Name: Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende a medir la termodinámica del plegado de proteínas de membrana mediante espectroscopia de fluorescencia de triptófano en vesículas LAR. Este método permite calcular la energía libre de Gibbs.

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Damos las gracias a Beijing Wu para el uso de sus datos. Este trabajo fue apoyado por un premio CARRERA NSF a JEK

1. Preparación de ~ 50 nm de diámetro pequeño vesículas unilaminares (SUV) de plegado de proteínas de membrana <ol><li> Una solución de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) lípidos en cloroformo se compra y alícuotas en viales de vidrio limpia en cantidades de 20 mg por vial para el almacenamiento. Una capa de gas nitrógeno, se añade a cada vial para evitar la oxidación de lípidos, y los viales están sellados con tapas y parafina. Los viales se almacenan en un congelador a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Un solo frasco que contiene una alícuota de 20 mg de lípidos en cloroformo se utiliza para cada experimento. El contenido de la ampolla se seca con una corriente de gas nitrógeno durante 1 hora hasta que ya no sigue siendo solvente. </li><li> Lípidos secos se resuspendieron en 1 ml de 20 mM de tampón fosfato de potasio (pH = 7,3) con un baño de ultrasonido de agua para aproximadamente 30 segundos. Esta solución de lípidos suspendido aparecerá nublado, y se transfiere a un plástico de 15 ml del tubo con un fondo cónico. Otra alícuota de 1 ml de solución amortiguadora de fosfato se añade a la ampolla de vidrio vacía que contenía originalmente los lípidos, y sonicación se repite, la solución se añade a la misma de 15 ml tubo. Este proceso se repite un total de 4 veces hasta que el volumen final en el tubo es de 4 ml, resultando en una concentración de lípidos de 5 mg / mL de esta solución de vesículas de valores. </li><li> El volumen de 4 ml de solución de lípidos vesícula se coloca en un lugar cálido (30 ° C) baño de agua, y se sonicaron utilizando un micropunta ultrasonicador durante 1 hora a 50% del ciclo. El propósito del baño de agua es doble. En primer lugar, evita que la solución de lípidos se vuelva demasiado caliente debido al proceso de sonicación. En segundo lugar, el baño caliente asegura que la temperatura de la solución acuosa de lípidos se mantiene por encima de la temperatura durante la fase de transición de dos capas sonicación, por DMPC, esta temperatura de transición es de ~ 23 ° C. </li><li> La solución sonicado se pasa a través de una jeringa de 0,22 micras filtro para eliminar los restos de la punta sonicador, y esta solución filtrada se equilibra la noche a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparación de muestras para la curva inicial de fluorescencia Despliegue <ol><li> Una solución stock de 10 M de urea en 20 mM tampón fosfato (pH 7,3) se hace. Es esencial que el agua se añade a la sólida (y no al revés), ya que la gran cantidad de urea ocupa un volumen importante en la solución. Esta solución de urea se puede hacer mediante la adición de solutos a una botella limpia, vacía y añadir agua hasta el volumen final previsto. Esta solución puede requerir un calentamiento en un baño de agua o sobre una plancha caliente con agitación para disolver el soluto. La urea es higroscópica y por lo tanto, la concentración real de la solución de urea debe ser determinada mediante el índice de refracción 1. </li><li> Una solución de reserva de estabilización de fosfato 20 mM (pH 7,3) se hace. </li><li> Una solución de reserva de proteínas desplegadas se prepara. Esta solución de proteínas de reserva debe tener una concentración de proteína M ~ 200 en urea 8 M, 20 mM tampón fosfato. </li><li> Las muestras para los estudios de fluorescencia se preparan de la siguiente manera. Los volúmenes adecuados de proteína de valores (sección 2.3), solución de reserva de lípidos (5 mg / mL de lípidos, la sección 1), las acciones de solución de urea 10 M (sección 2.1), y la Reserva de Estabilización de fosfato (sección 2.2) se combinaron para hacer de las muestras que contienen ~ 4 proteína M, 1 mg / mL de lípidos, y de 0 a 8 M urea en incrementos de 1 M. El volumen total de cada muestra es de 200 mL. Una hoja de ejemplo (tabla 1) se incluye que los volúmenes de listas requiere el uso de 200 acciones M solución de proteína. </li><li> Muestras en blanco se hacen como se describe en la sección 2.4, sin embargo, la proteína no se añade. En lugar de proteínas, 4 l de una solución de urea 8 M se puede añadir que las concentraciones de otros componentes son idénticos a los de la sección 2.4. Estos espacios en blanco se utiliza para restar la dispersión y la señal de fondo otra que aparece en el espectro de fluorescencia de la proteína. </li><li> Las muestras de las secciones 2.4 y 2.5 se permite que se incuba a 37 ° C durante al menos 2 horas antes de la medición de los espectros de fluorescencia para asegurar plegado completo y equilibrado. </li></ol> 3. Medición de los espectros de fluorescencia Fluorescencia de triptófano de cada muestra y el blanco se mide utilizando un fluorómetro de estado estacionario. Espectros de fluorescencia debe registrarse con longitud de onda de excitación de 290 nm para evitar la excitación de los residuos de tirosina, y escaneado 305 a 500 nm. Usual de ingreso y paso de banda de salida es de 3 nm. El incremento de longitud de onda y el tiempo de integración puede ser optimizado para la relación señal-ruido. Los valores típicos para el incremento de longitud de onda y el tiempo de integración 1 nm / paso y 0.5 seg / paso, respectivamente. Proteínas de la membrana en general, se pliegan en lípidos sintéticos sólo cuando la temperatura está por encima de la temperatura de la fase de transición de dos capas. Por lo tanto, en este caso de DMPC, la temperatura de la muestra se mantiene constante a 30 º C. Una cubeta microvolumen sílice fundido con capacidad de 160 l se utiliza en estos exexperimentos. 