Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan en el Departamento de Patología de la Universidad de California, Irvine. Y hoy les voy a mostrar cómo hacer inmunoquímica de células precursoras neurales humanas.

Este protocolo incluye la colocación de células en cubreobjetos recubiertos y el bloqueo e incubación de células en anticuerpo primario durante la noche, y luego la realización de varias pruebas y la colocación de anticuerpos secundarios y a temperatura ambiente. Y, por último, el montaje de los deslizamientos de la cubierta en los vuelos de los microscopios. Empecemos.

Así que primero voy a colocar tres cubreobjetos estériles de vidrio alemán de 12 milímetros de ancho en una placa de 24 pocillos para recubrirlos con laminado. Así que ahora tengo mis cubreobjetos en la placa, y primero voy a añadir una solución de polilisina PDL, y voy a incubar los submarinos de la cubierta en PDL durante cinco minutos a temperatura ambiente. Así que ahora, al final de cinco minutos, voy a quitar el PDL y ponerle laminina, y voy a incubar los cubreobjetos en laminado durante al menos cuatro horas o más durante la noche.

Así que he incubado la placa durante la noche en laminado, y ahora voy a enjuagar las hojas de cubierta con PBS y placas de células precursoras neuronales humanas que ya he contado. Así que acabo de quitar las soluciones de laminado y ahora voy a refrenar los cubreobjetos con PBS. Así que ahora voy a quitar PBS y poner la solución de medios.

Y finalmente, estoy listo para ver las células. Así que voy a ver las celdas a cien mil celdas por mil, lo que significa que para una placa de 24 pocillos voy a agregar 50.000 celdas por pocillo, porque cada pocillo contiene medio mililitro. Así que voy a inclinar la placa de lado a lado para asegurarme de que las celdas se extiendan uniformemente en la superficie del cubreobjetos.

Y ahora voy a ponerlos en la incubadora durante al menos 24 horas para que se calmen y se extiendan para la inmunoquímica. Así que las células han estado creciendo durante 24 horas y las miré y están unidas y bien distribuidas. Así que ahora voy a arreglarlos con 4%perfor height durante cinco minutos.

Pero primero voy a quitar los medios y no quiero dejar que las células se sequen. Así que voy a eliminar el medio y agregar fijador al mismo tiempo. Por eso se llama técnica a dos manos.

Así que ahora voy a incubar las células en fijador durante cinco minutos a temperatura ambiente. Así que han pasado cinco minutos. Voy a quitar el PFA y colocarlo en el contenedor de residuos de PFA y agregar PBS al mismo tiempo que elimino el PFA para que las celdas no se sequen.

Así que voy a usar una de estas pipetas de succión de plástico para extraer PFA y voy a configurar el temporizador durante cinco minutos. Entonces, mientras mis células están en PBS wash, voy a preparar una solución de visualización permanente usando Triton X 100. Es un detergente no iónico y es muy, muy viscoso.

Por lo tanto, es importante esperar hasta que toda la solución entre y entre en la pipeta. Así que voy a preparar una solución del 0.3% en PBS, voy a agregar 10 milésimas de pulgada de PBS. Y a estos 10 milésimas de pulgada de PBS, voy a añadir 30 microlitros de tri next 100.

Así que voy a agregar 30 microlitros de tri luego de 100 a 10 milésimas de pulgada de PBS. Así que voy a agregar unos 10 segundos para que toda la solución entre en la punta. Así que yo, tengo aquí mi solución de utilización de perme.

Lo pongo en el rotador durante 10 minutos, y luego lo hago en vórtice para asegurarme de que el tritton viscoso se disuelva por completo. Así que ahora estoy listo para hacer el paso de visualización de perme. Y así voy a hacerlo, durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Así que han pasado cinco minutos. Voy a hacer ahora tres lavados de PBS de cinco minutos para asegurarme de lavar todo el tritón. Así que, una vez más, voy a poner el reloj en cinco minutos.

Así que acabo de terminar todos mis pasos de lavado, así que estoy listo para hacer el paso de bloqueo. Entonces, para el paso de bloqueo, he preparado una solución 5%BSA en PBS. Y al igual que con todos los lavados, voy a quitar el PBS y agregar la solución de bloqueo al mismo tiempo.

Y el paso de bloqueo va a durar una hora a temperatura ambiente. Entonces, mientras mis células están en bloqueo, voy a preparar la placa para la incubación primaria de anticuerpos. Así que voy a empezar con esta placa de vidrio, y voy a cortar un pedazo de película paradistinta de este tamaño.

Y lo que voy a hacer es envolverlo y necesito un poco de cinta adhesiva, así que voy a necesitar cuatro pedazos de cinta. Así que voy a prepararlos todos. Así que voy a tomar este trozo de película para para y voy a enderezarlo para que la superficie quede bonita y lisa.

Y luego voy a tomar cada extremo y pegarlo con cinta adhesiva a la parte posterior de la placa de vidrio. Así que ahora voy a tirar de esto en el otro extremo para asegurarme de que las superficies estén rectas, y voy a pegar el otro extremo con cinta adhesiva a la parte posterior. Así que ahora necesito otro trozo de película de par del mismo tamaño que el primero.

Y básicamente voy a hacer lo mismo. Así que pegué un segundo pedazo de película parafísica encima del primero, solo, igual que el primero, excepto que dejé un extremo del segundo pedazo de perfil suelto porque voy a colocar la solución de anticuerpos y luego los deslizamientos de energía en el primer pedazo. Y luego voy a colocar la segunda pieza encima que está haciendo un sándwich.

