A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un sistema Gus reportero para analizar las propiedades de muerte potencial de genes específicos. Los genes de interés se clonan en un casete Gus y se cultivan en los vectores agrobacterium apropiados bajo un promotor de 35 s. A continuación, estos vectores se transforman en la cepa de Agrobacterium, LBA 44 0 4, y se mezclan con un cultivo que contiene un casete de expresión de Gus para infiltrar las hojas de Nick Oceana Hamana.

La actividad de Gus puede evaluarse visualmente mediante tinción histoquímica o cuantitativamente mediante un ensayo de taza fluormétrica. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el escalonamiento del ADN o el ensayo de túnel, que se utiliza habitualmente en los sistemas de mamíferos, pero es difícil de reproducir en las plantas, es que se trata de un ensayo transitorio sensible y rápido basado en plantas que aprovecha el simple hecho de que se requieren células vivas para que se produzca la expresión del gas. Demostrando el procedimiento hoy estarán los Hua RAOs.

Un investigador postdoctoral asociado en nuestro laboratorio La infiltración requiere hojas sanas completamente expandidas de plantas de nicotiana hamana de tres a seis semanas de edad cultivadas a 25 grados centígrados. Planea llevar a cabo este protocolo durante ocho días. En el primer día, las rejillas de rayas con reservas de glicerol de agrobacterium tumor fassan que contienen los vectores para el ensayo de muerte celular y el vector con el casete de expresión de Gus también incluyen siempre un vector vacío como control negativo o relleno cuando se están probando múltiples combinaciones de cultivos.

Incubar las placas a 28 grados centígrados durante dos días. Al tercer día, inocular dos mililitros de LB selectivo con una sola colonia de cada placa. Incubar cada cultivo agitando a 28 grados centígrados durante 24 horas a 200 RPM hasta alcanzar la densidad máxima de crecimiento.

Después de 24 horas de incubación, resuspender completamente el cultivo pipeteando si hay aglomeración, y aumentar el volumen total de cada cultivo a 10 mililitros con LB selectivo fresco para inducir genes de virulencia de agrobacterias. Agregue acetona a 25 micromolares e incube cada cultivo agitando a 28 grados centígrados durante otras 16 horas. El siguiente paso es centrifugar cada cultivo a 4.000 Gs durante 10 minutos a temperatura ambiente y Resus, suspender el pellet en 10 mililitros de medio de infiltración.

No agregue acetona, centrifugar los cultivos nuevamente, pero ahora Resus. Suspenda cada pellet en cinco mililitros de medio de infiltración que contenga acetona de 100 micromolares. Ahora mida el diámetro exterior a 600 nanómetros.

Concentraciones tan bajas como 0,1 son aceptables, pero si son superiores a 0,9, diluir a 0,9 con infiltración, medio y acetona antes de la infiltración. Incubar los cultivos una vez más a 28 grados centígrados agitando durante tres horas después de la incubación. Mezcle los cultivos experimentales y los cultivos de control en una proporción de uno a uno con el cultivo que contiene el casete Gus.

Para cada cultivo, use una jeringa sin aguja de un mililitro para infiltrar el sello ABA o la parte inferior de las hojas recién emergentes. El volumen de infiltración no es importante. Cuando se forma un área de remojo de agua se ha agregado suficiente, infiltre tanto el control negativo como el gen para analizar hojas opuestas en la misma planta, luego infiltre dos plantas más de la misma manera.

Por lo tanto, hay plantas triplicadas para cada cultivo. Tres días después de la infiltración, es el momento de recolectar las hojas y analizar la expresión de la proteína de ráfaga. Comience el análisis histoquímico infiltrando al vacío toda la hoja con sustrato xlu hasta que esté completamente empapada.

Ahora, incube las hojas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche o hasta que aparezca una mancha azul distintiva cuando la mancha azul sea evidente. Enjuague las hojas en agua destilada e incube en etanol al 70% durante la noche hasta que se elimine la clorofila. Al día siguiente, enjuague las hojas y el agua destilada y evalúe los niveles de expresión de GUS.

Para cuantificar la expresión de Gus, una taza de sustrato se convierte en un producto fluorescente mu, que se puede medir a partir de la molienda de discos de hojas infiltrados en un mortero utilizando nitrógeno líquido. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de extracción GUS mientras mantiene la muestra en hielo. Ahora centrifuga la suspensión a 14.000 GS por cinco minutos a cuatro grados centígrados, y recoge el sobrenadante que contiene el total de proteínas solubles, que incluye Gus.

Mida la concentración total de proteína soluble utilizando un NanoDrop y ajuste la concentración a 100 microgramos de proteína total para cada muestra en el tampón de extracción Gus. Ahora, agregue el sustrato de la taza en el tampón de extracción Gus a cada muestra hasta una concentración final de dos milimolares de taza. Un volumen total de 100 microlitros por muestra debe ser suficiente mezclado por pipeteo e incubar la reacción durante una hora a 37 grados centígrados.

Después de una hora, detenga la reacción agregando 800 microlitros de tampón de parada de ráfagas. Para cuantificar el mu, se cargan 100 microlitros de cada muestra en una placa de microtitulación, que se analiza en un lector de placas, se mide la fluorescencia a 365 nanómetros de excitación, se miden longitudes de onda de emisión de 455 nanómetros y, en comparación con una curva estándar, la actividad de Guss se puede informar como M de mu por microgramo de proteína soluble total por minuto de reacción. Se detectan varios niveles de ráfagas dependiendo de la construcción utilizada cuando el casete de expresión de GUS se infiltra con un regulador negativo de la muerte celular o un gen anti-muerte.

En comparación, se observan niveles de ráfagas altas. Los niveles de Gus en el control de vector vacío son mucho más bajos. Por el contrario, cuando se utiliza un regulador positivo de la muerte celular o un gen pro-muerte, se observa una reducción del mercado en la expresión de Gus en comparación con el control de vector vacío.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que esta técnica se utiliza como paso inicial para determinar el potencial de genes específicos. Es necesario realizar trabajos adicionales para confirmar estos resultados iniciales y determinar el tipo de célula involucrada.