Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es medir la termodinámica asociada al plegamiento de proteínas de membrana. Esto se logra primero ensamblando vesículas pequeñas de LAR para proporcionar un entorno de plegamiento para la proteína de membrana. Una vez construidas, las vesículas se utilizan para preparar muestras que contienen proteína y concentraciones sistemáticamente variables de urea.

A continuación, se mide el espectro fluorescente del triptófano de cada muestra con el fin de recopilar los datos necesarios para generar una curva de desnaturalización de proteínas de membrana; los resultados obtenidos muestran cómo se puede obtener la energía libre de Gibbs de la desnaturalización de proteínas de membrana basándose en curvas de desnaturalización generadas a partir de espectros fluorescentes del triptófano. Hola, me llamo Judy Kim. Soy profesora asistente en la Universidad de California en San Diego.

El método que está a punto de ver revela una propiedad importante de las proteínas de membrana. En concreto, le mostraremos cómo medir la estabilidad de una proteína plegada e insertada en una bicapa lipídica. Mi nombre es Diana Ottinger, y soy estudiante de posgrado en el Departamento de Química de la uc, San Diego.

Hoy, demostraremos este método en una proteína de membrana representativa. Sin embargo, esta técnica es general y puede aplicarse a otros sistemas biológicos, como péptidos asociados a membranas y proteínas solubles. Así que comencemos.

Antes de comenzar este protocolo, adquiera una solución de un dos DME aceite, SN glicerol, tres fosfocolina o DMPC, lípido en cloroformo y Eloqua en viales de vidrio limpios. En cantidades de 20 miligramos por vial, agregue una capa de gas nitrógeno a cada vial para prevenir la oxidación del lípido y selle los viales. Se utiliza un solo vial que contiene 20 miligramos de lípido en cloroformo para cada experimento.

Para preparar la solución stock de vesículas, comience por secar el contenido del vial bajo una corriente de gas nitrógeno durante una hora, utilizando un septo de teflón y agujas hasta que no quede disolvente. Añada un mililitro de tampón de fosfato de potasio 20 milimolar, pH 7,3, a los lípidos secos y resuspenda durante aproximadamente 30 segundos en un baño de agua. Transfiera la suspensión turbia resultante a un tubo plástico de 15 mililitros con fondo cónico mediante una pipeta.

Añada un mililitro adicional de tampón fosfato al vial de vidrio vacío que originalmente contenía el lípido, y repita la sonicación. Añada la suspensión resultante al mismo tubo de 15 mililitros. Repita este proceso un total de cuatro veces para obtener un volumen final de cuatro mililitros y una concentración de lípidos de cinco miligramos por mililitro.

Coloque la suspensión de vesículas lipídicas en un baño de agua tibia y sométala a ultrasonido utilizando una punta micro de ultrasonido durante una hora con un ciclo de trabajo del 50%. El baño de agua sirve para evitar que la solución lipídica se caliente en exceso y mantiene la temperatura de la solución lipídica acuosa por encima de la temperatura de transición de fase de bicapa.

Filtre la solución SONICADA a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones para eliminar los residuos procedentes de la punta del sonificador y deje que la solución filtrada se equilibre durante la noche a 37 grados Celsius. Para preparar la muestra para el plegamiento fluorescente inicial, prepare una solución stock de 10 M de urea en tampón fosfato 20 mM y una solución tampón stock de fosfato 20 mM. Según el protocolo escrito, la concentración de urea debe determinarse experimentalmente midiendo el índice de refracción con un refractómetro y comparándolo con valores conocidos.

A continuación, prepare una solución stock de proteína desnaturalizada a una concentración de aproximadamente 200 micromolar de proteína en urea ocho molar, tampón fosfato 20 milimolar. En este video, la proteína de membrana OPA A se utiliza para demostrar el protocolo; las muestras para estudios fluorescentes se preparan combinando volúmenes adecuados de la solución stock de proteína, solución stock de lípido, solución stock de urea diez molar y tampón fosfato stock para obtener muestras que contengan aproximadamente cuatro micromolar de proteína, un miligramo por mililitro de lípido y de cero a ocho molar de urea en incrementos de un molar, obteniendo un volumen total de 200 microlitros. Las muestras en blanco se preparan de la misma manera.

Sin embargo, se sustituyen cuatro microlitros de solución de urea ocho molar por proteína. Estos blancos se preparan con el fin de restar las señales de dispersión y de fondo que aparecen en los espectros fluorescentes de la proteína. Incubar las muestras de proteína en los blancos a 37 grados Celsius durante al menos dos horas antes de la medición de los espectros fluorescentes.

Para garantizar el plegamiento completo, encienda el fluorímetro una hora antes de las mediciones. Las proteínas de membrana generalmente se pliegan en lípidos sintéticos solo cuando la temperatura está por encima de la temperatura de transición de fase de la bicapa. Por lo tanto, en el caso del DMPC, la temperatura del porta muestras en el fluorímetro se ajusta a 30 grados Celsius.