Pero en este momento, voy a etiquetar el lugar donde voy a poner la solución de anticuerpos y la cubierta. Entonces, las células han estado en la solución de bloqueo durante una hora, y ahora voy a poner los cubreobjetos en las gotas de anticuerpo primario para la incubación durante la noche. Así que voy a colocar una gota de 35 microlitros de anticuerpo primario, y voy a tener mucho cuidado de no expulsar todo el líquido porque eso podría crear burbujas y las burbujas podrían interferir con la unión del anticuerpo al antígeno.

Así que quiero tratar de evitar tener burbujas en la gota, las tres gotas de anticuerpo primario, y estoy listo para cubrir, cubrir los trozos con células en estas gotas. Así que lo que voy a hacer ahora es recoger una hoja de portada. Así que primero voy a mover el cubreobjetos hacia un lado e intentar levantarlo suavemente con las pinzas abiertas.

Tan pronto como sienta que he agarrado el cubreobjetos, voy a cerrar lentamente las pinzas y levantar suavemente el cubreobjetos del pozo. Por lo tanto, las celdas en este momento están en la parte superior de la hoja de cubierta. Así que lo que voy a hacer es invertir invertida y tocar suavemente la gota y ponerla lentamente encima de la gota sin crear burbujas.

Y por eso voy a repetir el mismo procedimiento con el segundo y tercer cubreobjetos. Y el paso final es colocar la segunda pieza de película paradistinta encima. Y la forma en que lo voy a hacer es que lo voy a poner en un movimiento como ese.

Quiero tratar de evitar moverme, moverlo de un lado a otro. Y por último voy a asegurarlo al fondo del plato con otro trozo de cinta adhesiva. Y ahora, finalmente, las células están listas para ser incubadas a cuatro grados durante la noche, y este es el final del primer día de la inmunoquímica.

Este es el segundo día de inmunoquímica, y voy a lavar los cubreobjetos en PB S3 veces durante cinco minutos. Y luego voy a incubar en un anticuerpo secundario durante dos horas a temperatura ambiente. Primero, voy a cortar la película para así para poder quitar los cubreobjetos.

Y voy a levantar la pieza superior de la película para el cuidado lentamente para que los deslizamientos de la cubierta permanezcan en la pieza inferior de la película para el cuidado. Así que he quitado la primera pieza y tengo lista la placa con solución de lavado PBS. Así que voy a levantar cada sopa de cubierta y colocarla en el pozo para lavar cualquier anticuerpo primario restante que no se haya adherido al epítopo.

Entonces, para levantar el cubreobjetos, primero lo sostendré así con una cuchilla de afeitar y trataré de recogerlo suavemente. Y ya que las células están, estamos frente a la solución de anticuerpos, voy a voltearlas para que estén en la parte superior ahora y luego las deslizaré en el pozo para que aún queden en la parte superior. Y voy a repetir el procedimiento para los deslizamientos de energía restantes.

Y así se van a lavar durante cinco minutos. Así que han pasado cinco minutos. Voy a reemplazar la solución PBS.

Voy a añadir el dado de los ganchos. Ahora voy a incubarlo durante cinco minutos. Así que la incubación de los ganchos ha terminado, y ahora estoy listo para montar la cubierta sos y, y mirarlos.

Así que primero voy a aplicar un escudo vectorial cuádruple, que ayuda a mantener las monedas de diez centavos fluorescentes alejadas para el blanqueo. Voy a, bueno, primero voy a etiquetar la diapositiva con los números de cubreobjetos, y luego voy a colocar 10 microlitros de escudo vectorial. El escudo vectorial es, es un aceite y es muy viscoso, por lo que también es importante esperar un poco hasta que todo entre en la punta.

Así que coloqué el escudo vectorial en el portaobjetos del microscopio, y ahora estoy listo para colocar los cubreobjetos en el portaobjetos del microscopio. Entonces, lo que voy a hacer primero es tomar un cubreobjetos y voy a enjuagar la parte posterior del cubreobjetos con agua desionizada, porque si no lo hago, cuando se seque, la sal que estaba en PBS se va a cristalizar y va a interferir con las propiedades ópticas de los troqueles fluorescentes. Así que voy a hacerlo, tengo mi agua desionizada lista.

Así que voy a recoger la tapa y voy a enjuagar la parte posterior con agua desionizada. Y luego voy a tocar la toallita de hojalata para secarlo. Y luego voy a invertirlo de nuevo para que el lado de la célula se invierta y baje al portaobjetos del microscopio.

Y al igual que antes, voy a tocar la gota de escudo vectorial y bajarla lentamente sin atrapar ninguna burbuja. Y voy a repetir el mismo, el mismo procedimiento, para todos los volteos de carga. Y ahora vamos a echar un vistazo.

Este es un ejemplo de lo que se puede obtener después de hacer inmunoquímica y obtener sus imágenes y hacer superposiciones y demás. Así que en esta imagen, esta es una imagen de células madre neuro del hipocampo aisladas de dent gys en ratones postnatales. Hoy os he enseñado cómo hacer inmunoquímica de células precursoras neurales humanas.

Y si te das cuenta, esta técnica te permite guardar el reactivo de anticuerpos expansivos. Utilizamos un volumen muy pequeño de anticuerpo primario y secundario colocando una pequeña gota sobre un perfil e invirtiendo el cubreobjetos con las células encima. Así que continúe, haga química de inmunoterapia, y gracias por mirarme.