4. Generación de la curva inicial de despliegue y la estimación de la energía libre de Gibbs de desplegamiento de proteínas de membrana <ol><li> Espectros de fluorescencia en la forma de un conjunto de datos xy se cargan en el software como Igor Pro, Matlab, origen, o Excel. </li><li> Señal desde el fondo de la vesícula urea y de los lípidos se debe restar mediante el siguiente procedimiento: Espectro de A = espectro de fluorescencia de la proteína cruda en la presencia de vesículas de lípidos y la concentración específica de la urea. Espectro B = espectro de fluorescencia de crudo de la muestra en blanco correspondiente que contiene vesículas de lípidos y la concentración de urea mismo que en el espectro de A, no es la proteína en las muestras en blanco. Espectro corregido = Espectro A - C * espectro B. C es un escalar por lo general igual a 1,0. En algunos casos, C es inferior o superior a 1,0 debido a problemas de dispersión que causa sobre o sub-resta cerca de la región 305-320 nm ~. </li><li> La longitud de onda del máximo de fluorescencia, λ max, está tabulada de los espectros corregidos para cada concentración de urea. Un valor típico para desplegada completamente proteína de la membrana es de 350 nm, mientras que la proteína plegada es de ~ 330 nm. Longitudes de onda tabulados se convierten en la fracción se desarrolló mediante la conversión de la gama de valores λ max (~ 330 a ~ 350 nm) para el rango de 0,0 a 1,0 para correlacionar el valor de λ max a la fracción de la población se desarrolló. Por ejemplo, un valor máximo de λ de 330 nm corresponde a 0,0, 350 nm corresponde a 1,0 y 340 nm corresponde a 0,5 en términos de la fracción se desarrolló. Esta fracción de la proteína desplegada se traza contra la concentración de urea. Como se mencionó anteriormente, la concentración de urea se debe determinar experimentalmente midiendo el índice de refracción. </li><li> Suponemos que la proteína puede existir en dos estados: plegar o desplegar. La trama de la fracción se desarrolló, f, frente a la concentración de urea, C, puede estar en forma para la ecuación: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Ecuación 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 2"> El coeficiente m corresponde a la tasa de cambio de la energía libre con respecto a la concentración de desnaturalizante, y C m corresponde a la concentración de urea en el punto medio en el que la población es igual a doblado la población se desarrolló. Estos valores son las variables de ajuste obtenidos a partir de los mínimos cuadrados instalación de software de análisis de datos. R (0.001987 kcal / mol • K) es la ley constante de los gases, y T es la temperatura (303 K). </li><li> Los coeficientes obtenidos del ajuste se utilizan para determinar la energía libre de Gibbs (kcal / mol) de desarrollo en ausencia de urea: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Ecuación 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 3"> . </li></ol> 5. Despliegue optimizado para la curva de medición más precisa de la energía libre de Gibbs de despliegue. <ol><li> La curva de desarrollo descritas anteriormente revela el rango de concentraciones de urea que provoca el mayor cambio en el máximo de λ. Este rango es generalmente pequeña, y la mayoría de despliegue se produce dentro de este rango pequeño. Con el fin de determinar con precisión la energía libre de desarrollo, se analizan muestras adicionales en esta región para obtener una gráfica que contiene muchos puntos de datos necesarios para la optimización de mínimos cuadrados de montaje. Por ejemplo, si la proteína se desarrolla entre 2 y 4 M de urea, las muestras se puede decir que contiene 2 a 4 M de urea en incrementos de 0,2 M a revelar con mayor precisión la forma de esta importante región de la curva de desarrollo. No es necesario medir el espectro en blanco en cada concentración de urea, sino que es suficiente para medir un espectro blanco cada paso ~ 0,5 M. </li><li> La energía libre de desarrollo obtenidos a partir de esta trama puede diferir ligeramente de los obtenidos en la curva original desarrollo, sino que refleja un valor más preciso. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <table border="1"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> final [urea], M </td><td> proteína de acciones (l) </td><td> de valores de lípidos (l) </td><td> stock 10 M urea (l) </td><td> reserva de estabilización (l) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Volumen de solución madre necesaria para hacer muestras de fluorescencia <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Triptófano espectros de fluorescencia de la proteína de ~ 5 M de membrana representante que contiene un único residuo de triptófano. (A) de los espectros de fluorescencia de la proteína cruda (espectro A partir de 4.2), (B) de los espectros de fluorescencia de crudo en blanco (espectro B de 4,2), (C) Se ha corregido espectro de 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Corregido triptófano espectros de fluorescencia de la proteína de la membrana de la Figura 1 para las concentraciones de urea numerosas. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Despliegue curva obtenida a partir de datos en la figura 2, con ajuste a la ecuación en el 4,4. La energía libre de Gibbs se calcula de acuerdo con la sección 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