Configure el experimento de fluorescencia en un fluorímetro de estado estacionario y mida la fluorescencia de triptófano de cada muestra en blanco. La longitud de onda de excitación debe ajustarse a 290 nanómetros para evitar la excitación de residuos de tirosina, y la emisión debe registrarse entre 305 y 500 nanómetros. Utilice un paso de banda de entrada y salida de tres nanómetros.

El incremento de longitud de onda y el tiempo de integración pueden optimizarse para obtener la relación señal-ruido. Los valores típicos para el incremento de longitud de onda y el tiempo de integración son un nanómetro por paso y 0,5 segundos por paso, respectivamente. Pipetee 200 microlitros de la muestra en una celda de cuarzo de microvolumen Q Vet con capacidad de 160 microlitros y coloque la qve en el soporte de qve de la máquina.

Finalmente, se pueden iniciar las mediciones de fluorescencia: cargue una hoja de datos XY de los espectros de fluorescencia en un software como Igor Pro, MATLAB Origin o Excel. Para esta demostración, se utilizará Igor Pro para eliminar el fondo de urea y de las vesículas lipídicas, multiplicar el espectro de fluorescencia de la muestra en blanco por el factor de escala S y restarlo del espectro de fluorescencia crudo de la solución de proteína con lípidos. En la pestaña correspondiente a la concentración de urea, tabule la longitud de onda de máxima fluorescencia o lambda máx. a partir del espectro corregido.

Para cada concentración de urea. Un valor típico para una proteína de membrana completamente desnaturalizada es 350 nanómetros. Mientras que el de una proteína plegada es aproximadamente 330 nanómetros, traduzca las longitudes de onda tabuladas a fracción desnaturalizada convirtiendo el rango de valores de lambda máx. a un rango entre cero y uno, correlacionando el valor de lambda máx. con la fracción de la población desnaturalizada.

Luego represente gráficamente la fracción de proteína desnaturalizada frente a la concentración de urea. La gráfica de la fracción desnaturalizada F frente a la concentración de urea C puede ajustarse a una ecuación que supone que la proteína puede existir en estado plegado o desnaturalizado. El coeficiente M corresponde a la velocidad de cambio de la energía libre con respecto al agente desnaturalizante y a la concentración, y CM corresponde a la concentración media de urea en la que la población plegada es igual a la población desnaturalizada.

R es la constante de la ley de los gases, y T es la temperatura en Kelvin. El procedimiento de ajuste proporciona los valores de los coeficientes m y cm.

Estos coeficientes se multiplican para determinar delta G, la energía libre de Gibbs de desnaturalización en ausencia de urea. La curva de desnaturalización descrita revela el rango de concentraciones de urea que provoca el mayor cambio en la lambda máxima. Este rango suele ser pequeño y la mayor parte de la desnaturalización ocurre dentro de este pequeño intervalo con el fin de determinar con precisión la energía libre de desnaturalización.

Se deberían analizar muestras adicionales en esta región para obtener una gráfica que contenga los muchos puntos de datos necesarios para un ajuste óptimo por mínimos cuadrados. Por ejemplo, si la proteína se desnaturaliza entre dos y cuatro moles de urea, se pueden preparar muestras entre estas concentraciones de urea en incrementos de 0,2 moles para revelar con mayor precisión la forma de esta región importante en la curva de desnaturalización. Se debe incluir un blanco al menos cada 0,5 moles y cada 0,2 moles para obtener los mejores resultados.

La energía libre de desnaturalización obtenida a partir de esta gráfica puede diferir ligeramente de la obtenida en la curva original de desnaturalización, pero refleja un valor más preciso mostrado. A continuación se presentan los espectros de fluorescencia de triptófano de la proteína de membrana representativa om a que contiene un único residuo de triptófano. El espectro de fluorescencia crudo del blanco se resta de los espectros de fluorescencia crudos de la proteína, tal como se describe en el protocolo, dando como resultado el espectro corregido.

Se muestra aquí el espectro fluorescente corregido de triptófano de la proteína de membrana para numerosas concentraciones de urea, según los métodos descritos. En esta demostración, se generó una curva de desnaturalización bajo el supuesto de que la proteína está o bien plegada o desplegada, y de que no existe un estado estable. El parámetro M refleja la cantidad de polipéptido expuesta al disolvente tras el desplegamiento, mientras que CM es un valor importante que describe la desnaturalización y la concentración necesaria para alcanzar una población igual de formas plegadas y desplegadas.

Valores elevados de CM y M indican una proteína estable. La energía libre de Gibbs de desnaturalización se calculó en 6,2 kilocalorías por mol para OPA a siguiendo este procedimiento. Otros métodos de desnaturalización, como calor, pH y otros agentes químicos desnaturalizantes, pueden utilizarse para obtener información análoga sobre la termodinámica del plegamiento proteico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la estabilidad de una proteína basándose en las diferentes propiedades de fluorescencia de los estados plegados y desplegados. Alternativamente, también podría generar una curva de desnaturalización utilizando otros métodos, como la dicromía circular, la turbidez, siempre que el método informe sobre la conformación de la proteína, independientemente de la herramienta analítica que elija. El método de las curvas de desnaturalización es versátil y puede aplicarse a una amplia variedad de proteínas de membrana y solubles.