Name: Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a visualizar glicanos fucosilados en embriones de Danio rerio mediante marcado metabólico y química click bioortogonal. Este método permite el etiquetado rápido y no invasivo para estudios de biología del desarrollo.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM093282 a PW; 3U54AI057158-06S1 de RDS) y los fondos de puesta en marcha de Albert Einstein College of Medicine.

1. Recolección de huevos y Dechorionation <ol><li> Recoger y traspasar los huevos de pez cebra a 35 mm placa de Petri, eliminar la mayor cantidad de agua posible y luego agregar 1 mg / ml en el medio de E Pronease embrión E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir el corion. </li><li> Después de 3-5 minutos, combinar el plato en un vaso lleno de peces de agua (60 mg "Ocean instantánea" por litro de H2O destilada), y suavemente la transferencia de los huevos en el vaso y permitir que los huevos se "caen" en el agua. </li><li> Enjuague los huevos con los peces de agua tres veces. La mayoría de los huevos serán liberados de sus corion. </li><li> El uso de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, la transferencia de los huevos dechorionated de agarosa recubiertas placas de Petri llenas de un medio de embriones E3. </li></ol> 2. Microinyección con el PIB-FucAl <ol><li> Prepare los platos después de la inyección del protocolo reportado 7. </li><li> La transferencia de los huevos en platos dechorionated inyección llena con un medio de embriones E3. </li><li> Prepare la aguja, y la carga con 2 l de inyección de solución. Esta solución contiene 20 mM PIB FucAl sintetizado chemoenzymatically 8 y sea Alexa Fluor 594-dextrano (5% w / v) como trazador o rojo fenol del colorante de carga (0,1% w / v) en 0,2 M de KCl. Como control negativo, sustituir el PIB FucAl con GDP-fucosa en solución inyectable. </li><li> Romper la aguja y ajustar la presión de inyección y la duración para producir una caída de 1 nL 9. </li><li> Inyectar los huevos con una latitud norte de cualquiera de las soluciones. </li><li> La transferencia de los huevos en agarosa recubiertas placas de Petri llenas de un medio de embriones E3. </li><li> Incubar los huevos a 28 ° C y retirar los óvulos no fecundados dentro de tres o cuatro horas después de la fecundación. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-reacción catalizada Química Haga clic en <ol><li> Cuando los embriones alcance deseado etapas de desarrollo (por ejemplo, a finales de gástrula, la segmentación del tejido y la larva antes de tiempo), capa de la base de una placa de 96 pocillos con agarosa. </li><li> Agregar 92 l medio embrión E3 a cada pocillo, seguido por la adición de 4 l Alexa Fluor-488 azida (de una población de 2,5 mm de H 2 O), 2 l BTTES-CuSO 4 complejos 6:1, y agitar suavemente para mezclar. </li><li> La transferencia de embriones en el pozo que contiene el reactivo químico, haga clic con el fuego-pulido de vidrio pipeta Pasteur. Cada pocillo debe contener menos de cinco embriones. </li><li> Añadir 2,5 l de ascorbato de sodio recién preparada (a partir de un stock de 100 mM de H 2 O) para iniciar la reacción, haga clic 3. La concentración final de cada reactivo: Alexa Fluor-488 azida: 100 M; CuSO 4: 50 M; BTTES: 300 M; ascorbato de sodio: 2,5 mm. </li><li> Después de 3 minutos, añadir 2 l bathocuproine sulfonato (50 mM de existencias en el H 2 O), un quelante de cobre biocompatible, para detener la reacción y luego se diluye de inmediato con 100 l medio embrión E3. </li><li> La transferencia de los embriones a un plato de Petri de vidrio y lavado de los embriones tratados dos veces con 15 ml de medio embrión E3. </li></ol> 4. Imágenes <ol><li> Coloque una gota de ultra punto de fusión de agarosa (1,2% (w / v) en medio de embrión E3) en un vaso MatTek plato de fondo de micropocillos, y el lugar de un embrión en la caída de agarosa. </li><li> Posición de los embriones dorsal o lateral y colocar el plato en hielo durante 5 min para solidificar la caída de agarosa. Añadir medio embrión E3 suavemente el plato hasta que cubra la baja de agarosa. </li><li> Imágenes de fluorescencia de campo y brillante se adquieren de forma secuencial con un microscopio confocal. Todas las imágenes de embriones se obtienen con un intervalo de paso de 5 micras. Figuras compuestas se preparan utilizando el software ImageJ. </li></ol> 5. Resultados representante La figura 1 muestra el flujo de trabajo de nuestra estrategia de etiquetado de dos pasos. La figura 2 muestra el etiquetado de los embriones de pez cebra a través de BTTES mediada CuAAC a 9,5 horas después de la fecundación (HPF). BTTES es un tris (triazolylmethyl) basado en amina ligando. Acelera CuAAC dramáticamente cuando la coordinación con el generado in situ Cu (I), y promueve la rápida reacción de cicloadición de los sistemas vivos, sin aparente toxicidad. Inmediatamente después de una reacción clic en 3-min, que son capaces de detectar el etiquetado de los embriones robusto del PIB-FucAl tratados (Figura 2, panel izquierdo). Fluorescencia de fondo sólo se detecta para los embriones de control de microinyección con GDP-fucosa (Figura 2, paneles de la derecha). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La estrategia de etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. En imágenes in vivo de los glicanos fucosilados durante la embriogénesis del pez cebra a través de BTTES-Cu (I) catalizada por la química haga clic. Uno de células de embriones de pez cebra etapa son microinyección con una sola dosis del PIB-y se permite que FucAl desarrolloop a 9,5 HPF. Los embriones se hace reaccionar con Alexa Fluor 488-azida catalizada por BTTES-Cu (I). Embriones se reaccionó utilizando imágenes de microscopía confocal. Intensidad máxima de z de proyección de imágenes de fluorescencia de Alexa Fluor 488 (panel superior); campo brillante (panel inferior). Barra de escala: 100 micras. Solución de problemas <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Causa </td><td> Remedio </td></tr><tr><td> Los embriones parece estar enferma </td><td> La solución microinyección contiene contaminantes </td><td> La pureza de los azúcares nucleótidos debe ser superior al 85%. Revise la fuente. </td></tr><tr><td> No hay ninguna etiqueta después de la reacción </td><td> La concentración de cobre es inferior a 30 micras </td><td> Tenga cuidado de no diluir la solución de reacción mediante la adición de un exceso de embriones medio E3 cuando se agregan los embriones, como la velocidad de reacción disminuye significativamente cuando la concentración de cobre es inferior a 30 micras. </td></tr><tr><td> Los embriones mueren después de la reacción </td><td> Un manejo inadecuado de los embriones </td><td> Asegúrese de que la pipeta está pulido al fuego y el recipiente de reacción está recubierta con una capa muy delgada de 0,5% de agarosa. </td></tr><tr><td> Las imágenes parecen irregular </td><td> Los reactivos no están bien mezclados antes de añadir los embriones </td><td> Siga el orden recomendado de la adición de los reactivos, y asegurarse de que los reactivos de química, haga clic hayan sido debidamente mezclado antes de agregar los embriones. </td></tr><tr><td> Las imágenes muestran que los embriones son dañados </td><td> Agitación vigorosa daños a los embriones durante la reacción </td><td> Agite con cuidado por menos de 10 segundos una vez que los embriones se encuentran en la solución. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Imágenes biomoléculas<em&gt; In vivo</em&gt; Proporciona una visión crítica de sus actividades biológicas en sus ambientes nativos. En este vídeo, se demuestra cómo el etiquetado de los glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra se realiza mediante la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-FucAl y una conjugación fluoróforo segundo paso a través de BTTES mediada CuAAC biocompatible<sup&gt; 3</sup&gt;. Etiquetado sólida se puede lograr en 2-3 minutos, y los glicanos marcad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De cobre (II) sulfato pentahidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azida </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextrano, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic ácido </td><td> Acros orgánicos </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Pocillos con fondo de cristal plato </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y química haga clic bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glicanos de imágenes en vivo ha sido recientemente habilitada mediante una estrategia de química reportero bioorthogonal por el tratamiento de las células u organismos con los monosacáridos azida o alquino etiquetados-1, 2. Los monosacáridos modificados, procesados ​​por la maquinaria biosintética de glicanos, se incorporan a glicoconjugados de la superficie celular. Las etiquetas bioorthogonal azida o alquino luego permitir que la conjugación covalente con sondas fluorescentes para la visualización, o con sondas de afinidad para el enriquecimiento y el análisis glycoproteomic. Este protocolo describe los procedimientos que normalmente se utiliza para obtener imágenes no invasivo de los glicanos fucosilados en embriones de pez cebra, incluyendo: 1) la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) El etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra con azida fluoróforos conjugados a través de Cu biocompatible (I) catalizada por azida-alquino cicloadición (CuAAC), y la imagen 3) por microscopía confocal 3. El método descrito aquí puede extenderse fácilmente para visualizar las otras clases de glicanos, por ejemplo, los glicanos que contienen ácido siálico 4 y N-acetilgalactosamina 5, 6, en el pez cebra en desarrollo y en otros organismos vivos.