El actual protocolo describe la generación de curvas de desarrollo asociados a la membrana de las proteínas y los péptidos que contienen residuos de triptófano. En este caso, se asume que la fluorescencia de triptófano refleja si la proteína se dobla y se introduce en las vesículas de lípidos sintéticos, o se desarrolló en la solución. Supuestos adicionales, como el plegado de dos estados y la dependencia lineal de energía libre con la concentración de desnaturalizante, se hacen en el presente informe;. Modificación de ...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Plegamiento de proteínas de membrana es un tema emergente con un significado fundamental y relacionadas con la salud. La abundancia de proteínas de membrana en las células subyace la necesidad de un estudio integral del plegamiento de esta familia de proteínas en todas partes. Además, los avances en nuestra capacidad para caracterizar las enfermedades asociadas con las proteínas mal plegadas, han motivado importantes esfuerzos experimentales y teóricos en el campo de plegamiento de proteínas. Los rápidos avances en este campo tan importante es, por desgracia obstaculizado por los problemas inherentes asociados con las proteínas de membrana y de la complejidad del mecanismo de plegado. Aquí, se describe un procedimiento experimental para la medición de la propiedad termodinámica de la energía libre de Gibbs se desarrolla en ausencia de desnaturalizante, Δ G ° H 2 O, una proteína de membrana integral representante de E. coli. Este protocolo se centra en la aplicación de la espectroscopia de fluorescencia para determinar las poblaciones de equilibrio de los estados plegado y desplegado en función de la concentración de desnaturalizante. Consideraciones experimentales para la preparación de vesículas de lípidos sintéticos, así como pasos clave en el procedimiento de análisis de datos se destacan. Esta técnica es muy versátil y puede llevarse a cabo con diferentes tipos de desnaturalizante, incluyendo la temperatura y pH, así como en diversos entornos de plegado de los lípidos y las micelas. El protocolo actual es el que puede ser generalizado a cualquier membrana o proteínas solubles que se reúne el conjunto de los criterios expuestos.

