presentes las células efectoras, para los grupos de liberación máxima y liberación espontánea.Suplemente el grupo de liberación espontánea con 100 microlitros adicionales de RPMI completo, centrifugue la placa a 20 G durante dos minutos con el freno activado y luego incube la placa a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cuatro horas. Después de la incubación de cuatro horas, agregue cinco microlitros de una dilución 1:10 de glóbulos rojos humanos en RPMI completo a cada pocillo, excepto a los pocillos de liberación máxima; luego agregue 100 microlitros de sulfato de ESAL al 10 % a los pocillos de liberación máxima y centrifugue la placa a 400 G durante cinco minutos. Para recoger las células, etiquete un tubo para contador gamma por cada uno de los pocillos experimentales y de control.En la placa de 96 pocillos, recolecte 100 microlitros de sobrenadante libre de células de cada pocillo y coloque el sobrenadante de cada pocillo en tubos previamente etiquetados. Mida la cantidad de cromo 51 en cada tubo mediante un contador automático de radiación gamma PerkinElmer 24 70. Los siguientes diagramas de dispersión muestran una estrategia típica de selección citométrica por flujo para analizar los resultados de una CD 1 0 7.Un ensayo de desgranulación. Primero se seleccionan las células individuales, excluyendo agregados o dobletes en un gráfico de FSCA frente a FSCH. A continuación, la puerta de células individuales representada como FSCA frente a SSC se selecciona en la población de linfocitos indicada nuevamente por el coval rosa.La puerta de los linfocitos se traza entonces como CD 3 14 20 frente a CD 56, delimitando la población positiva para CD 56 y negativa para CD 3 14 20, como indica la elipse vertical de color rosa. Aquí, el GA de las NK se representa como CD 1 0 7 A frente a CD 56 para visualizar las células NK que han desgranulado. En las siguientes dos figuras, se muestran resultados representativos de la evaluación de la respuesta citotóxica de las células asesinas naturales frente a células infectadas por el VIH tipo 1. Las células NK se evaluaron según su capacidad de desgranulación en ausencia de células diana y en respuesta a células K 5 62, a linfocitos T primarios positivos para CD 4 y a linfocitos T primarios infectados con VIH, determinándose mediante el porcentaje de células NK que expresan CD 1 0 7 A en la superficie. Los números en cada cuadrante representan el porcentaje de células NK totales en esta figura.Las células NK se evaluaron en cuanto a su capacidad para lisisar células K562, células T CD4 positivas no infectadas y células T infectadas con VIH-1 en un ensayo de liberación de cromo 51 a relaciones de células efectoras a células diana de 2,5:1, 5:1 y 7,5:1 tras su desarrollo. Esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología del VIH-1 exploraran cómo responden las células asesinas naturales a las células infectadas con VIH-1 en pacientes infectados con VIH.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Varios fluoro-2'-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN...

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

Este video muestra la realización de un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para determinar la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) contra las células cancerosas objetivo. El ensayo cuantifica la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa citoplasmática de las células cancerosas midiendo la absorbancia del producto de color rojo formado.

Un ensayo in vitro para evaluar la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas

Las células T reguladoras CD4+ son potentes inmunomoduladores y cumplen funciones importantes en la homeostasis inmunitaria. La escasez de estas células en la sangre periférica dificulta los estudios funcionales, especialmente en el contexto de la infección por VIH-1. Aquí describimos un método para aislar y expandir las Tregs CD4+ funcionales de sangre periférica de individuos infectados por VIH-1.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Aprende a evaluar la respuesta citotóxica de células NK contra células T infectadas con VIH-1 mediante ensayos de liberación de cromo y citometría de flujo. Este método permite estudiar interacciones receptor-ligando en inmunología.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos (Video) | JoVE Journal

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

Explorar más videos