Un método de hacer clic química base que permite el etiquetado rápido, no invasivo, y robusto de alquino con etiquetas glicanos en embriones de pez cebra se describe. Glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra en la etapa de gastrulación finales fueron estudiados en este estudio.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

La obtención de imágenes de glicanos in vivo ha sido posible recientemente mediante el uso de una estrategia de reportero químico bioortogonal, tratando células u organismos con azida o...

La reciente demostración de imágenes in vivo de glicanos utiliza una estrategia de marcador químico bioortogonal que consiste en tratar células u organismos con monosacáridos marcados con alquino o azida. Los monosacáridos modificados, procesados por la maquinaria biosintética de glicanos, se incorporan a glicocónjugos de la superficie celular que portan marcas bioortogonales de alquino o azida. Estas permiten posteriormente la conjugación covalente con sondas fluorescentes para visualización o con sondas de afinidad para enriquecimiento y análisis glicoproteómico.Este método basado en la química click permite la marcación rápida, no invasiva y robusta de glicanos alquino o azi en embriones de pez cebra y puede extenderse fácilmente para visualizar otras clases de glicanos en organismos en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la detección de glicanos mediante lectinas o anticuerpos, es que puede aplicarse a imágenes dinámicas in vivo. Los métodos de imagen basados en lectinas o anticuerpos solo proporcionan una instantánea de los glicanos en un momento determinado.Son difíciles de implementar en el contexto de estudios dinámicos. Además

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Investigación

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Biology

Biología

Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Este video muestra un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra. Consiste en montar embriones de pez cebra decorionados incrustados en agarosa, inyectar una solución de colorante dirigida a los ligandos DeltaD en los RGP y obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia para la división celular asimétrica que confirme la activación de la señalización Notch/DeltaD.

Un ensayo de captación de anticuerpos para la obtención de imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Se describe una técnica novedosa para la detección de receptores endógenos de baja abundancia presentes en embriones de pez cebra. Lo hemos denominado AFLIP porque consiste en el marcaje de afinidad del receptor por su ligando ligado a la inmunoprecipitación.

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.

Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Aprende a visualizar glicanos fucosilados en embriones de Danio rerio mediante marcado metabólico y química click bioortogonal. Este método permite el etiquetado rápido y no invasivo para estudios de biología del desarrollo.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

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