Este artículo detalla el procedimiento de vídeo experimental para la obtención de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas de membrana de triptófano fluorescencia.

Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

El plegamiento de las proteínas de membrana es un tema emergente con una importancia tanto fundamental como relacionada con la salud. La abundancia de proteínas de membrana en las células...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la termodinámica asociada al plegamiento de proteínas de membrana. Esto se logra primero ensamblando vesículas pequeñas de LAR para proporcionar un entorno de plegamiento para la proteína de membrana. Una vez construidas, las vesículas se utilizan para preparar muestras que contienen proteína y concentraciones sistemáticamente variables de urea.A continuación, se mide el espectro fluorescente del triptófano de cada muestra con el fin de recopilar los datos necesarios para generar una curva de desnaturalización de proteínas de membrana; los resultados obtenidos muestran cómo se puede obtener la energía libre de Gibbs de la desnaturalización de proteínas de membrana basándose en curvas de desnaturalización generadas a partir de espectros fluorescentes del triptófano. Hola, me llamo Judy Kim. Soy profesora asistente en la Universidad de California en San Diego.El método que está a punto de ver revela una propiedad importante de las proteínas de membrana. En concreto, le mostraremos cómo medir la estabilidad de una proteína plegada e insertada en una bicapa lipídica. Mi nombre es Diana Ottinger, y soy estudiante de posgrado en el Departamento de Química de la uc, San Diego.Hoy, demostraremos este método en una proteína de membrana representativa. Sin embargo, esta técnica es general y puede aplicarse a otros sistemas biológicos, como péptidos asociados a membranas y proteínas solubles. Así que comencemos.Antes de comenzar este protocolo, adquiera una solución de un dos DME aceite, SN glicerol, tres fosfocolina o DMPC, lípido en cloroformo y Eloqua en viales de vidrio limpios. En cantidades de 20 miligramos por vial, agregue una capa de gas nitrógeno a cada vial para prevenir la oxidación del lípido y selle los viales. Se utiliza un solo vial que contiene 20 miligramos de lípido en cloroformo para cada experimento.Para preparar la solución stock de vesículas, comience por secar el contenido del vial bajo una corriente de gas nitrógeno durante una hora, utilizando un septo de teflón y agujas hasta que no quede disolvente. Añada un mililitro de tampón de fosfato de potasio 20 milimolar, pH 7,3, a los lípidos secos y resuspenda durante aproximadamente 30 segundos en un baño de agua. Transfiera la suspensión turbia resultante a un tubo plástico de 15 mililitros con fondo cónico mediante una pipeta.Añada un mililitro adicional de tampón fosfato al vial de vidrio vacío que originalmente contenía el lípido, y repita la sonicación. Añada la suspensión resultante al mismo tubo de 15 mililitros. Repita este proceso un total de cuatro veces para obtener un volumen final de cuatro mililitros y una concentración de lípidos de cinco miligramos por mililitro.Coloque la suspensión de vesículas lipídicas en un baño de agua tibia y sométala a ultrasonido utilizando una punta micro de ultrasonido durante una hora con un ciclo de trabajo del 50%. El baño de agua sirve para evitar que la solución lipídica se caliente en exceso y mantiene la temperatura de la solución lipídica acuosa por encima de la temperatura de transición de fase de bicapa.Filtre la solución SONICADA a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones para eliminar los residuos procedentes de la punta del sonificador y deje que la solución filtrada se equilibre durante la noche a 37 grados Celsius. Para preparar la muestra para el plegamiento fluorescente inicial, prepare una solución stock de 10 M de urea en tampón fosfato 20 mM y una solución tampón stock de fosfato 20 mM. Según el protocolo escrito, la concentración de urea debe determinarse experimentalmente midiendo el índice de refracción con un refractómetro y comparándolo con valores conocidos.A continuación, prepare una solución stock de proteína desnaturalizada a una concentración de aproximadamente 200 micromolar de proteína en urea ocho molar, tampón fosfato 20 milimolar. En este video, la proteína de