3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

El objetivo general de este procedimiento es realizar microtomografías de rayos X en 3D de tejidos mineralizados y no mineralizados. Esto se logra extrayendo primero las muestras que se van a examinar, luego inmovilizando y colocando las muestras en el instrumento de micro TC. El tercer paso del procedimiento es establecer los parámetros de adquisición para cada muestra y recopilar las imágenes.

Finalmente, se obtiene una imagen 3D de la muestra a alta resolución a través de un TAC de rayos X. La principal ventaja de esta técnica de nuestras metodologías existentes, como la resonancia magnética, el ultrasonido o la microscopía electrónica, es que proporciona información sobre los volúmenes de garrapatas con una resolución de micras D. Este método puede proporcionar información sobre muchos tejidos biológicos. También se puede utilizar en electrónica, en ciencias de los materiales y en arqueología.

La preparación es diferente para el tejido mineralizado y no mineralizado. Los tejidos mineralizados deben sellarse en recipientes con un ajuste hermético, para que la posición de la muestra no cambie. Mientras se realizan mediciones de alta resolución, la forma del recipiente variará según la morfología del tejido.

Por ejemplo, un fémur de ratón extraído de un embrión de 18,5 D puede caber en la punta de una pipeta. Comience sellando el extremo estrecho de la punta de una pipeta de poliestireno con pegamento similar a la resina epoxi. A continuación, llene la punta con un tampón de trabajo.

En este caso, PBS ahora encaja la pata con el fémur expuesto firmemente en la punta y coloca la punta de la pipeta en un soporte adecuado y sella el otro extremo con el sacrificio de la hoja de película para y perfunde el animal como se describe en el manuscrito adjunto. A continuación, extraiga los pulmones y el corazón manchados y transfiéralos a un tubo de ensayo preparado de 50 mililitros. Coloque los órganos en un pedazo de papel seco.

Coloque las muestras en los tubos de ensayo de medición final en la parte inferior del tubo de ensayo hay un paño humedecedor de etanol. Para crear un ambiente saturado de etanol, la muestra debe encajar firmemente dentro del tubo. Si la muestra está suelta, apriétela con un alambre e inmovilícela cerca de la parte inferior del tubo, justo por encima del paño.

A continuación, pegue o atornille el tubo en un soporte del instrumento y proceda a configurar la imagen. Parámetros de adquisición. Comience colocando el portamuestras en la etapa de rotación del instrumento.

Luego, usando valores seleccionados arbitrariamente para el voltaje y la corriente, tome una imagen de rayos X. Si la imagen es demasiado oscura. Realice los cambios aumentando primero gradualmente el número de fotones.

Esto se hace aumentando progresivamente la corriente. Si la imagen no se ha vuelto más brillante después de aumentar la corriente a 200 microamperios, entonces haga pequeños aumentos progresivos a la energía de los fotones de rayos X aumentando el voltaje. Si la imagen es demasiado brillante, primero, disminuya el voltaje, luego disminuya la corriente hasta que la imagen sea satisfactoria.

Benning también se puede utilizar para aumentar el brillo de la imagen a costa de la resolución. Un valor de entrada de dos hará que la imagen sea aproximadamente cuatro veces más brillante a la mitad de la resolución. Después de configurar el brillo óptimo, optimice el tiempo de exposición de la cámara para comprometer entre el mejor contraste posible con una duración de experimento razonable.

El contraste de la imagen, especialmente para muestras con alta absorción, se puede mejorar mediante el uso de filtros para reducir el flujo de fotones de baja energía. Ahora, elija el aumento de trabajo entre 0,5 x y 40 x y ajuste el campo de visión para abarcar toda la muestra mientras maximiza la resolución. Para aumentar la resolución, coloque la fuente de rayos X más cerca de la muestra.

Para aumentar el campo de visión, coloque el detector más cerca de la muestra. Para la obtención de imágenes 3D, la muestra debe caber dentro del campo de visión en cualquier ángulo de rotación, por lo que el eje de rotación debe estar centrado. Comience girando la muestra a menos 20 grados.

Si el volumen deseado se ha desplazado lateralmente, vuelva a colocar el eje de rotación. Proceda a tomar imágenes en más rotaciones y continúe haciendo correcciones hasta que la muestra sea completamente visible desde menos 90 grados hasta positivos 90 grados, luego proceda con la medición en todos los ángulos entre menos 90 y menos 90 grados. La ejecución de un programa de imágenes puede llevar mucho tiempo, así que planifique en consecuencia.

Por ejemplo, para obtener imágenes de la mayor cantidad de fémur con un aumento de Forex con una resolución de ocho micras se requieren 1000 imágenes de proyección. Esto solo tarda tres horas en completarse. Sin embargo, se necesitan 10 horas para recopilar las 2.500 imágenes de proyección necesarias para visualizar los pulmones de las ratas con un aumento de 0,5x y una resolución de 16 micras.

Para futuras comparaciones de imágenes, es necesario calibrar la imagen tomando imágenes de un maniquí estándar hecho de materiales artificiales que tienen una absorción de rayos X similar al hueso y al agua en las mismas condiciones experimentales. En cuanto a la muestra, después de grabar todas las imágenes de proyección, se reconstruye el volumen completo. Para calibrar la imagen reconstruida a los valores del fantasma, utilice el campo de sabuesos o la escala CT.

Por ejemplo, en el aumento de Forex, el valor similar al agua en el fantasma se establece en cero y el valor similar al hueso se establece en 3000 desde este rango. Todos los demás valores se interpolan o extrapolan. Las imágenes ahora se pueden analizar utilizando cualquier paquete de software que pueda admitir archivos de 20 gigabytes, como la imagen gratuita J o Fiji.

Esta representación de volumen muestra el fémur de un ratón cuatro días después de que se haya iniciado la mineralización ósea, la fracción mineralizada se calculó en un 18% y la densidad mineral ósea se puede comparar con los huesos en otras etapas de desarrollo. Esta representación tomográfica del volumen de los pulmones de una rata desnuda hembra de 12 semanas de edad se resuelve a 16 micras. La tinción pulmonar se utiliza para revelar vasos sanguíneos de 20 micras de diámetro.

En esta sección seriada análisis de los mismos pulmones. Múltiples nódulos cancerosos se pueden ver como formas grises sólidas dentro de las cuatro semanas posteriores a la implantación de las células tumorales. En estos pulmones, los nódulos crecieron hasta cubrir el 17% del volumen de los pulmones.

La mayor parte de la tinción pulmonar se encontró en las áreas periféricas de los tumores. Los vasos sanguíneos también están presentes en el interior de los nódulos, cubriendo alrededor del 3% de su volumen. Una vez dominado, el posicionamiento de la muestra se puede realizar en 15 a 20 minutos si se realiza correctamente.

El tiempo de obtención de imágenes, incluida la reconstrucción automática del volumen, que generalmente no requiere la presencia de una persona operadora, depende de la muestra y puede demorar hasta 50 horas. No olvide que trabajar con agentes fijadores y tintores puede ser extremadamente peligroso. Use siempre guantes de laboratorio y evite respirar los vapores de las muestras.