membrana OPA A se utiliza para demostrar el protocolo; las muestras para estudios fluorescentes se preparan combinando volúmenes adecuados de la solución stock de proteína, solución stock de lípido, solución stock de urea diez molar y tampón fosfato stock para obtener muestras que contengan aproximadamente cuatro micromolar de proteína, un miligramo por mililitro de lípido y de cero a ocho molar de urea en incrementos de un molar, obteniendo un volumen total de 200 microlitros. Las muestras en blanco se preparan de la misma manera.Sin embargo, se sustituyen cuatro microlitros de solución de urea ocho molar por proteína. Estos blancos se preparan con el fin de restar las señales de dispersión y de fondo que aparecen en los espectros fluorescentes de la proteína. Incubar las muestras de proteína en los blancos a 37 grados Celsius durante al menos dos horas antes de la medición de los espectros fluorescentes.Para garantizar el plegamiento completo, encienda el fluorímetro una hora antes de las mediciones. Las proteínas de membrana generalmente se pliegan en lípidos sintéticos solo cuando la temperatura está por encima de la temperatura de transición de fase de la bicapa. Por lo tanto, en el caso del DMPC, la temperatura del porta muestras en el fluorímetro se ajusta a 30 grados Celsius.Configure el experimento de fluorescencia en un fluorímetro de estado estacionario y mida la fluorescencia de triptófano de cada muestra en blanco. La longitud de onda de excitación debe ajustarse a 290 nanómetros para evitar la excitación de residuos de tirosina, y la emisión debe registrarse entre 305 y 500 nanómetros. Utilice un paso de banda de entrada y salida de tres nanómetros.El incremento de longitud de onda y el tiempo de integración pueden optimizarse para obtener la relación señal-ruido. Los valores típicos para el incremento de longitud de onda y el tiempo de integración son un nanómetro por paso y 0,5 segundos por paso, respectivamente. Pipetee 200 microlitros de la muestra en una celda de cuarzo de microvolumen Q Vet con capacidad de 160 microlitros y coloque la qve en el soporte de qve de la máquina.Finalmente, se pueden iniciar las mediciones de fluorescencia: cargue una hoja de datos XY de los espectros de fluorescencia en un software como Igor Pro, MATLAB Origin o Excel. Para esta demostración, se utilizará Igor Pro para eliminar el fondo de urea y de las vesículas lipídicas, multiplicar el espectro de fluorescencia de la muestra en blanco por el factor de escala S y restarlo del espectro de fluorescencia crudo de la solución de proteína con lípidos. En la pestaña correspondiente a la concentración de urea, tabule la longitud de onda de máxima fluorescencia o lambda máx. a partir del espectro corregido.Para cada concentración de urea. Un valor típico para una proteína de membrana completamente desnaturalizada es 350 nanómetros. Mientras que el de una proteína plegada es aproximadamente 330 nanómetros, traduzca las longitudes de onda tabuladas a fracción desnaturalizada convirtiendo el rango de valores de lambda máx. a un rango entre cero y uno, correlacionando el valor de lambda máx. con la fracción de la población desnaturalizada.Luego represente gráficamente la fracción de proteína desnaturalizada frente a la concentración de urea. La gráfica de la fracción desnaturalizada F frente a la concentración de urea C puede ajustarse a una ecuación que supone que la proteína puede existir en estado plegado o desnaturalizado. El coeficiente M corresponde a la velocidad de cambio de la energía libre con respecto al agente desnaturalizante y a la concentración, y CM corresponde a la concentración media de urea en la que la población plegada es igual a la población desnaturalizada.R es la constante de la ley de los gases, y T es la temperatura en Kelvin. El procedimiento de ajuste proporciona los valores de los coeficientes m y cm.Estos coeficientes se multiplican para determinar delta G, la energía libre de Gibbs de desnaturalización en ausencia de urea. La curva de desnaturalización descrita revela el rango de concentraciones de urea que provoca el mayor cambio en la lambda máxima. Este rango suele ser pequeño y la mayor parte de la desnaturalización ocurre dentro de este pequeño intervalo con el fin de determinar con precisión la energía libre de desnaturalización.Se deberían analizar muestras adicionales en esta región para obtener una gráfica que contenga los muchos puntos de datos necesarios para un ajuste óptimo por mínimos cuadrados. Por ejemplo, si la proteína se desnaturaliza entre dos y cuatro moles de urea, se pueden preparar muestras entre estas concentraciones de urea en incrementos de 0,2 moles para revelar con mayor precisión la forma de esta región importante en la curva de desnaturalización. Se debe incluir un blanco al menos cada 0,5 moles y cada 0,2 moles para obtener los mejores resultados.La energía libre de desnaturalización obtenida a partir de esta gráfica puede diferir ligeramente de la obtenida en la curva original de desnaturalización, pero refleja un valor más preciso mostrado. A continuación se presentan los espectros de fluorescencia de triptófano de la proteína de membrana representativa om a que contiene un único residuo de triptófano. El espectro de fluorescencia crudo del blanco se resta de los espectros de fluorescencia crudos de la proteína, tal como se describe en el protocolo, dando como resultado el espectro corregido.Se muestra aquí el espectro fluorescente corregido de triptófano de la proteína de membrana para numerosas concentraciones de urea, según los métodos descritos. En esta demostración, se generó una curva de desnaturalización bajo el supuesto de que la proteína está o bien plegada o desplegada, y de que no existe un estado estable. El parámetro M refleja la cantidad de polipéptido expuesta al disolvente tras el desplegamiento, mientras que CM es un valor importante que describe la desnaturalización y la concentración necesaria para alcanzar una población igual de formas plegadas y desplegadas.Valores elevados de CM y M indican una proteína estable. La energía libre de Gibbs de desnaturalización se calculó en 6,2 kilocalorías por mol para OPA a siguiendo este procedimiento. Otros métodos de desnaturalización, como calor, pH y otros agentes químicos desnaturalizantes, pueden utilizarse para obtener información análoga sobre la termodinámica del plegamiento proteico.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la estabilidad de una proteína basándose en las diferentes propiedades de fluorescencia de los estados plegados y desplegados. Alternativamente, también podría generar una curva de desnaturalización utilizando otros métodos, como la dicromía circular, la turbidez, siempre que el método informe sobre la conformación de la proteína, independientemente de la herramienta analítica que elija. El método de las curvas de desnaturalización es versátil y puede aplicarse a una amplia variedad de proteínas de membrana y solubles.

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La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

Presentamos un protocolo para la caracterización rápida de biomolecular plegado y encuadernación interacciones con ligandos termolábiles utilizando calorimetría diferencial.

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Muchas proteínas en la célula de sensación e inducen curvatura de la membrana. Se describe un método para nanotubos de membrana de las vesículas de lípidos para el estudio de la interacción de proteínas o cualquier molécula activa de curvatura con membranas curvo in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

El presente protocolo describe un procedimiento para realizar cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente (FSEC) en proteínas de membrana para evaluar su calidad para el análisis funcional y estructural posterior. Se presentan resultados representativos de FSEC recopilados para varios receptores acoplados a proteínas G (GPCR) en condiciones de solubilización detergente y sin detergente.

Evaluación rápida de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente

Aquí, presentamos el protocolo para estudiar la flexibilidad y dinámica local de biomoléculas utilizando anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a nivel de una sola molécula en modo de microscopía confocal.

Anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas

Aprende a medir la termodinámica del plegado de proteínas de membrana mediante espectroscopia de fluorescencia de triptófano en vesículas LAR. Este método permite calcular la energía libre de Gibbs.

Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

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